JP2005037690A

JP2005037690A - ３次元共焦点レーザ顕微鏡システム

Info

Publication number: JP2005037690A
Application number: JP2003274520A
Authority: JP
Inventors: Koshi Kei; 虹之景; Kenji Yatani; 憲二八谷; Kenta Mikuriya; 健太御厨
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2003-07-15
Filing date: 2003-07-15
Publication date: 2005-02-10

Abstract

【課題】振動を抑えた走査波形を自動計算し、その波形を用いてアクチュエータを駆動して顕微鏡対物レンズの焦点面を光軸方向に走査することにより、試料の共焦点スライス像を安定に得ることのできる３次元共焦点レーザ顕微鏡システムを実現する。
【解決手段】試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、前記共焦点画像をビデオ信号に変換するビデオレートカメラと、前記ビデオレート信号を画像データに変換する画像処理装置と、顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータと、このアクチュエータを介して前記対物レンズを光軸方向に走査するための走査波形信号を発生する制御手段を備え、試料の深さ方向のスライス画像を取得することができるように構成した３次元共焦点レーザ顕微鏡システムであって、
前記制御手段は、三角状またはステップ状の走査波形であって、かつ不連続的な変化部分では加速度が実質上一定値となるように補正した走査波形信号を作成し、その走査波形信号により前記アクチュエータを駆動するように構成する。
【選択図】図１

Description

本発明は、３次元共焦点レーザ顕微鏡システムに関し、より詳しくは、試料の共焦点スライス像を安定に得るための改良に関するものである。

共焦点顕微鏡は、試料を薄切片にすることにくスライス画像が得られ、そのスライス画像から試料の正確な３次元立体像を構築できるので、生物やバイオテクノロジーなどの分野における生きた細胞の生理反応観察や形態観察あるいは半導体市場におけるＬＳＩの表面観察などに使用されている（例えば、特許文献１参照）。

特開２００２−７２１０２号公報

図６は特許文献１に記載の共焦点顕微鏡の構成図である。ビデオレートカメラ１、共焦点スキャナ２、顕微鏡３、アクチュエータ４および対物レンズ５は、同じ光軸上に配置されている。共焦点スキャナ２は、多数のピンホールを持つニポウディスクと、それに対応するマイクロレンズアレイを有するもので、シンプルな光学系から成るニポウディスク方式を採用したコンパクトなアドオンタイプである。

この共焦点スキャナ２は顕微鏡３のカメラポートに取り付けられる。共焦点顕微鏡は、レーザ光を使用して、対物レンズ５、アクチュエータ４および顕微鏡３を経由して、試料の像を共焦点スキャナ２に入力する。共焦点スキャナ２は、試料の共焦点画像を得て、ビデオレートカメラ１に入力する。

図７は、図６の共焦点顕微鏡が取り扱う各種信号のタイムチャートである。ビデオレートカメラ１は、共焦点画像をビデオ信号１０１に変換し、共焦点スキャナ２、同期インターフェイスボックス９の信号入力端子および画像処理装置６の画像入力端子にビデオ信号１０１を入力する。共焦点スキャナ２は、ビデオ信号１０１に同期して、ニポウディスクの回転同期制御を行う。

画像処理装置６にビデオテープデッキを採用する場合、ビデオテープデッキは、画像入力端子から入力されるビデオ信号１０１と、音声入力端子から入力される開始信号１０３を長時間用のビデオテープに同時に記録する。ビデオテープには、リアルタイムに変化する共焦点画像と対物レンズ５の焦点位置の走査開始のタイミングが同時に記録される。

同期インターフェイスボックス９は、ビデオ信号１０１の偶数側パルス列または奇数側パルス列の何れか一方を抽出し、内部Ａ信号を作成する。任意波形発生器７は、Ｈレベルのパルス信号であるトリガ信号１０２を発生し、同期インターフェイスボックス９のトリガ入力端子に入力して、焦点面の走査の開始タイミングに利用する。

同期インターフェイスボックス９は、トリガ信号１０２の立下りに同期して、内部Ｂ信号を作成する。内部Ｂ信号は、Ｈレベルのパルス幅時間が３５ｍｓｅｃ程度であり、ビデオレートカメラ１のビデオレートの時間に比して若干長いパルス信号である。同期インターフェイスボックス９は、内部Ａ信号の反転信号と内部Ｂ信号とを論理積演算することにより、開始信号１０３を発生し、画像処理装置６および任意波形発生器７の同期入力端子に入力する。

画像処理装置６は、同期入力端子からの開始信号１０３の立上りに同期して、ビデオ信号１０１を画像データに変換し記録するキャプチャを開始する。同期インターフェイスボックス９は、信号入力端子からのビデオ信号１０１に基づいて、共焦点スキャナ２によるニポウディスクの回転同期制御、画像処理装置６によるビデオ信号の取得の開始タイミング、および光学制御系による対物レンズの焦点位置の走査開始のタイミングを全て同期させる。

任意波形発生器７は、開始信号１０３の立上りに同期して、光学制御系による対物レンズ５の焦点位置の走査を開始する。任意波形発生器７は、走査信号１０４を発生し、コントローラ８に入力する。走査信号１０４は、ＬレベルからＨレベルまで一定時間で直線的に増加するノコギリ波状の信号である。コントローラ８は、走査信号１０４をアクチュエータ４に入力する。アクチュエータ信号１０５は実際のアクチュエータの位置信号であり、伸びきってから一気に原点に戻ったあとにオーバーシュートがあり、この間は不感帯となる。

アクチュエータ４は、顕微鏡３の対物レンズレボルバーと対物レンズ５との間に取り付けられ、ピエゾ駆動により走査信号１０４のレベルに比例して画像の焦点方向の長さが変化し、対物レンズ５の焦点位置を制御する。共焦点顕微鏡は、走査信号１０４に基づいて、焦点面を走査することにより、試料のスライス画像を取得する。

このような構成によれば、ニポウディスクの回転同期制御、画像処理装置によるビデオ信号の取得の開始タイミングおよび光学制御系によるレンズの焦点位置の走査開始のタイミングが、すべてビデオ信号に同期することにより、共焦点画像の位置精度が向上し、複数のスライス画像を取得する際に個々の取得時間のバラツキがなくなるので、信頼性の高いスライス画像が得られる。

しかしながら、従来の共焦点顕微鏡では、対物レンズの焦点面を走査するアクチュエータの走査波形としてランプ波（直角三角波）を用いているため、波形の折返し点でアクチュエータに巨大な加速度が生じ、整定するまでに長い時間が必要となる。その整定時間中は正確な画像の取得ができないため、観察に使用できる有効画像の数が減ってしまうという欠点があった。
また、巨大な加速度は振動となり、その周波数がアクチュエータ自身や顕微鏡筐体の固有振動数と一致すると共振現象が生じ、試料面が不安定になって観測できなくなるという問題もある。

本発明は、このような従来の共焦点顕微鏡が有していた問題を解決しようとするものであり、振動を抑えた走査波形を自動計算し、その波形を用いてアクチュエータを駆動して顕微鏡対物レンズの焦点面を光軸方向に走査することにより上記課題を解決し、試料の共焦点スライス像を安定に得ることのできる３次元共焦点レーザ顕微鏡システムを実現することを目的とするものである。

このような課題を達成するために、本発明の請求項１の発明では、
試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、前記共焦点画像をビデオ信号に変換するビデオレートカメラと、前記ビデオレート信号を画像データに変換する画像処理装置と、顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータと、このアクチュエータを介して前記対物レンズを光軸方向に走査するための走査波形信号を発生する制御手段を備え、試料の深さ方向のスライス画像を取得することができるように構成された３次元共焦点レーザ顕微鏡システムであって、
前記制御手段は、三角状またはステップ状の走査波形であって、かつ不連続的な変化部分では加速度が実質上一定値となるように補正した走査波形信号を作成し、その走査波形信号により前記アクチュエータを駆動するように構成したことを特徴とする。
このような構成により、対物レンズなどの振動を抑えた走査波形を発生して対物レンズを走査でき、観測試料の安定した共焦点スライス像が容易に得られる。

この場合、請求項２のように、走査波形信号の不連続的な変化部分では、その変位ｓが２次関数で表されるように補正してもよい。
また、制御手段は、請求項３のように、前記三角状またはステップ状の走査波形信号の波形を計算を用いて求める波形計算装置と、この走査波形を記憶しておき走査波形発生トリガ信号に同期して発生する任意波形発生器と、この任意波形発生器から出力される操作波形発生トリガ信号に基づいて前記アクチュエータを駆動するアクチュエータドライバと、前記ビデオレートカメラのビデオ信号に同期した各トリガ信号を発生して各部に与える信号制御器から構成することができる。

以上説明したように、本発明によれば、振動を抑えた走査波形を自動計算により求め、その波形を用いてアクチュエータを駆動することにより、振動を抑えて、対物レンズの焦点位置を光軸方向に容易に走査できる。

以下図面を用いて本発明を詳細に説明する。図１は本発明に係る３次元共焦点レーザ顕微鏡システムの一実施例を示す構成図である。なお、図１において図６と同等部分には同一符号を付し、その説明は省略する。

図１において、１０は信号制御器、１１は波形計算装置、１２はアクチュエータドライバ、２０は試料である。
信号制御器１０は、ビデオレートカメラ（以下単にカメラという）１から出力されるビデオ信号を受けて、そのビデオ信号をそのまま出力すると共に、ビデオ信号から垂直同期信号を抽出しこれを基に各種のトリガ信号を生成する。
任意波形発生器７ａは、信号制御器１０からの走査波形発生トリガ信号を受信すると、あらかじめ波形計算装置１１から送られ記憶した三角状波またはステップ波を発生して、アクチュエータドライバ１２へ送る。

波形計算装置１１は、試料２０を観察する際の対物レンズ５の走査周期と光軸方向の走査距離から、アクチュエータ４や顕微鏡筐体の振動を抑えることのできる三角状波やステップ波を計算によって求め、それを走査波形として任意波形発生器７ａに出力する。
アクチュエータドライバ１２は、任意波形発生器７ａから出力される走査波形信号に基づいて、アクチュエータ４を駆動するための駆動信号を発生する。
なお、ここでは、波形計算装置１１、任意波形発生器７ａ、アクチュエータドライバ１２、信号制御器１０から構成される部分を制御手段と呼ぶ。

このような構成の動作を、図２に示す各信号のタイムチャートを参照して次に説明する。カメラ１から制御信号器１０に図２の（ａ）に示すビデオ信号（垂直同期信号が含まれる）が送られると、信号制御器１０では、そのビデオ信号をそのまま画像処理装置６へ送ると同時に、ビデオ信号から垂直同期信号を抽出して、共焦点スキャナ２へ同期信号を送ると共に、各種トリガ信号すなわち走査波形発生トリガ信号［図２の（ｃ）］、画像取込トリガ信号［図２の（ｅ）］を生成する。

信号制御器１０では、図２（ｂ）に示す画像取込スタート信号を受信すると、画像取込スタート信号がLOWになった後の最初の垂直同期信号を走査波形発生トリガ信号［同図（ｃ）］として任意波形発生器７ａへ送ると共に、垂直同期信号を図２（ｅ）に示す画像取込トリガ信号として画像処理装置６へ送る。なお、画像取込スタート信号は、操作者が上位コントローラ例えばパーソナルコンピュータから、任意のタイミングに信号制御器に入力する信号であり、そのパルス幅はビデオ信号の垂直同期信号の周期の２倍以上である。

任意波形発生器７ａでは、信号制御器１０から走査波形発生トリガ信号を受信すると、あらかじめ波形計算装置１１から入力され記憶してある図２（ｄ）に示す三角状波または同図（ｆ）に示すステップ波を発生し、これをアクチュエータドライバ１２に送る。

アクチュエータ４はアクチュエータドライバ１２からの駆動信号によって駆動され、図２（ｄ）あるいは（ｆ）の波形に従って対物レンズ５を光軸方向に走査する。画像処理装置６では、これに同期して試料２０の断面スライス像を連続的に取得する。

次に、波形計算装置１１で作成される走査波形について説明する。図３は対物レンズの走査波形として、通常の三角波を用いた従来の場合［同図（ａ）］と三角状の波形を用いる本発明の場合［同図（ｂ）］との比較を示す図である。なお、図中の黒丸点が波形のデータポイントである。
通常の三角波では、波形の折返し部で変位が急激に変化する。その時、大きな加速度が生じ、それが振動の発生源となる。これに対して、本発明では、波形の変化が不連続的な部分すなわち波形の折返し部では、その変位が２次関数で表されるように補正し、急峻な変化が無い（すなわち加速度が小さく、かつ実質上一定値となる）形状にしてある。

本発明においては、対物レンズの走査ストロークＳと、三角波形における降下部の時間Ｔと、折返し部の加速度ａとの間には次の関係式（１）が成立するように設計しておく。
ａ＝Ｓ／Ｔ^２ ……（１）
ここで、ストロークＳは観察者が設定する項目である。時間Ｔはカメラの撮像フレームレートの整数倍とする。
したがって、折り返し部の変位ｓは次式で表され、図３（ｂ）に示すような波形となる。これにより、対物レンズ５部や顕微鏡筐体部の振動は抑えられる。
ｓ＝ａ・ｔ²／２ ……（２）
ここで、ｔは経過時間を表す。

また、図４は対物レンズ５の走査波形をステップ波とした場合の比較図である。同図（ａ）が従来の場合、同図（ｂ）が本発明の場合である。なお、走査のフルストーク点から０点に戻る波形は、図３の三角波の場合と同様とする。
図４（ａ）のステップ波形の場合、ステップが変化するとき、変位の急激な変化によって大きな加速度が生じ、それが振動源となる。図４（ｂ）に示す本発明のステップ波形では、ステップが変るところでは（２）式の２次関数の波形であり、滑らかな変化となっており、加速度は小さい。したがって、ステップ波形の場合においても対物レンズ５や顕微鏡筐体部の振動は抑えられる。
図５にステップ波形の変位と加速度について従来の場合［同図（ａ）］と本発明の場合［同図（ｂ）］との対比を示す。

なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。

本発明に係る３次元共焦点レーザ顕微鏡システムの一実施例を示す構成図である。本発明に係る各信号のタイムチャートである。走査波形と加速度についての説明図である。ステップ波についての説明図である。ステップ波と加速度についての説明図である。従来の共焦点顕微鏡の一例を示す構成図である。図６の共焦点顕微鏡が取り扱う各信号のタイムチャートである。

符号の説明

１カメラ
２共焦点スキャナ
３顕微鏡
４アクチュエータ
５対物レンズ
６画像処理装置
７ａ任意波形発生器
１０信号制御器
１１波形計算装置
１２アクチュエータドライバ
２０試料

Claims

試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、前記共焦点画像をビデオ信号に変換するビデオレートカメラと、前記ビデオレート信号を画像データに変換する画像処理装置と、顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータと、このアクチュエータを介して前記対物レンズを光軸方向に走査するための走査波形信号を発生する制御手段を備え、試料の深さ方向のスライス画像を取得することができるように構成した３次元共焦点レーザ顕微鏡システムであって、
前記制御手段は、三角状またはステップ状の走査波形であって、かつ不連続的な変化部分では加速度が実質上一定値となるように補正した走査波形信号を作成し、その走査波形信号により前記アクチュエータを駆動するように構成したことを特徴とする３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
前記制御手段で生成される走査波形信号を、不連続的な変化部分では、その変位ｓが、
ｓ＝ａ・ｔ^２／２
ただし、ｔは経過時間
ａはＳ／Ｔ^２（ここに、Ｓは対物レンズの走査ストローク、Ｔは波形の下降部の時間である）
となるように２次関数で補正し、加速度が実質上一定値となるようにしたことを特徴とする請求項１に記載の３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
前記制御手段は、前記三角状またはステップ状の走査波形信号の波形を計算を用いて求める波形計算装置と、この走査波形を記憶しておき走査波形発生トリガ信号に同期して発生する任意波形発生器と、この任意波形発生器から出力される走査波形発生トリガ信号に基づいて前記アクチュエータを駆動するアクチュエータドライバと、前記ビデオレートカメラのビデオ信号に同期した各トリガ信号を発生して各部に与える信号制御器から構成されたことを特徴とする請求項１または２に記載の３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。