JP4867354B2

JP4867354B2 - 共焦点顕微鏡

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Publication number: JP4867354B2
Application number: JP2006006931A
Authority: JP
Inventors: 健太御厨; 虹之景
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2006-01-16
Filing date: 2006-01-16
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2026-01-16
Also published as: JP2007187945A

Description

本発明は共焦点顕微鏡に関し、詳しくは、観察試料に対して光刺激を行なう機能を備えた共焦点顕微鏡に関するものである。

共焦点顕微鏡は、レーザ光（以下、画像計測用光ビーム）による試料上の集光点を走査し、試料からの戻り蛍光を結像させて画像を得ることにより試料を観察するもので、生物やバイオテクノロジーなどの分野おける生きた細胞の生理反応観察や形態観察、あるいは半導体市場におけるＬＳＩの表面観察等に使用されている。

図４は、従来の共焦点顕微鏡の一例を示した構成図である。図４において、共焦点スキャナユニット１１０は、顕微鏡ユニット１２０のポート１２２に接続されており、画像計測用光ビーム１１１は、マイクロレンズディスク１１２のマイクロレンズ１１７により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１１３を透過後、ピンホールディスク（以下、ニポウディスク）１１４の個々のピンホール１１６を通過し、顕微鏡ユニット１２０の対物レンズ１２１により、ステージ１２３上の試料１４０に集光される。

この画像計測用光ビーム１１１の照射により、試料１４０が蛍光する。試料１４０から出た戻り蛍光は、再び対物レンズ１２１を通り、ニポウディスク１１４の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した戻り蛍光は、ダイクロイックミラー１１３で反射され、リレーレンズ１１５を介してイメージセンサ１３１に結像される。

このような装置では、図示しないモータでマイクロレンズディスク１１２及びニポウディスク１１４を同軸で一定速度回転させており、この回転によるピンホール１１６の移動により試料１４０上への集光点を走査している。

ニポウディスク１１４のピンホールが並んでいる表面と、試料１４０の被観察面と、イメージセンサ１３１の受光面とは互いに光学的に共役関係に配置されているので、イメージセンサ１３１には、試料１４０の光学的断面像、即ち共焦点画像が結像される。ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡の詳細に関しては、特許文献１に開示されている。

このような共焦点顕微鏡を用いた画像計測では、細胞等の試料など対して光刺激を行ない、時間経過に対する状態変化（フォトアクチベーションやＦＲＡＰ（fluorescence recovery after photobleaching）等）を観察したい要求がある。

フォトアクチベーションとは、例えば細胞の所定の部分に画像計測用光ビーム以外の刺激用光ビームのスポット光を照射し、その部分の蛍光色を変化させてマーキングする。このマーキングが時間経過により、細胞に広がっていく様子を観察するものである。

ＦＲＡＰ（蛍光褪色法）とは、蛍光タンパクを発現した細胞の蛍光を、刺激用光ビームの照射により部分的に褪色させ、細胞における蛍光褪色後のタンパク質の局在変化を観察するものである。

特許文献１には、結像特性を向上し、ピンホール面からの迷光を低減できるようにした共焦点用光スキャナが記載されている。

特開平５−６０９８０号公報

しかしながら、上述の従来のニポウディスク方式の共焦点顕微鏡には、試料に光刺激を与えてその変化を観察する機能を備えたものがない。

本発明は、このような従来の共焦点顕微鏡が有していた問題を解決しようとするものであり、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に光刺激を行なう機能を付加することにより、光刺激や蛍光褪色の反応をリアルタイムで観察可能とすると共に、試料上に集光させる刺激用光ビームのスポットの光軸方向焦点位置を調節することができる共焦点顕微鏡を実現することを目的とするものである。

このような課題を達成するために、本発明の構成は次の通りである。
（１）顕微鏡ユニットとニポウディスク方式の共焦点スキャナユニットから構成され、試料に照射される画像計測用光ビームの戻り蛍光を結像させた共焦点画像により前記試料の観察を行なう共焦点顕微鏡において、
前記試料に刺激を与える刺激用光ビームのスポットを前記試料上に結像させる刺激用光ビーム出力手段と、
前記刺激用光ビームの途中に設けられ、前記スポットの光軸方向焦点位置を調節する焦点調節手段と、
を備え、
前記刺激用光ビーム出力手段及び焦点調節手段は、前記共焦点スキャナユニットに一体に形成されると共に、その光源を前記刺激用光ビーム出力手段内に備えていることを特徴とする共焦点顕微鏡。

（２）前記刺激用光ビーム出力手段は、前記スポットを前記試料上で走査して任意の形状で刺激を与える走査手段を備えることを特徴とする（１）に記載の共焦点顕微鏡。

（３）前記走査手段は、ガルバノミラースキャン機構であることを特徴とすることを特徴とする（２）に記載の共焦点顕微鏡。

以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
（１）光刺激用の刺激用光ビームを照射する機能を備えることによって、フォトアクチベーションやＦＲＡＰが可能となる。この場合、蛍光観察、即ち画像計測は、ニポウディスク式焦点スキャナで行なうことで、高速性（例えば１０００フレーム／秒のスキャンスピード）が実現できるため、光刺激や蛍光褪色に係わる高速反応をリアルタイムで観察することができる。

（２）刺激用光ビームの途中に設けた焦点調節手段により、試料上に集光されるスポットの光軸方向の焦点位置ずれを調節することで、光刺激の効率を常に最大に保持した試料観察が可能となる。

（３）画像処理手段を用いることにより、共焦点画像データから刺激用光ビームによるスポット形状情報を抽出することで、スポットの光軸方向位置が最適となるように焦点調節手段を操作する自動調整が可能となる。

（４）刺激用光ビーム出力手段を、共焦点スキャナユニットと一体に形成することによって、画像計測用光ビームと、刺用光ビームの２つのスキャン機構を一体化でき、一体化により、２つのビームの焦点合わせを簡単にできる。

（５）光刺激用の刺激用光ビームの２次元走査により、試料の形状に合わせた光刺激を可能とし、走査手段としてガルバノミラースキャン機構を用いることで、刺激用光ビームのスポットを高精度で位置決め制御することができる。

以下、本発明を図面により詳細に説明する。図１は本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施形態を示す構成図である。図４で説明した従来の共焦点顕微鏡と同一要素には同一符号を付して説明を省略する。以下、本発明の特徴部につき説明する。

図１において、共焦点スキャナユニット１１０は、顕微鏡ユニット１２０のポート１２２に接続されており、画像計測用光ビーム１１１を試料１４０上に照射する共焦点顕微鏡の構成は、図４に示した従来の共焦点顕微鏡と同一である。

共焦点スキャナユニット１１０に入射した波長λ１の画像計測用光ビーム１１１は、マイクロレンズディスク１１２のマイクロレンズ１１７により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１１３を透過後、ニポウディスク１１４の個々のピンホール１１６を通過し、ポート１２２を通過して顕微鏡ユニット１２０に入り、対物レンズ１２１により、ステージ１２３上の試料１４０に集光される。

この画像計測用光ビーム１１１の照射により、試料１４０が蛍光する。試料１４０からの戻り蛍光は、再び対物レンズ１２１を通り、ニポウディスク１１４の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した戻り蛍光は、ダイクロイックミラー１１３で反射され、リレーレンズ１１５を介してイメージセンサ１３１に共焦点画像として結像される。

共焦点スキャナユニット１１０において、鎖線で示すブロック２００は刺激用光ビーム出力手段であり、試料１４０に刺激を与える刺激用光ビームのスポットを試料１４０上に集光させるために、波長λ２の刺激用光ビームを出力する。

この刺激用光ビーム出力手段２００は、共焦点スキャナユニット１１０と一体に形成されている。画像計測用光ビームの波長λ１と刺激用光ビームの波長λ２との関係は、λ１＞λ２に選定されている。

２０１は、波長λ２の刺激用光ビームを発生する光源である。この光源２０１としては、一般的には外部のレーザ光源より共焦点スキャナユニット１１０に導く構成をとるが、試料に刺激を与える刺激用光ビームは蛍光発生を目的とする画像計測用光ビームのような電力を必要とないので、波長の条件（λ１＞λ２）を満足すれば発光ダイオード（青色発光ダイオード）等の発光素子のビームを利用することが可能である。

光源２０１からの刺激用光ビーム２０２は、コリメータレンズ２０３で平行ビームに変換され、焦点調節用レンズ２０４を介して走査手段を形成するガルバノミラースキャン機構２０８に導かれる。

２０９はダイクロイックミラーであり、画像計測用光ビーム１１１の途中に設けられてこの画像計測用光ビームを透過させると共に、ガルバノミラースキャン機構２０８からの刺激用光ビームを反射させ、２つのビームを合成して試料１４０に照射する。ＳＰは、試料１４０上に集光された刺激用光ビーム２０２によるスポットである。

ガルバノミラースキャン機構２０８は、ＤＣモータにより縦・横方向に回転できる機構になっていて、制御ユニット（図示せず）からの信号によりＤＣモータを制御してガルバノミラーを回転させて試料１４０上のスポットＳＰを任意の位置に位置決め制御できる。このスポットの複数プロットにより、任意形状の刺激範囲を設定することが可能である。

２０５は焦点調節手段であり、刺激用光ビームの途中に挿入された焦点調節用レンズ２０４を光軸方向に移動させて、刺激用光ビーム２０２により試料１４０上に集光されるスポットＳＰの光軸方向の焦点位置を調節する。

画像計測用光ビーム１１１の光軸方向の焦点位置と、刺激用光ビーム２０２によるスポットＳＰの光軸方向の焦点位置とを一致させることにより、次のような効果がある。
（１）光刺激を受けた正しい共焦点画像が得られる。
（２）共焦点スライス面から見た刺激用光ビームによるスポットＳＰの径を小さくし、光刺激箇所をシャープに狙うことができる。
（３）刺激用光ビーム２０２の光パワーを効率よく利用でき、不必要なブリーチングを小さくできる。

オペレータは、イメージセンサ１３１の共焦点画像を観察しながら、手動により焦点調節手段２０５を操作してスポットＳＰの光軸方向の焦点位置を最適位置に調節することができるが、画像処理手段を用いることでこの操作を自動化することが可能である。

２０６は画像処理手段であり、イメージセンサ１３１の共焦点画像データから刺激用光ビーム２０２によるスポットＳＰの形状情報を抽出する。２０７は、画像処理手段２０６からの形状情報を入力する操作手段であり、形状情報に基づいてスポットの焦点位置が最適となるように焦点調節手段２０５に操作信号Ｍを出力する。

図１の実施形態では、試料に刺激を与える刺激用光ビームのスポットＳＰを試料１４０上に集光させるための刺激用光ビーム出力手段２００を、共焦点スキャナユニット１１０と一体に形成することによって、画像計測用光ビーム１１１と、光刺激用ビーム２０２の２つのスキャン機構を一体化でき、２つのビームの焦点合わせが容易にできる。

一体化構造のため、画像計測用光ビーム１１１の途中に、画像計測用光ビームを透過させるダイクロイックミラー２０５を共焦点スキャナユニット内に設けることができる。このダイクロイックミラーで刺激用光ビーム２０２を反射させることにより、共焦点スキャナユニット内でシンプルな光学系により画像計測用光ビーム１１１と刺激用光ビーム２０２を合成することができる。

図２は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施形態を示す構成図である。図１の構成との相違点は、刺激用光ビームの光源２０１として発光ダイオード等の発光素子を用い、この光源を共焦点スキャナユニット１１０の筐体に内臓した点にある。

このような光源内蔵構造をとることにより、刺激用光ビーム出力手段２００全体を共焦点スキャナユニット１１０の筐体内に収容することが可能となり、共焦点顕微鏡の小型・省スペース・コストダウンに貢献することができる。

図３は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の更に他の実施形態を示す構成図である。図１及び図２の構成との相違点は、試料に刺激を与える刺激用光ビームのスポットＳＰを試料１４０上に集光させるための刺激用光ビーム出力手段２００のユニットを、顕微鏡１２０が備える第２のポート１２４に結合させた点にある。

顕微鏡１２０が第２のポート１２４を備える場合には、このポートを利用した接続形態で本発明を実施することができる。この実施形態では、ガルバノミラースキャン機構を持たず、スポットＳＰの位置は試料１４０上の固定位置となる。更にこの実施形態では、刺激用光ビームを反射させるダイクロイックミラー１２５は、顕微鏡１２０の筐体内に形成されている。

発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施形態を示す構成図である。本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施形態を示す構成図である。本発明を適用した共焦点顕微鏡の更に他の実施形態を示す構成図である。従来の共焦点顕微鏡の一例を示した構成図である。

符号の説明

１１０共焦点スキャナユニット
１１１画像計測用光ビーム
１１２マイクロレンズディスク
１１３ダイクロイックミラー
１１４ニポウディスク
１１５リレーレンズ
１１６ピンホール
１１７マイクロレンズ
１２０顕微鏡ユニット
１２１対物レンズ
１２２ポート
１２３ステージ
１３１イメージセンサ
１４０試料
２００刺激用光ビーム出力手段
２０１光源
２０２刺激用光ビーム
２０３コリメータレンズ
２０４焦点調節用レンズ
２０５焦点調節手段
２０６画像処理手段
２０７操作手段
２０８ガルバノミラースキャン機構
２０９ダイクロイックミラー

Claims

顕微鏡ユニットとニポウディスク方式の共焦点スキャナユニットから構成され、試料に照射される画像計測用光ビームの戻り蛍光を結像させた共焦点画像により前記試料の観察を行なう共焦点顕微鏡において、
前記試料に刺激を与える刺激用光ビームのスポットを前記試料上に結像させる刺激用光ビーム出力手段と、
前記刺激用光ビームの途中に設けられ、前記スポットの光軸方向焦点位置を調節する焦点調節手段と、
を備え、
前記刺激用光ビーム出力手段及び焦点調節手段は、前記共焦点スキャナユニットに一体に形成されると共に、その光源を前記刺激用光ビーム出力手段内に備えていることを特徴とする共焦点顕微鏡。
前記刺激用光ビーム出力手段は、前記スポットを前記試料上で走査して任意の形状で刺激を与える走査手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
前記走査手段は、ガルバノミラースキャン機構であることを特徴とすることを特徴とする請求項２に記載の共焦点顕微鏡。