JP7307027B2 - 観察装置および観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、観察装置および観察方法に関するものである。

例えば細胞等の透明な観察対象物は通常の顕微鏡により観察することが困難であることから、一般に定量位相顕微鏡等の観察対象物の位相画像を取得することができる観察装置が用いられる。このような観察装置には幾つかの実現方法が知られている。

従来技術の一つ（以下「従来技術１」という。）は、２光束の分岐および合波を行うマイケルソン干渉計またはマッハツェンダ干渉計を用い、２光束のうちの一方の光路上に観察対象物を配置する。そして、この従来技術１では、光路上のミラー等を移動させることで２光束の間の光路長差（位相差）を各値に順次に設定して、観察対象物の複数の干渉画像を取得し、これら複数の干渉画像に基づいて位相画像を作成する。

特許文献１に記載されている観察装置（以下「従来技術２」という。）は、微分干渉顕微鏡を応用したものである。この従来技術２では、光源から出力され第１偏光子を経た直線偏光の光を第１プリズムにより互いに直交した振動面を持ちかつわずかに光路をずらせた二つの直線偏光の光に分離し、観察対象物を経た後のこれら二つの直線偏光の光を第２プリズムにより合波して第２偏光子を通過させることで干渉させ、その干渉画像を取得する。二つの光の間の位相差を第２プリズムと第２偏光子との間に置かれた空間光変調器により各値に順次に設定して、複数の干渉画像を取得する。そして、これら複数の干渉画像に基づいて位相微分画像を作成し、この位相微分画像に基づいて位相画像を作成する。

非特許文献１に記載されている観察装置（以下「従来技術３」という。）も、微分干渉顕微鏡を応用したものである。この従来技術３では、市販の微分干渉顕微鏡のカメラポートに偏光カメラを取り付けて、この偏光カメラにより複数の干渉画像を同時に取得する。そして、これら複数の干渉画像に基づいて位相微分画像を作成し、この位相微分画像に基づいて位相画像を作成する。

また、これらの観察装置は、観察対象物の位相画像だけでなく振幅画像をも取得することができ、また、複素振幅画像を取得することができる。

米国特許第１０１３２６０９号明細書

Shibata S, Takano W, Hagen N,Matsuda M, Otani Y. "Video-rate quantitative phase analysis by a DICmicroscope using a polarization camera," Biomed. Opt. Express. 2019. 10:1273-1281.

従来技術１は、定量性に優れた位相画像を得ることができる。しかし、従来技術１は、２光束の分岐および合波を行うマイケルソン干渉計またはマッハツェンダ干渉計を用いることから、光学系の調整が容易でなく、耐振動性が悪い。また、従来技術１は、２光束の間の光路長差（位相差）を各値に順次に設定して複数の干渉画像を取得することから、これら複数の干渉画像を取得するのに時間を要する。

従来技術２は、光学系調整および耐振動性の問題点を解消し得る。しかし、従来技術２は、２光束の間の光路長差（位相差）を各値に順次に設定して複数の干渉画像を取得することから、これら複数の干渉画像を取得するのに時間を要する。

従来技術３は、光学系調整および耐振動性の問題点を解消し得るものであり、また、干渉画像取得時間の問題点をも解消し得る。しかし、従来技術３は、正確な位相微分画像を得ることができず、それ故、位相変化が小さいという仮定の近似条件の下に位相微分画像に基づいて所要の処理を行って位相画像を作成する。したがって、得られる位相画像は定量性が悪い。

本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、光学系の調整が容易で定量性が改善された複素振幅画像を短時間に得ることができる観察装置および観察方法を提供することを目的とする。

本発明の観察装置は、(1) 空間的にインコヒーレントな光を出力する光源と、(2) 光源から出力された光を観察対象物に集光照射する照射光学系と、(3) 照射光学系の光路上に設けられ、光源から出力された光を入力して、直線偏光の光を出力する偏光子と、(4) 照射光学系の光路上であって偏光子と観察対象物との間に設けられ、偏光子から出力された光を入力して、互いに直交する二つの直線偏光の光を出力する第１プリズムと、(5) 照射光学系による観察対象物への光の照射に応じて観察対象物で生じた光を入力して結像する結像光学系と、(6) 結像光学系の光路上に設けられ、観察対象物から出力された二つの光を合波して出力する第２プリズムと、(7) 結像光学系の光路上であって第２プリズムより後段に設けられ、第２プリズムから出力された光を入力して、互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を出力する偏光変換素子と、(8) 結像光学系により像が形成される位置に配置された撮像面を有し、偏光変換素子から出力された互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を入力して、３以上の偏光成分それぞれについて撮像面上の干渉画像を取得する偏光カメラと、(9)偏光カメラにより取得された３以上の偏光成分それぞれについての干渉画像に基づいて観察対象物の複素振幅画像を作成する解析部と、を備える。

本発明の観察装置の一側面において、偏光変換素子は１／４波長板であるのが好適である。結像光学系において第２プリズムおよび偏光変換素子を除く光学素子で生じる偏光変換を低減する偏光変換補償用光学素子を更に備えるのが好適である。偏光変換補償用光学素子は、結像光学系に設けられている誘電体多層膜ミラーの反射特性を補償するミラー、または、波長板であるのが好適である。また、結像光学系は、ミラーを有するリレー光学系を含み、偏光変換補償用光学素子は、リレー光学系を構成するミラーであるのが好適である。結像光学系はリレー光学系を含み、偏光変換素子はリレー光学系の光路上に設けられているのが好適である。

本発明の観察装置の一側面において、偏光カメラは、撮像面において複数の画素が２次元配列された構造を有し、２次元の干渉画像を取得するのが好適である。偏光カメラは、撮像面において複数の画素が１次元配列された構造を有し、１次元の干渉画像を取得するのも好適である。この場合、偏光カメラの撮像面における複数の画素の配列方向と異なる方向に観察対象物を相対的に移動させることで、観察対象物の２次元の干渉画像を取得するのが好適である。

本発明の観察装置の一側面において、結像光学系を構成する光学素子または観察対象物を結像光学系の光軸に平行な方向に移動させる移動部を更に備え、偏光カメラは、移動部による移動の各位置において干渉画像を取得し、解析部は、各位置において偏光カメラにより取得された干渉画像に基づいて観察対象物の３次元複素振幅画像を作成するのが好適である。

本発明の光学モジュールは、微分干渉顕微鏡のカメラポートに対して着脱が自在である光学モジュールであって、(1) 微分干渉顕微鏡に置かれた観察対象物で生じた光を入力して結像する結像光学系の一部を構成し、微分干渉顕微鏡の第２プリズムからカメラポートを経て出力される光を入力するリレー光学系と、(2) リレー光学系の光路上に設けられ、光を入力し、互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を出力する偏光変換素子と、(3) リレー光学系により像が形成される位置に配置された撮像面を有し、偏光変換素子から出力された互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を入力し、３以上の偏光成分それぞれについて撮像面上の干渉画像を取得する偏光カメラと、を備える。

本発明の光学モジュールの一側面において、偏光変換素子は１／４波長板であるのが好適である。結像光学系において第２プリズムおよび偏光変換素子を除く光学素子で生じる偏光変換を低減する偏光変換補償用光学素子を更に備えるのが好適である。偏光変換補償用光学素子は、結像光学系に設けられている誘電体多層膜ミラーの反射特性を補償するミラー、または、波長板であるのが好適である。偏光カメラは、撮像面において複数の画素が２次元配列された構造を有し、２次元の干渉画像を取得するのが好適である。偏光カメラは、撮像面において複数の画素が１次元配列された構造を有し、１次元の干渉画像を取得するのも好適である。

本発明の観察方法は、(1) 空間的にインコヒーレントな光を光源から出力し、(2) 光源から出力された光を観察対象物に集光照射する照射光学系の光路上に設けられた偏光子により、光源から出力された光を入力して、直線偏光の光を出力し、(3) 照射光学系の光路上であって偏光子と観察対象物との間に設けられた第１プリズムにより、偏光子から出力された光を入力して、互いに直交する二つの直線偏光の光を出力し、(4) 照射光学系による観察対象物への光の照射に応じて観察対象物で生じた光を入力して結像する結像光学系の光路上に設けられた第２プリズムにより、観察対象物から出力された二つの光を合波して出力し、(5) 結像光学系の光路上であって第２プリズムより後段に設けられた偏光変換素子により、第２プリズムから出力された光を入力して、互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光に変換して出力し、(6) 結像光学系により像が形成される位置に配置された撮像面を有する偏光カメラにより、偏光変換素子から出力された互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を入力して、３以上の偏光成分それぞれについて撮像面上の干渉画像を取得し、(7) 偏光カメラにより取得された３以上の偏光成分それぞれについての干渉画像に基づいて観察対象物の複素振幅画像を作成する。

本発明の観察方法の一側面において、偏光変換素子は１／４波長板であるのが好適である。結像光学系において第２プリズムおよび偏光変換素子を除く光学素子で生じる偏光変換を偏光変換補償用光学素子により低減するのが好適である。偏光変換補償用光学素子は、結像光学系に設けられている誘電体多層膜ミラーの反射特性を補償するミラー、または、波長板であるのが好適である。結像光学系は、ミラーを有するリレー光学系を含み、偏光変換補償用光学素子は、リレー光学系を構成するミラーであるのが好適である。結像光学系はリレー光学系を含み、偏光変換素子はリレー光学系の光路上に設けられているのが好適である。

本発明の観察方法の一側面において、偏光カメラは、撮像面において複数の画素が２次元配列された構造を有し、２次元の干渉画像を取得するのが好適である。偏光カメラは、撮像面において複数の画素が１次元配列された構造を有し、１次元の干渉画像を取得するのも好適である。この場合、偏光カメラの撮像面における複数の画素の配列方向と異なる方向に観察対象物を相対的に移動させることで、観察対象物の２次元の干渉画像を取得するのが好適である。

本発明の観察方法の一側面において、結像光学系を構成する光学素子または観察対象物を結像光学系の光軸に平行な方向に移動させ、偏光カメラにより各位置において干渉画像を取得し、各位置において偏光カメラにより取得された干渉画像に基づいて観察対象物の３次元複素振幅画像を作成するのが好適である。

本発明によれば、光学系の調整が容易であり、定量性が改善された複素振幅画像を短時間に得ることができる。

図１は、第１実施形態の観察装置１Ａの構成を示す図である。 図２は、偏光カメラ２６のイメージセンサの構成例を示す図である。 図３は、偏光カメラ２６のイメージセンサの他の構成例を示す図である。 図４は、第２実施形態の観察装置１Ｂの構成を示す図である。 図５は、第３実施形態の観察装置１Ｃの構成を示す図である。 図６は、第４実施形態の観察装置１Ｄの構成を示す図である。 図７は、第５実施形態の観察装置１Ｅの構成を示す図である。 図８は、第６実施形態の観察装置１Ｆの構成を示す図である。 図９は、二つのミラーＭ１，Ｍ２を用いた偏光変換の低減について説明する図である。 図１０は、第７実施形態の観察装置１Ｇの構成を示す図である。 図１１は、実施例で得られた位相微分画像である。 図１２は、位相微分画像（図１１）から作成された位相画像である。 図１３は、深さ方向の各位置で取得された位相画像（図１２）から作成された３次元屈折率分布画像である。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

図１は、第１実施形態の観察装置１Ａの構成を示す図である。観察装置１Ａは、光源１１、レンズ１２、偏光子１３、第１プリズム１４、コンデンサレンズ１５、対物レンズ２１、第２プリズム２２、１／４波長板２３、レンズ２４、偏光カメラ２６および解析部４０を備える。観察装置１Ａにおいて、光源１１、レンズ１２、偏光子１３、第１プリズム１４、コンデンサレンズ１５、対物レンズ２１、第２プリズム２２、１／４波長板２３、レンズ２４および偏光カメラ２６は、光学的にカップリングされている。

光源１１から出力された光を観察対象物Ｓに集光照射する照射光学系の光路上に、順に、レンズ１２、偏光子１３、第１プリズム１４およびコンデンサレンズ１５が設けられている。また、照射光学系による観察対象物Ｓへの光の照射に応じて観察対象物Ｓで生じた光を入力して偏光カメラ２６の撮像面上に結像する結像光学系の光路上に、順に、対物レンズ２１、第２プリズム２２、１／４波長板２３およびレンズ２４が設けられている。

光源１１は、空間的にインコヒーレントな光を出力する。光源１１から出力される光は、時間的にコヒーレントであってもよいし、時間的にインコヒーレントであってもよい。光源１１から出力される光は、直線偏光であってもよいし、無偏光であってもよい。光源１１は、例えばハロゲンランプ、発光ダイオードまたはレーザダイオードを含み、さらに、その後段に拡散板を含むのも好適である。

レンズ１２は、光源１１と光学的に接続されている。レンズ１２は、光源１１から出力された光をコリメートして偏光子１３へ出力する。

偏光子１３は、レンズ１２と光学的に接続されている。偏光子１３は、レンズ１２によりコリメートされて出力された光を入力し、その偏光子１３の光学軸の方位に応じた偏光面（振動面）を有する直線偏光の光を第１プリズム１４へ出力する。

第１プリズム１４は、偏光子１３と光学的に接続されている。第１プリズム１４は、偏光子１３から出力された直線偏光の光を入力し、互いに直交する二つの直線偏光の光を互いに異なる方向へ出力する。第１プリズム１４から出力される互いに直交する二つの直線偏光の光それぞれの偏光面は、偏光子１３から第１プリズム１４に入力される直線偏光の光の偏光面に対して４５°だけ傾いている。

コンデンサレンズ１５は、第１プリズム１４と光学的に接続されている。コンデンサレンズ１５は、第１プリズム１４から出力される互いに直交する二つの直線偏光の光を観察対象物Ｓに集光照射する。第１プリズム１４から出力された互いに直交する二つの直線偏光の光は、第１プリズム１４から出力された後に互いに異なる方向へ進むので、コンデンサレンズ１５による観察対象物Ｓ上の集光位置は僅かに異なる。

対物レンズ２１は、照射光学系による観察対象物Ｓへの光の照射に応じて観察対象物Ｓから出力された互いに直交する二つの直線偏光の光を入力し、これらの光をコリメートして第２プリズム２２へ出力する。

第２プリズム２２は、対物レンズ２１と光学的に接続されている。第２プリズム２２は、対物レンズ２１によりコリメートされて出力された互いに直交する二つの直線偏光の光を入力し、第１プリズム１４でずらした光路におけるこれらの光を合波して１／４波長板２３へ出力する。

１／４波長板２３は、第２プリズム２２と光学的に接続されている偏光変換素子である。１／４波長板２３は、第２プリズム２２から出力された光を入力し、互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を出力する。光源１１から出力される光が時間的にインコヒーレントである場合には、１／４波長板２３は、波長依存性が少ないアクロマティック波長板等が望ましい。

レンズ２４は、１／４波長板２３と光学的に接続されている。レンズ２４は、１／４波長板２３から出力された互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を入力し、偏光カメラ２６の撮像面上に結像する。

偏光カメラ２６は、レンズ２４と光学的に接続されている、偏光カメラ２６は、結像光学系により像が形成される位置に配置された撮像面を有する。偏光カメラ２６は、１／４波長板２３により互いに異なる回転方向の円偏光とされた二つの光を入力し、３以上の偏光成分それぞれについて撮像面上の干渉画像を取得する。なお、本発明における円偏光は、互いに直交する２方向の電場ベクトルの間で位相差が±π／２［ｒａｄ］かつ振幅が等しい場合のみに限定されず、楕円偏光も含む。

解析部４０は、偏光カメラ２６により取得された３以上の偏光成分それぞれについての干渉画像に基づいて観察対象物Ｓの複素振幅画像（振幅画像および位相画像）を作成する。解析部４０は、例えばコンピュータである。解析部４０は、複素振幅画像の作成等の演算処理を行うＣＰＵを含む演算部と、干渉画像および複素振幅画像等を記憶するハードディスクドライブ、ＲＡＭおよびＲＯＭ等を含む記憶部と、干渉画像および複素振幅画像等を表示する液晶ディスプレイを含む表示部と、干渉画像の取得および画像の表示の際の諸条件の入力を受け付けるキーボードおよびマウス等を含む入力部とを備える。解析部４０は、タッチパネル等を入力部として備えるタブレット端末等のスマートデバイスによって構成されてもよい。また、解析部４０の演算部や記憶部は、ＦＰＧＡ（field-programmablegate array）やマイコンによって構成されていてもよい。

光源１１から偏光カメラ２６までの構成は、通常の微分干渉顕微鏡の構成において第２プリズム２２より後段に設けられる検光子を取り除き、１／４波長板２３および偏光カメラ２６を設けた構成に相当する。第１プリズム１４および第２プリズム２２は、通常の微分干渉顕微鏡において用いられるウォラストンプリズム（Wollaston prism）であってもよいしノマルスキープリズム（Nomarski prism）であってもよい。

図２は、偏光カメラ２６のイメージセンサの構成例を示す図である。この図に示されるイメージセンサ２６Ａは、撮像面において複数の画素が２次元配列された構造を有し、２次元の干渉画像を取得することができる。イメージセンサ２６Ａは、半導体基板上に形成されたフォトダイオードアレイ２６１と、そのフォトダイオードアレイ上に設けられた偏光子アレイ２６２と、その偏光子アレイ上に設けられたレンズアレイ２６３とを備え、これらが積層された構造を有する。フォトダイオードアレイ２６１において複数のフォトダイオードが２次元配列されている。フォトダイオードアレイ２６１の各フォトダイオードに対して、偏光子アレイ２６２の１つの偏光子が対応して設けられ、レンズアレイ２６３の１つのレンズが対応して設けられている。

偏光子アレイ２６２の各偏光子は、４つの方位（０°、４５°、９０°、１３５°）のうちの何れかの方位に光学軸を有する。この図において、偏光子アレイ２６２の各偏光子のハッチングの方位は、該偏光子の光学軸の方位を示している。このイメージセンサ２６Ａを用いれば、４つの方位の直線偏光の２次元像を同時に撮像することができる。ソニー株式会社により商品化されているイメージセンサ（Polarsens（登録商標））は、この図に示される構成を有する。また、TeledyneDALSA社により商品化されているイメージセンサ（Area Scan Polarization Sensor）も、この図に示される構成を有する。

図３は、偏光カメラ２６のイメージセンサの他の構成例を示す図である。この図に示されるイメージセンサ２６Ｂは、撮像面において複数の画素が１次元配列された構造を有し、１次元の干渉画像を取得することができる。イメージセンサ２６Ｂは、半導体基板上に形成されたフォトダイオードアレイ２６４ａ～２６４ｄと、フォトダイオードアレイ２６４ａ～２６４ｃ上に設けられた偏光子２６５ａ～２６５ｃとを備える。フォトダイオードアレイ２６４ｄ上には偏光子は設けられていない。フォトダイオードアレイ２６４ａ～２６４ｄそれぞれにおいて、複数のフォトダイオードがｘ方向に１次元配列されている。フォトダイオードアレイ２６４ａ～２６４ｄはｙ方向に並列配置されている。

フォトダイオードアレイ２６４ａ上の偏光子２６５ａの光学軸の方位は０°であり、フォトダイオードアレイ２６４ｂ上の偏光子２６５ｂの光学軸の方位は１３５であり、フォトダイオードアレイ２６４ｃ上の偏光子２６５ｃの光学軸の方位は９０°である。この図において、各偏光子のハッチングの方位は、該偏光子の光学軸の方位を示している。このイメージセンサ２６Ｂを用いれば、３つの方位の直線偏光の１次元像を同時に撮像することができる。また、ｘ方向と異なる方向（例えばｙ方向）に観察対象物Ｓを相対的に移動させることで、３つの方位の直線偏光の２次元像を同時に取得することができる。例えばフローサイトメトリのように透明管内を流体とともに移動する細胞を観察対象物Ｓとすることができる。Teledyne DALSA社により商品化されているイメージセンサ（Line ScanPolarization Sensor）は、この図に示される構成を有する。

次に、観察装置１Ａを用いて観察対象物Ｓの複素振幅画像を取得する方法について説明する。

光源１１から出力された空間的にインコヒーレントな光は、レンズ１２によりコリメートされ、偏光子１３の光学軸の方位に応じた偏光面を有する直線偏光の光とされて、第１プリズム１４に入力される。偏光子１３から第１プリズム１４に直線偏光の光が入力されると、第１プリズム１４から互いに直交する二つの直線偏光の光が互いに異なる方向へ出力され、これらはコンデンサレンズ１５により観察対象物Ｓに集光照射される。

観察対象物Ｓへの光の照射に応じて観察対象物Ｓから出力された互いに直交する二つの直線偏光の光は、対物レンズ２１によりコリメートされて第２プリズム２２に入力される。この第２プリズム２２により、第１プリズム１４でずらした光路は合波され、１／４波長板２３により、互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光に変換される。１／４波長板２３から出力された互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光は、レンズ２４により偏光カメラ２６の撮像面上に結像される。偏光カメラ２６により、１／４波長板２３により互いに異なる回転方向の円偏光とされた二つの光が入力されると、３以上の偏光成分それぞれについて撮像面上の干渉画像（すなわち、位相差が異なる３以上の干渉画像）が取得される。そして、解析部４０により、偏光カメラ２６により取得された３以上の干渉画像に基づいて観察対象物Ｓの複素振幅画像が作成される。

次に、本実施形態の観察装置１Ａまたは観察方法により観察対象物Ｓの複素振幅画像を取得できることについて詳細に説明する。以下では、説明を簡易にするために、光源１１が空間的にコヒーレントな光を出力するものとする。また、偏光カメラ２６は、図２に示されるような位相差が９０°ずつ異なる４つの干渉画像を取得することができるものとする。

光の各偏光状態のうち水平偏光を表すベクトルをｅ_Ｈとし、垂直偏光を表すベクトルをｅ_Ｖとし、４５°偏光を表すベクトルをｅ_Ｄとし、１３５°偏光を表すベクトルをｅ_Ａとし、右回り円偏光を表すベクトルをｅ_Ｒとし、左回り円偏光を表すベクトルをｅ_Ｌとする。これらのベクトルの間には下記（１）～（４）式の関係がある。ｉは虚数単位である。

円偏光の光を偏光子に入力させたときに該偏光子から出力される光の位相は、その出力光の偏光状態のベクトル（ｅ_Ｈ，ｅ_Ｖ，ｅ_Ｄ，ｅ_Ａの何れか）と入力光の偏光状態のベクトル（ｅ_Ｒ，ｅ_Ｌの何れか）との内積で表される。２つのベクトル間の内積については下記（５）～（１２）式が成り立つ。これらの関係を用いることで、各位相シフト量に対応する干渉画像を取得することができる。

ｅ_Ｈ・ｅ_Ｒとｅ_Ｈ・ｅ_Ｌとは同位相であるから、互いに回転方向が異なる２つの円偏光の光が偏光子により水平偏光に射影されると、偏光子から出力される２つの光は同位相となる。ｅ_Ｖ・ｅ_Ｒとｅ_Ｖ・ｅ_Ｌとは逆位相であるから、互いに回転方向が異なる２つの円偏光の光が偏光子により垂直偏光に射影されると、偏光子から出力される２つの光の間の位相差は１８０°となる。

ｅ_Ｄ・ｅ_Ｒとｅ_Ｄ・ｅ_Ｌとは位相が９０°異なっているから、互いに回転方向が異なる２つの円偏光の光が偏光子により４５°偏光に射影されると、偏光子から出力される２つの光の間の位相差は９０°となる。ｅ_Ａ・ｅ_Ｒとｅ_Ａ・ｅ_Ｌとは位相が２７０°異なっているから、互いに回転方向が異なる２つの円偏光の光が偏光子により１３５°偏光に射影されると、偏光子から出力される２つの光の間の位相差は２７０°となる。

測定したい光の電場をＵ(ｒ)とすると、偏光カメラ２６に入力される光の波面は下記（１３）式で表される。ｒは位置を表す変数である。この式の第１項の変数がｒであるのに対して第２項の変数がｒ＋δｒであるのは、コンデンサレンズ１５による観察対象物Ｓ上への集光照射の際に、互いに直交する二つの直線偏光の光の集光領域が僅かに異なっていることによるものである。

これらの式から、偏光カメラ２６により得られる干渉画像Ｉ_θｎは下記（１４）式および（１５）式で表される。θ_ｎは、偏光カメラ２６の４種類の偏光子の光学軸の方位を表し、０°、４５°、９０°、１３５°の各値である。φ_ｎは、互いに回転方向が異なる２つの円偏光の光が偏光子を経た後の位相差を表し、０、π／２、π、３π／２の各値である。θ_ｎとφ_ｎとの間には１対１の対応関係がある。この（１４）式から、下記（１６）式が得られる。

この（１６）式の絶対値は振幅画像を表している。（１６）式の位相は、波面を空間的に位相微分した位相微分画像を表している。この位相微分画像から位相画像を再構成するためには、基本的には微分方向に対して積分を行えばよい。これらの振幅画像および位相画像から複素振幅画像を得ることができる。

以上のように、本実施形態では、二光束が同軸で伝搬するので、光学系の調整が容易であり、光路長安定化などの機構が不要となって耐振動性が優れる。本実施形態では、二光束の間の位相差を各値に設定した観察対象物の干渉画像を同時に（シングルショットで）取得することができるので、これら複数の干渉画像を取得するのに要する時間が短いため、従来技術２より優れる。また、従来技術３と比べて、本実施形態で得られる位相画像の定量性が優れる。

次に、他の実施形態の構成について説明する。なお、図１に示された観察装置１Ａの構成と同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。これらは、図１に示された第１実施形態の観察装置１Ａと同様の効果を奏する。

図４は、第２実施形態の観察装置１Ｂの構成を示す図である。第１実施形態の観察装置１Ａ（図１）と比較すると、第２実施形態の観察装置１Ｂ（図４）は、１／４波長板２３が設けられている位置の点で相違する。本実施形態では、１／４波長板２３は、レンズ２４と偏光カメラ２６との間に設けられている。１／４波長板２３は、第２プリズム２２と偏光カメラ２６との間の任意の位置に設けられてよいが、収差の影響を低減する上では、光がコリメータされている位置に設けられている第１実施形態の観察装置１Ａの構成の方が好ましい。

図５は、第３実施形態の観察装置１Ｃの構成を示す図である。第１実施形態の観察装置１Ａ（図１）と比較すると、第３実施形態の観察装置１Ｃ（図５）は、第２プリズム２２と１／４波長板２３との間に波長板２５が設けられている点で相違する。

図６は、第４実施形態の観察装置１Ｄの構成を示す図である。第２実施形態の観察装置１Ｂ（図４）と比較すると、第４実施形態の観察装置１Ｄ（図６）は、第２プリズム２２と１／４波長板２３との間に波長板２５が設けられている点で相違する。

第３実施形態の観察装置１Ｃ（図５）および第４実施形態の観察装置１Ｄ（図６）それぞれにおいて設けられた波長板２５は、結像光学系において第２プリズム２２および１／４波長板２３を除く光学素子で生じる偏光変換を低減する偏光変換補償用光学素子である。偏光変換補償用光学素子としての波長板２５は、例えば、１／４波長板と１／２波長板とを組み合わせた構成、バビネソレイユ補償板またはベレーク補償板などである。偏光変換補償用光学素子を設けることにより、より正確な複素振幅画像を得ることができる。

図７は、第５実施形態の観察装置１Ｅの構成を示す図である。第１実施形態の観察装置１Ａ（図１）と比較すると、第５実施形態の観察装置１Ｅ（図７）は、観察対象物Ｓから偏光カメラ３５までの結像光学系の構成の点で相違する。本実施形態では、結像光学系の光路上に、順に、対物レンズ２１、第２プリズム２２、レンズ２４、ミラー２７、レンズ３１、波長板（偏光変換補償用光学素子）３２、１／４波長板（偏光変換素子）３３、レンズ３４および偏光カメラ３５が設けられている。

対物レンズ２１は、照射光学系による観察対象物Ｓへの光の照射に応じて観察対象物Ｓから出力された互いに直交する二つの直線偏光の光を入力し、これらの光をコリメートして第２プリズム２２へ出力する。

第２プリズム２２は、対物レンズ２１と光学的に接続されている。第２プリズム２２は、対物レンズ２１によりコリメートされて出力された互いに直交する二つの直線偏光の光を入力し、第１プリズム１４でずらした光路におけるこれらの光を合波してレンズ２４へ出力する。

レンズ２４は、第２プリズム２２と光学系に接続されている。レンズ２４は、第２プリズム２２から出力された光を入力し、その光を収斂させてミラー２７へ出力する。

ミラー２７は、レンズ２４と光学的に接続されている。ミラー２７は、レンズ２４から出力された光をレンズ３１へ反射させる。

レンズ３１は、ミラー２７と光学的に接続されている。レンズ３１は、レンズ２４から出力されミラー２７により反射された光を入力し、その光をコリメートして波長板３２へ出力する。レンズ２４とレンズ３１との間に像面がある。

波長板３２は、レンズ３１と光学的に接続されている。波長板３２は、結像光学系において第２プリズム２２および１／４波長板３３を除く光学素子で生じる偏光変換を低減する偏光変換補償用光学素子である。

１／４波長板３３は、波長板３２と光学的に接続されている、１／４波長板３３は、波長板３２から出力された光を入力し、互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を出力する。

レンズ３４は、１／４波長板３３と光学的に接続されている。レンズ３４は、１／４波長板３３から出力された互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を入力し、偏光カメラ３５の撮像面上に結像する。レンズ３１およびレンズ３４はリレー光学系を構成している。

偏光カメラ３５は、レンズ３４と光学的に接続されている。偏光カメラ３５は、結像光学系により像が形成される位置に配置された撮像面を有する。偏光カメラ３５は、１／４波長板３３により互いに異なる回転方向の円偏光とされた二つの光を入力し、３以上の偏光成分それぞれについて撮像面上の干渉画像を取得する。偏光カメラ３５は、図２および図３で説明した偏光カメラ２６の構成と同じ構成とすることができる。

本実施形態の構成のうち、光源１１からミラー２７までの構成は、市販の微分干渉顕微鏡を用いることができる。また、レンズ３１、波長板３２、１／４波長板３３、レンズ３４よび偏光カメラ３５をモジュール化して、微分干渉顕微鏡のカメラポートに対して着脱が自在である光学モジュール３０Ｅとすることができる。市販の微分干渉顕微鏡のカメラポートに光学モジュール３０Ｅを取り付けることで、本実施形態の観察装置１Ｅを安価に構成することができる。

図８は、第６実施形態の観察装置１Ｆの構成を示す図である。第５実施形態の観察装置１Ｅ（図７）と比較すると、第６実施形態の観察装置１Ｆ（図８）は、光学モジュール３０Ｅに替えて光学モジュール３０Ｆを備える点で相違する。第５実施形態における光学モジュール３０Ｅと比較すると、第６実施形態における光学モジュール３０Ｆは、波長板（偏光変換補償用光学素子）３２が設けられていない点で相違し、ミラー３６～３８が設けられている点で相違する。

ミラー３６およびミラー３７は、レンズ３１と１／４波長板３３との間に設けられている。ミラー３６は、レンズ３１から到達した光をミラー３７へ反射させる。ミラー３７は、ミラー３６から到達した光を１／４波長板３３へ反射させる。ミラー３８は、レンズ３４と偏光カメラ３５との間に設けられている。ミラー３８は、レンズ３４から到達した光を偏光カメラ３５の撮像面へ反射させる。

ミラー３６～３８は、単に光を反射させるために設けられてもよいが、結像光学系において第２プリズム２２および１／４波長板３３を除く光学素子で生じる偏光変換を低減する偏光変換補償用光学素子として設けられるのが好適である。多くの場合に用いられる誘電体多層膜ミラーは、光を反射させる際に偏光変換を生じさせる。しかし、図９に示されるように、この偏光変換を補償する特性（例えば、同じ反射特性）を有する二つの誘電体多層膜ミラーＭ１，Ｍ２を用いて、ミラーＭ１，Ｍ２それぞれへの光の入射角を互いに等しくし、ミラーＭ１に入射する光のうちのｐ偏光成分がミラーＭ２に入射する際にはｓ偏光となるようにするとともに、ミラーＭ１に入射する光のうちのｓ偏光成分がミラーＭ２に入射する際にはｐ偏光となるようにする。これにより、二つのミラーＭ１，Ｍ２それぞれが光を反射させる際に生じる偏光変換が相殺され、全体として偏光変換を低減することができる。本実施形態では、四つのミラー２７，３６～３８がこのような関係を有することで、全体として偏光変換を低減することができる。

図１０は、第７実施形態の観察装置１Ｇの構成を示す図である。第６実施形態の観察装置１Ｆ（図８）と比較すると、第７実施形態の観察装置１Ｇ（図１０）は、移動部２８を更に備える点で相違する。偏光カメラ３５は、移動部２８による移動の各位置において干渉画像を取得する。解析部４０は、各位置において偏光カメラ３５により取得された干渉画像に基づいて観察対象物Ｓの３次元複素振幅画像を作成する。

移動部２８は、結像光学系を構成する光学素子または観察対象物を結像光学系の光軸に平行な方向に移動させるものであり、好適には対物レンズ２１を光軸方向に移動させる。移動部２８は、リニアステージであってもよいし、ピエゾアクチュエータであってもよく、また、リニアステージおよびピエゾアクチュエータを組み合わせたものであってもよい。移動部２８による対物レンズ２１の移動により、偏光カメラ３５の撮像面に対して共役な位置が観察対象物Ｓ中で深さ方向に走査されることになるので、観察対象物Ｓの３次元の位相微分画像、位相画像、振幅画像および複素振幅画像を作成することができる。さらに、観察対象物Ｓの３次元の位相微分画像または位相画像に対してデコンボリューション等の処理をすることで、観察対象物Ｓの３次元の屈折率分布画像を再構成することもできる。

次に、実施例について説明する。実施例では、第７実施形態の観察装置１Ｇ（図１０）を用いて、観察対象物として細胞を観察した。図１１は、位相微分画像である。第１プリズム１４によるシアー方向（互いに直交する二つの直線偏光の光の分離方向）は、この図において左右方向である。図１２は、位相微分画像（図１１）から作成された位相画像である。図１３は、深さ方向の各位置で取得された位相画像（図１２）から作成された３次元屈折率分布画像である。この図に示されるように、観察対象物である細胞の立体的な形状を可視化することができた。

１Ａ～１Ｇ…観察装置、１１…光源、１２…レンズ、１３…偏光子、１４…第１プリズム、１５…コンデンサレンズ、２１…対物レンズ、２２…第２プリズム、２３…１／４波長板（偏光変換素子）、２４…レンズ、２５…波長板（偏光変換補償用光学素子）、２６…偏光カメラ、２７…ミラー、２８…移動部、３０Ｅ，３０Ｆ…光学モジュール、３１…レンズ、３２…波長板（偏光変換補償用光学素子）、３３…１／４波長板（偏光変換素子）、３４…レンズ、３５…偏光カメラ、３６～３８…ミラー、４０…解析部。

Claims (23)

1. 空間的にインコヒーレントな光を出力する光源と、
   前記光源から出力された光を観察対象物に集光照射する照射光学系と、
   前記照射光学系の光路上に設けられ、前記光源から出力された光を入力して、直線偏光の光を出力する偏光子と、
   前記照射光学系の光路上であって前記偏光子と前記観察対象物との間に設けられ、前記偏光子から出力された光を入力して、互いに直交する二つの直線偏光の光を出力する第１プリズムと、
   前記照射光学系による前記観察対象物への光の照射に応じて前記観察対象物で生じた光を入力して結像する結像光学系と、
   前記結像光学系の光路上に設けられ、前記観察対象物から出力された二つの光を合波して出力する第２プリズムと、
   前記結像光学系の光路上であって前記第２プリズムより後段に設けられ、前記第２プリズムから出力された光を入力して、互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を出力する偏光変換素子と、
   前記結像光学系において前記第２プリズムおよび前記偏光変換素子を除く光学素子で生じる偏光変換を低減する偏光変換補償用光学素子と、
   前記結像光学系により像が形成される位置に配置された撮像面を有し、前記偏光変換素子から出力された互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を入力して、３以上の偏光成分それぞれについて前記撮像面上の干渉画像を取得する偏光カメラと、
   前記偏光カメラにより取得された３以上の偏光成分それぞれについての干渉画像に基づいて前記観察対象物の複素振幅画像を作成する解析部と、
   を備え、
   前記偏光変換補償用光学素子は、前記結像光学系に設けられている誘電体多層膜ミラーの反射特性を補償するミラーである、
   観察装置。
2. 前記偏光変換素子は１／４波長板である、
   請求項１に記載の観察装置。
3. 前記結像光学系は、ミラーを有するリレー光学系を含み、
   前記偏光変換補償用光学素子は、前記リレー光学系を構成するミラーである、
   請求項１または２に記載の観察装置。
4. 前記結像光学系は、複数のミラーを有するリレー光学系を含み、
   前記偏光変換補償用光学素子は、前記リレー光学系を構成する前記複数のミラーであり、
   前記複数のミラーは、各々が光を反射させる際に生じる偏光変換を相殺して、全体として偏光変換を低減する、
   請求項１または２に記載の観察装置。
5. 前記結像光学系はリレー光学系を含み、
   前記偏光変換素子は前記リレー光学系の光路上に設けられている、
   請求項１～４の何れか１項に記載の観察装置。
6. 前記偏光カメラは、前記撮像面において複数の画素が２次元配列された構造を有し、２次元の干渉画像を取得する、
   請求項１～５の何れか１項に記載の観察装置。
7. 前記偏光カメラは、前記撮像面において複数の画素が１次元配列された構造を有し、１次元の干渉画像を取得する、
   請求項１～５の何れか１項に記載の観察装置。
8. 前記偏光カメラの前記撮像面における前記複数の画素の配列方向と異なる方向に前記観察対象物を相対的に移動させることで、前記観察対象物の２次元の干渉画像を取得する、
   請求項７に記載の観察装置。
9. 前記結像光学系を構成する光学素子または前記観察対象物を前記結像光学系の光軸に平行な方向に移動させる移動部を更に備え、
   前記偏光カメラは、前記移動部による移動の各位置において干渉画像を取得し、
   前記解析部は、各位置において前記偏光カメラにより取得された干渉画像に基づいて前記観察対象物の３次元複素振幅画像を作成する、
   請求項１～８の何れか１項に記載の観察装置。
10. 微分干渉顕微鏡のカメラポートに対して着脱が自在である光学モジュールであって、
    前記微分干渉顕微鏡に置かれた観察対象物で生じた光を入力して結像する結像光学系の一部を構成し、前記微分干渉顕微鏡の第２プリズムから前記カメラポートを経て出力される光を入力するリレー光学系と、
    前記リレー光学系の光路上に設けられ、前記光を入力し、互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を出力する偏光変換素子と、
    前記結像光学系において前記第２プリズムおよび前記偏光変換素子を除く光学素子で生じる偏光変換を低減する偏光変換補償用光学素子と、
    前記リレー光学系により像が形成される位置に配置された撮像面を有し、前記偏光変換素子から出力された互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を入力し、３以上の偏光成分それぞれについて前記撮像面上の干渉画像を取得する偏光カメラと、
    を備え、
    前記偏光変換補償用光学素子は、前記結像光学系に設けられている誘電体多層膜ミラーの反射特性を補償するミラーである、
    光学モジュール。
11. 前記偏光変換素子は１／４波長板である、
    請求項１０に記載の光学モジュール。
12. 前記リレー光学系は複数のミラーを有し、
    前記偏光変換補償用光学素子は、前記リレー光学系を構成する前記複数のミラーであり、
    前記複数のミラーは、各々が光を反射させる際に生じる偏光変換を相殺して、全体として偏光変換を低減する、
    請求項１０または１１に記載の光学モジュール。
13. 前記偏光カメラは、前記撮像面において複数の画素が２次元配列された構造を有し、２次元の干渉画像を取得する、
    請求項１０～１２の何れか１項に記載の光学モジュール。
14. 前記偏光カメラは、前記撮像面において複数の画素が１次元配列された構造を有し、１次元の干渉画像を取得する、
    請求項１０～１２の何れか１項に記載の光学モジュール。
15. 空間的にインコヒーレントな光を光源から出力し、
    前記光源から出力された光を観察対象物に集光照射する照射光学系の光路上に設けられた偏光子により、前記光源から出力された光を入力して、直線偏光の光を出力し、
    前記照射光学系の光路上であって前記偏光子と前記観察対象物との間に設けられた第１プリズムにより、前記偏光子から出力された光を入力して、互いに直交する二つの直線偏光の光を出力し、
    前記照射光学系による前記観察対象物への光の照射に応じて前記観察対象物で生じた光を入力して結像する結像光学系の光路上に設けられた第２プリズムにより、前記観察対象物から出力された二つの光を合波して光を出力し、
    前記結像光学系の光路上であって前記第２プリズムより後段に設けられた偏光変換素子により、前記第２プリズムから出力された光を入力して、互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光に変換して出力し、
    前記結像光学系に設けられている誘電体多層膜ミラーの反射特性を補償するミラーを偏光変換補償用光学素子として用いて、前記結像光学系において前記第２プリズムおよび前記偏光変換素子を除く光学素子で生じる偏光変換を低減し、
    前記結像光学系により像が形成される位置に配置された撮像面を有する偏光カメラにより、前記偏光変換素子から出力された互いに回転方向が異なる二つの円偏光の光を入力して、３以上の偏光成分それぞれについて前記撮像面上の干渉画像を取得し、
    前記偏光カメラにより取得された３以上の偏光成分それぞれについての干渉画像に基づいて前記観察対象物の複素振幅画像を作成する、
    観察方法。
16. 前記偏光変換素子は１／４波長板である、
    請求項１５に記載の観察方法。
17. 前記結像光学系は、ミラーを有するリレー光学系を含み、
    前記偏光変換補償用光学素子は、前記リレー光学系を構成するミラーである、
    請求項１５または１６に記載の観察方法。
18. 前記結像光学系は、複数のミラーを有するリレー光学系を含み、
    前記偏光変換補償用光学素子は、前記リレー光学系を構成する前記複数のミラーであり、
    前記複数のミラーは、各々が光を反射させる際に生じる偏光変換を相殺して、全体として偏光変換を低減する、
    請求項１５または１６に記載の観察方法。
19. 前記結像光学系はリレー光学系を含み、
    前記偏光変換素子は前記リレー光学系の光路上に設けられている、
    請求項１５～１８の何れか１項に記載の観察方法。
20. 前記偏光カメラは、前記撮像面において複数の画素が２次元配列された構造を有し、２次元の干渉画像を取得する、
    請求項１５～１９の何れか１項に記載の観察方法。
21. 前記偏光カメラは、前記撮像面において複数の画素が１次元配列された構造を有し、１次元の干渉画像を取得する、
    請求項１５～１９の何れか１項に記載の観察方法。
22. 前記偏光カメラの前記撮像面における前記複数の画素の配列方向と異なる方向に前記観察対象物を相対的に移動させることで、前記観察対象物の２次元の干渉画像を取得する、
    請求項２１に記載の観察方法。
23. 前記結像光学系を構成する光学素子または前記観察対象物を前記結像光学系の光軸に平行な方向に移動させ、
    前記偏光カメラにより各位置において干渉画像を取得し、
    各位置において前記偏光カメラにより取得された干渉画像に基づいて前記観察対象物の３次元複素振幅画像を作成する、
    請求項１５～２２の何れか１項に記載の観察方法。

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