JPH1138324A - レーザ走査顕微鏡 - Google Patents
レーザ走査顕微鏡Info
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- JPH1138324A JPH1138324A JP9212597A JP21259797A JPH1138324A JP H1138324 A JPH1138324 A JP H1138324A JP 9212597 A JP9212597 A JP 9212597A JP 21259797 A JP21259797 A JP 21259797A JP H1138324 A JPH1138324 A JP H1138324A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料の厚さを予め計算しなくとも過不足のな
い切片像を連続的に取得できるレーザ走査顕微鏡を提供
する。 【解決手段】 励起レーザ光を反射させるとともに蛍光
を透過させるダイクロイックミラー３と、励起レーザ光
を試料１３上で２次元走査する２次元スキャンユニット
４と、２次元スキャンユニット４と試料１３との間に配
置された対物レンズ７と、試料１３と対物レンズ７との
光軸方向における相対位置を移動可能なＺ軸コントロー
ラ８と、蛍光を観察するモニタ２２とを備えたレーザ走
査顕微鏡において、Ｚ軸コントローラ８を駆動させて相
対位置を光軸方向へ所定距離ずつ移動させ、その移動の
度に取得される切片像同士の画像情報を比較し、この画
像情報の比較結果に基づいて切片像の取得を終了させ
る。
い切片像を連続的に取得できるレーザ走査顕微鏡を提供
する。 【解決手段】 励起レーザ光を反射させるとともに蛍光
を透過させるダイクロイックミラー３と、励起レーザ光
を試料１３上で２次元走査する２次元スキャンユニット
４と、２次元スキャンユニット４と試料１３との間に配
置された対物レンズ７と、試料１３と対物レンズ７との
光軸方向における相対位置を移動可能なＺ軸コントロー
ラ８と、蛍光を観察するモニタ２２とを備えたレーザ走
査顕微鏡において、Ｚ軸コントローラ８を駆動させて相
対位置を光軸方向へ所定距離ずつ移動させ、その移動の
度に取得される切片像同士の画像情報を比較し、この画
像情報の比較結果に基づいて切片像の取得を終了させ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はレーザ走査顕微鏡に
関する。
関する。
【０００２】
【従来の技術】共焦点レーザ走査顕微鏡は、励起レーザ
光を試料に照射するレーザ光源と、励起レーザ光と試料
から発せられる蛍光とを分離するダイクロイックミラー
と、励起レーザ光を２次元走査する２次元スキャンユニ
ットと、２次元スキャンユニットと試料との間に配置さ
れた対物レンズと、ダイクロイックミラーと検出装置と
の間に配置され、集光レンズと集光レンズの焦点面に設
けられたピンホールと、試料と対物レンズとの光軸方向
における相対位置を移動可能な駆動装置と、蛍光を観察
する観察装置とを備える。
光を試料に照射するレーザ光源と、励起レーザ光と試料
から発せられる蛍光とを分離するダイクロイックミラー
と、励起レーザ光を２次元走査する２次元スキャンユニ
ットと、２次元スキャンユニットと試料との間に配置さ
れた対物レンズと、ダイクロイックミラーと検出装置と
の間に配置され、集光レンズと集光レンズの焦点面に設
けられたピンホールと、試料と対物レンズとの光軸方向
における相対位置を移動可能な駆動装置と、蛍光を観察
する観察装置とを備える。
【０００３】レーザ光源から射出された励起レーザ光
は、ダイクロイックミラーによって反射された後、２次
元スキャンユニットによって２次元走査され、対物レン
ズによって光軸にほぼ直角な試料面に集光される。
は、ダイクロイックミラーによって反射された後、２次
元スキャンユニットによって２次元走査され、対物レン
ズによって光軸にほぼ直角な試料面に集光される。
【０００４】励起レーザ光の照射によって試料から発生
した蛍光は励起レーザ光とともに対物レンズから走査ミ
ラーへと光路を逆行し、ダイクロイックミラーで励起レ
ーザ光と分離される。
した蛍光は励起レーザ光とともに対物レンズから走査ミ
ラーへと光路を逆行し、ダイクロイックミラーで励起レ
ーザ光と分離される。
【０００５】ダイクロイックミラーを透過した蛍光は、
集光レンズにより光路中に配置したピンホールに集光さ
れる。このとき、試料の結像部で発した蛍光のみがピン
ホールを通過し、検出装置で受光されるとともに、検出
装置で光量に応じた電気信号に変換される。
集光レンズにより光路中に配置したピンホールに集光さ
れる。このとき、試料の結像部で発した蛍光のみがピン
ホールを通過し、検出装置で受光されるとともに、検出
装置で光量に応じた電気信号に変換される。
【０００６】この電気信号と走査位置情報とをコンピュ
ータを用いて所定の処理を行うことで試料の非常に薄い
切片像が得られる。このとき、駆動装置を駆動して焦点
面を光軸方向へ移動させて対物レンズと試料との距離
（ピント）を変えることにより、各焦点面における切片
像を連続的に取得することができる。
ータを用いて所定の処理を行うことで試料の非常に薄い
切片像が得られる。このとき、駆動装置を駆動して焦点
面を光軸方向へ移動させて対物レンズと試料との距離
（ピント）を変えることにより、各焦点面における切片
像を連続的に取得することができる。
【０００７】試料全体の切片像を取得するには、予め試
料の厚さを求め、この厚さに応じて焦点面の移動間隔や
取得する切片像の枚数等の条件を、予めメモリに記憶さ
せておく必要がある。
料の厚さを求め、この厚さに応じて焦点面の移動間隔や
取得する切片像の枚数等の条件を、予めメモリに記憶さ
せておく必要がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかし、試料の厚さを
求めるには、１枚目（試料の最上部）の画像取得時のス
テージのＺ方向（光軸方向）の位置と最後（試料の最下
部）の画像取得時のステージのＺ方向の位置とから試料
の厚さを予め計算しておく必要があり、煩わしいもので
あった。
求めるには、１枚目（試料の最上部）の画像取得時のス
テージのＺ方向（光軸方向）の位置と最後（試料の最下
部）の画像取得時のステージのＺ方向の位置とから試料
の厚さを予め計算しておく必要があり、煩わしいもので
あった。
【０００９】試料の厚さが正確に求められていないと、
連続的に取得される切片像の枚数に過不足が生じてしま
う。
連続的に取得される切片像の枚数に過不足が生じてしま
う。
【００１０】図４及び図５は試料の厚さと切片像の枚数
との関係を説明する図である。
との関係を説明する図である。
【００１１】例えば、計算で求めた試料の厚さが実際の
試料１１３よりも薄い場合には、試料１１３の厚さ方向
において必要とする枚数の切片像１１３Ａを取得するこ
とができず、試料１１３の画像情報１１３Ｂが不足して
しまう（図４参照）。
試料１１３よりも薄い場合には、試料１１３の厚さ方向
において必要とする枚数の切片像１１３Ａを取得するこ
とができず、試料１１３の画像情報１１３Ｂが不足して
しまう（図４参照）。
【００１２】逆に計算で求めた試料の厚さが実際の試料
１１３の厚さより厚い場合には、試料１１３の画像情報
１１３Ｂとして意味のない切片像１１３Ａまで取得して
しまう（図５参照）。
１１３の厚さより厚い場合には、試料１１３の画像情報
１１３Ｂとして意味のない切片像１１３Ａまで取得して
しまう（図５参照）。
【００１３】また、試料１１３の厚さを求めるためには
試料１１３の同じ部分をレーザ光によって繰り返し走査
するので、レーザ光の照射によって蛍光を発する試料の
場合には、試料のダメージや蛍光の退色が大きくなって
しまうという問題がある。
試料１１３の同じ部分をレーザ光によって繰り返し走査
するので、レーザ光の照射によって蛍光を発する試料の
場合には、試料のダメージや蛍光の退色が大きくなって
しまうという問題がある。
【００１４】この発明はこのような事情に鑑みてなされ
たもので、その課題は試料の厚さを予め計算しなくとも
過不足なく、試料全体の切片像を連続的に取得できるレ
ーザ走査顕微鏡を提供することである。
たもので、その課題は試料の厚さを予め計算しなくとも
過不足なく、試料全体の切片像を連続的に取得できるレ
ーザ走査顕微鏡を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】前述の課題を解決するた
め請求項１記載の発明のレーザ走査顕微鏡は、励起レー
ザ光を反射するとともに蛍光を透過する光分離手段と、
前記励起レーザ光を試料上で２次元走査する走査手段
と、前記走査手段と前記試料との間に配置された対物レ
ンズと、前記試料と前記対物レンズとの光軸方向におけ
る相対位置を移動可能な駆動手段と、前記光分離手段を
透過した蛍光を受光して、試料の切片像を取得する観察
手段とを備えたレーザ走査顕微鏡において、前記駆動手
段を駆動して前記相対位置を光軸方向へ所定距離ずつ移
動させ、その移動の度に、移動前後に取得される切片像
同士の画像情報を比較し、この画像情報の比較結果に基
づいて前記切片像の取得を終了させる制御手段を備えて
いることを特徴とする。
め請求項１記載の発明のレーザ走査顕微鏡は、励起レー
ザ光を反射するとともに蛍光を透過する光分離手段と、
前記励起レーザ光を試料上で２次元走査する走査手段
と、前記走査手段と前記試料との間に配置された対物レ
ンズと、前記試料と前記対物レンズとの光軸方向におけ
る相対位置を移動可能な駆動手段と、前記光分離手段を
透過した蛍光を受光して、試料の切片像を取得する観察
手段とを備えたレーザ走査顕微鏡において、前記駆動手
段を駆動して前記相対位置を光軸方向へ所定距離ずつ移
動させ、その移動の度に、移動前後に取得される切片像
同士の画像情報を比較し、この画像情報の比較結果に基
づいて前記切片像の取得を終了させる制御手段を備えて
いることを特徴とする。
【００１６】駆動手段を駆動させて相対位置を光軸方向
へ所定距離ずつ移動させ、その移動の度に取得される切
片像同士の画像情報を比較し、この画像情報の比較結果
に基づいて切片像の取得を終了させるので、試料が存在
し、前に取得した切片像と後で取得した切片像の画像情
報が異なっている間は、焦点面の移動と切片像の取得と
が行われ、試料が存在しなくなり隣り合う切片像の画像
情報が同じになったとき、光軸方向の移動と切片像の取
得とが終了する。
へ所定距離ずつ移動させ、その移動の度に取得される切
片像同士の画像情報を比較し、この画像情報の比較結果
に基づいて切片像の取得を終了させるので、試料が存在
し、前に取得した切片像と後で取得した切片像の画像情
報が異なっている間は、焦点面の移動と切片像の取得と
が行われ、試料が存在しなくなり隣り合う切片像の画像
情報が同じになったとき、光軸方向の移動と切片像の取
得とが終了する。
【００１７】請求項２記載の発明のレーザ走査顕微鏡
は、請求項１記載のレーザ走査顕微鏡において、前記画
像情報は各画素の輝度情報であり、前記比較する前の前
記輝度情報が予め定められた閾値以上の値を所定の割合
以上有するとき、前記制御手段は切片像の取得を続ける
ことを特徴とする。
は、請求項１記載のレーザ走査顕微鏡において、前記画
像情報は各画素の輝度情報であり、前記比較する前の前
記輝度情報が予め定められた閾値以上の値を所定の割合
以上有するとき、前記制御手段は切片像の取得を続ける
ことを特徴とする。
【００１８】比較する前の輝度情報が予め定められた閾
値以上の値を所定の割合以上有するときには、試料が存
在すると判断され、切片像取得が続けられる。
値以上の値を所定の割合以上有するときには、試料が存
在すると判断され、切片像取得が続けられる。
【００１９】請求項３記載の発明のレーザ走査顕微鏡
は、請求項１記載のレーザ走査顕微鏡において、前記画
像情報は各画素の輝度情報であり、前記比較結果が予め
定められた閾値以下の値を所定割合以上有するとき、制
御手段は切片像の取得を終了する。
は、請求項１記載のレーザ走査顕微鏡において、前記画
像情報は各画素の輝度情報であり、前記比較結果が予め
定められた閾値以下の値を所定割合以上有するとき、制
御手段は切片像の取得を終了する。
【００２０】比較結果が予め定められた閾値以下の値を
所定割合以上有するとき、試料が存在しないと判断さ
れ、切片像の取得が終了する。
所定割合以上有するとき、試料が存在しないと判断さ
れ、切片像の取得が終了する。
【００２１】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態を図
面に基づいて説明する。
面に基づいて説明する。
【００２２】図１はこの発明の第１実施形態に係る共焦
点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
【００２３】共焦点レーザ走査顕微鏡は、レーザ光源１
と、ビームエクスパンダ２と、ダイクロイックミラー
（光分離手段）３と、２次元スキャンユニット（走査手
段）４と、スキャナコントローラ５と、集光レンズ６
と、対物レンズ７と、Ｚ軸コントローラ（駆動手段）８
と、吸収フィルタ９と、集光レンズ１０と、ピンホール
フィルタ１１と、光検出器１２と、コンピュータ（制御
手段）２０と、画像処理回路２１と、モニタ（観察手
段）２２とを備える。
と、ビームエクスパンダ２と、ダイクロイックミラー
（光分離手段）３と、２次元スキャンユニット（走査手
段）４と、スキャナコントローラ５と、集光レンズ６
と、対物レンズ７と、Ｚ軸コントローラ（駆動手段）８
と、吸収フィルタ９と、集光レンズ１０と、ピンホール
フィルタ１１と、光検出器１２と、コンピュータ（制御
手段）２０と、画像処理回路２１と、モニタ（観察手
段）２２とを備える。
【００２４】光源１は励起レーザ光（以後、レーザ光と
いう）を発してステージ（図示せず）上に載置された試
料１３に照射する。
いう）を発してステージ（図示せず）上に載置された試
料１３に照射する。
【００２５】ビームエクスパンダ２はレーザ光を対物レ
ンズの瞳面を満たす大きさに拡大する。
ンズの瞳面を満たす大きさに拡大する。
【００２６】ダイクロイックミラー２はレーザ光を透過
させないが試料１３から発せられる蛍光を透過させる。
させないが試料１３から発せられる蛍光を透過させる。
【００２７】２次元スキャンユニット４はスキャナコン
トローラ５によってＸＹ方向の走査を行う水平スキャナ
４Ａと垂直スキャナ４Ｂとを備える。
トローラ５によってＸＹ方向の走査を行う水平スキャナ
４Ａと垂直スキャナ４Ｂとを備える。
【００２８】スキャナコントローラ５はコンピュータ２
０から出力される水平同期信号２１ａと垂直同期信号２
１ｂとに基づいて水平スキャナ４Ａと垂直スキャナ４Ｂ
とを制御する。
０から出力される水平同期信号２１ａと垂直同期信号２
１ｂとに基づいて水平スキャナ４Ａと垂直スキャナ４Ｂ
とを制御する。
【００２９】対物レンズ７は２次元スキャンユニット４
と試料１３との間に配置され、Ｚ軸コントローラ８によ
って試料１３に対して光軸方向に移動される。
と試料１３との間に配置され、Ｚ軸コントローラ８によ
って試料１３に対して光軸方向に移動される。
【００３０】Ｚ軸コントローラ８はコンピュータ２０か
ら出力される、光軸方向の移動間隔及び移動方向ａを指
示する移動信号２０ｂによって制御される。
ら出力される、光軸方向の移動間隔及び移動方向ａを指
示する移動信号２０ｂによって制御される。
【００３１】Ｚ軸コントローラ８としては、例えばＤＣ
サーボモータを用いることができる。
サーボモータを用いることができる。
【００３２】集光レンズ１０はダイクロイックミラー３
によって分離され、吸収フィルタ９を通過した光を集光
させる。
によって分離され、吸収フィルタ９を通過した光を集光
させる。
【００３３】ピンホールフィルタ１１は対物レンズ７の
焦点面と共役な位置に設けられ、試料１３の結像部で発
した光だけを通過させる。
焦点面と共役な位置に設けられ、試料１３の結像部で発
した光だけを通過させる。
【００３４】蛍光検出器１２はピンホールフィルタ１１
を通過した試料１３の光を検出し、入力した光を光強度
を表す信号１２ａに変換する。
を通過した試料１３の光を検出し、入力した光を光強度
を表す信号１２ａに変換する。
【００３５】画像処理回路２１はＡ／Ｄ変換器、フレー
ムメモリ、Ｄ／Ａ変換器等の画像化のための回路を備え
る。
ムメモリ、Ｄ／Ａ変換器等の画像化のための回路を備え
る。
【００３６】この画像処理回路２１は光検出器１２の信
号１２ａとコンピュータ２０から出力される、ピクセル
クロック信号２０ａとに基づいて試料の切片像をフレー
ムメモリに記録するとともに、取得した切片像をモニタ
２２に表示する。また、取得した切片像の画像情報をコ
ンピュータ２０に送信する。
号１２ａとコンピュータ２０から出力される、ピクセル
クロック信号２０ａとに基づいて試料の切片像をフレー
ムメモリに記録するとともに、取得した切片像をモニタ
２２に表示する。また、取得した切片像の画像情報をコ
ンピュータ２０に送信する。
【００３７】図２はコンピュータ２０による切片画像の
取得方法を説明するフローチャートである。なお、図２
においてＳ１〜Ｓ８は各ステップを示す。
取得方法を説明するフローチャートである。なお、図２
においてＳ１〜Ｓ８は各ステップを示す。
【００３８】まず、ユーザは光軸方向の移動間隔等の情
報をキーボード（図示せず）から入力する。この情報は
メモリ２０Ａに記憶される。
報をキーボード（図示せず）から入力する。この情報は
メモリ２０Ａに記憶される。
【００３９】操作者は、Ｚ軸コントローラ８を駆動し、
モニタ２２で画像を見ながら試料１３の上端部の画像に
焦点を合わせ、１枚目の切片像としてＺ方向（光軸方
向）の位置を設定する。この焦点位置で２次元スキャン
ユニット４による２次元走査を行い、切片像の画像情報
をメモリ２０Ａに記憶する。（Ｓ１）。
モニタ２２で画像を見ながら試料１３の上端部の画像に
焦点を合わせ、１枚目の切片像としてＺ方向（光軸方
向）の位置を設定する。この焦点位置で２次元スキャン
ユニット４による２次元走査を行い、切片像の画像情報
をメモリ２０Ａに記憶する。（Ｓ１）。
【００４０】次に、コンピュータ２０はＺ軸コントロー
ラ８を駆動し、対物レンズ７を光軸方向へ所定間隔だけ
下降させる（Ｓ２）。
ラ８を駆動し、対物レンズ７を光軸方向へ所定間隔だけ
下降させる（Ｓ２）。
【００４１】この新たな焦点位置で、２次元スキャンユ
ニット４による試料１３の２次元走査を行い、切片像の
画像情報を取得する（Ｓ３）。
ニット４による試料１３の２次元走査を行い、切片像の
画像情報を取得する（Ｓ３）。
【００４２】コンピュータ２０は、画像処理回路２１か
ら取得し画像情報から、各画素のピクセル値を求め、ピ
クセル値（輝度値を０〜２５５の段階に数値化したも
の）が２０以上になるピクセル数の占める割合が全ピク
セル数の１０％以下であるか否かを判定する（Ｓ４）。
ら取得し画像情報から、各画素のピクセル値を求め、ピ
クセル値（輝度値を０〜２５５の段階に数値化したも
の）が２０以上になるピクセル数の占める割合が全ピク
セル数の１０％以下であるか否かを判定する（Ｓ４）。
【００４３】Ｓ４でピクセル値が２０以上になるピクセ
ル数の占める割合が全ピクセル数の１０％以下でないと
判断された場合には、今回取得した切片像の画像情報を
メモリ２０Ａに記憶する（Ｓ５）。
ル数の占める割合が全ピクセル数の１０％以下でないと
判断された場合には、今回取得した切片像の画像情報を
メモリ２０Ａに記憶する（Ｓ５）。
【００４４】Ｓ４でピクセル値が２０以上になるピクセ
ル数の占める割合が全ピクセル数の１０％以下であると
判断された場合には、今回取得した切片像の画像情報か
ら前回取得した切片像の画像情報を減算（対応するピク
セルのピクセル値の減算）する（Ｓ６）。
ル数の占める割合が全ピクセル数の１０％以下であると
判断された場合には、今回取得した切片像の画像情報か
ら前回取得した切片像の画像情報を減算（対応するピク
セルのピクセル値の減算）する（Ｓ６）。
【００４５】次に、コンピュータ２０は、Ｓ６で減算し
たピクセル値の絶対値が１０以下になるピクセル数を求
め、そのピクセル数の占める割合が全ピクセル数の９０
％以上であるか否かを判定する（Ｓ７）。
たピクセル値の絶対値が１０以下になるピクセル数を求
め、そのピクセル数の占める割合が全ピクセル数の９０
％以上であるか否かを判定する（Ｓ７）。
【００４６】ピクセル値の絶対値が１０以下になるピク
セル数の占める割合が全ピクセル数の９０％以上でない
場合には、取得した切片像の画像情報をメモリ２０Ａに
記憶する（Ｓ８）。
セル数の占める割合が全ピクセル数の９０％以上でない
場合には、取得した切片像の画像情報をメモリ２０Ａに
記憶する（Ｓ８）。
【００４７】ピクセル値の絶対値が１０以下になるピク
セル数の占める割合が全ピクセル数の９０％以上である
場合には、試料１３がないと判断して切片像の画像情報
の取得を終了する（Ｓ９）。
セル数の占める割合が全ピクセル数の９０％以上である
場合には、試料１３がないと判断して切片像の画像情報
の取得を終了する（Ｓ９）。
【００４８】この第１実施形態によれば、以下の効果を
発揮できる。
発揮できる。
【００４９】試料１３が存在し切片像間の画像情報が異
なっている間は、焦点面の移動と切片像の取得とを行
い、焦点面に試料１３が存在しなくなり切片像間の画像
情報が同じになったとき、Ｚ方向の移動と切片像の取得
を終了させるので、試料１３の厚さを予め予め計算しな
くとも過不足なく切片像の画像情報を取得することがで
きる。
なっている間は、焦点面の移動と切片像の取得とを行
い、焦点面に試料１３が存在しなくなり切片像間の画像
情報が同じになったとき、Ｚ方向の移動と切片像の取得
を終了させるので、試料１３の厚さを予め予め計算しな
くとも過不足なく切片像の画像情報を取得することがで
きる。
【００５０】試料１３の厚さを予め計算するために試料
１３の同じ部分を繰り返し走査する必要がなく、１回の
走査だけでよいので、蛍光を発する試料１３の場合でも
ダメージや蛍光の退色を抑えることができる。
１３の同じ部分を繰り返し走査する必要がなく、１回の
走査だけでよいので、蛍光を発する試料１３の場合でも
ダメージや蛍光の退色を抑えることができる。
【００５１】ピクセル値が２０以上になるピクセル数の
占める割合が全ピクセル数の１０％以下でない場合、切
片像の画像情報を取得するようにしたので、切片像間の
ピクセル値の差が小さい場合でも切片像の取得を終了
し、画像情報が不足してしまうという不都合が生じな
い。
占める割合が全ピクセル数の１０％以下でない場合、切
片像の画像情報を取得するようにしたので、切片像間の
ピクセル値の差が小さい場合でも切片像の取得を終了
し、画像情報が不足してしまうという不都合が生じな
い。
【００５２】ピクセル値が１０以下になるピクセル数の
占める割合が全ピクセル数の９０％以上である場合、切
片像の画像情報の取得を終了するので、切片像の画像情
報にノイズ成分が多く含まれ、切片像間のピクセル値の
差が零にならない場合でも、確実に切片像の取得を終了
し、意味のない画像情報を取得してしまうことがない。
占める割合が全ピクセル数の９０％以上である場合、切
片像の画像情報の取得を終了するので、切片像の画像情
報にノイズ成分が多く含まれ、切片像間のピクセル値の
差が零にならない場合でも、確実に切片像の取得を終了
し、意味のない画像情報を取得してしまうことがない。
【００５３】図３はコンピュータ２０による切片画像の
他の取得方法を説明するフローチャートである（第２実
施形態）。なお、図３においてＳ１１〜Ｓ１８は各ステ
ップを示す。
他の取得方法を説明するフローチャートである（第２実
施形態）。なお、図３においてＳ１１〜Ｓ１８は各ステ
ップを示す。
【００５４】まず、ユーザは光軸方向の移動間隔等の情
報をキーボード（図示せず）から入力する。この情報
は、メモリ２０Ａに記憶される。
報をキーボード（図示せず）から入力する。この情報
は、メモリ２０Ａに記憶される。
【００５５】操作者は、Ｚ軸コントローラ８を駆動し、
モニタ２２で画像を見ながら試料１３の上端部の画像に
焦点を合わせ、１枚目の切片像としてＺ方向（光軸方
向）の位置を設定する。この焦点位置で２次元スキャン
ユニット４による２次元走査を行い、切片像の画像情報
をメモリ２０Ａに記憶する。（Ｓ１１）。
モニタ２２で画像を見ながら試料１３の上端部の画像に
焦点を合わせ、１枚目の切片像としてＺ方向（光軸方
向）の位置を設定する。この焦点位置で２次元スキャン
ユニット４による２次元走査を行い、切片像の画像情報
をメモリ２０Ａに記憶する。（Ｓ１１）。
【００５６】次に、コンピュータ２０はＺ軸コントロー
ラ８を駆動し、対物レンズ７を光軸方向へ所定間隔だけ
下降させる（Ｓ１２）。
ラ８を駆動し、対物レンズ７を光軸方向へ所定間隔だけ
下降させる（Ｓ１２）。
【００５７】この新たな焦点位置で、２次元スキャンユ
ニット４による試料１３の２次元走査を行い、切片像の
画像情報を取得する（Ｓ１３）。
ニット４による試料１３の２次元走査を行い、切片像の
画像情報を取得する（Ｓ１３）。
【００５８】コンピュータ２０は、画像処理回路２１か
ら取得した画像情報から、各画素のピクセル値を求め、
ピクセル値が２０以上になるピクセル数の占める割合が
全ピクセル数の１０％以下であるか否かを判定する（Ｓ
１４）。
ら取得した画像情報から、各画素のピクセル値を求め、
ピクセル値が２０以上になるピクセル数の占める割合が
全ピクセル数の１０％以下であるか否かを判定する（Ｓ
１４）。
【００５９】Ｓ１４でピクセル値が２０以上になるピク
セル数の占める割合が全ピクセル数の１０％以下でない
と判断された場合には、今回取得した切片像の画像情報
をメモリ２０Ａに記憶する（Ｓ１５）。
セル数の占める割合が全ピクセル数の１０％以下でない
と判断された場合には、今回取得した切片像の画像情報
をメモリ２０Ａに記憶する（Ｓ１５）。
【００６０】Ｓ１４でピクセル値が２０以上になるピク
セル数の占める割合が全ピクセル数の１０％以下である
と判断された場合には、今回取得した切片像の画像情報
と前回取得した切片像の画像情報との除算（対応するピ
クセルのピクセル値の除算）を行う（Ｓ１６）。
セル数の占める割合が全ピクセル数の１０％以下である
と判断された場合には、今回取得した切片像の画像情報
と前回取得した切片像の画像情報との除算（対応するピ
クセルのピクセル値の除算）を行う（Ｓ１６）。
【００６１】次に、コンピュータ２０は、Ｓ１６の除算
結果が１±０．２になるピクセル数を求め、そのピクセ
ル数の占める割合が全ピクセル数の９０％以上であるか
否かを判定する（Ｓ１７）。
結果が１±０．２になるピクセル数を求め、そのピクセ
ル数の占める割合が全ピクセル数の９０％以上であるか
否かを判定する（Ｓ１７）。
【００６２】除算結果が１±０．２になるピクセル数の
占める割合が全ピクセル数の９０％以上でない場合に
は、取得した切片像の画像情報をメモリ２０Ａに記憶す
る（Ｓ１８）。
占める割合が全ピクセル数の９０％以上でない場合に
は、取得した切片像の画像情報をメモリ２０Ａに記憶す
る（Ｓ１８）。
【００６３】除算結果が１±０．２になるピクセル数の
占める割合が全ピクセル数の９０％以上である場合に
は、試料１３がないと判断して切片像の画像情報の取得
を終了する（Ｓ１９）。
占める割合が全ピクセル数の９０％以上である場合に
は、試料１３がないと判断して切片像の画像情報の取得
を終了する（Ｓ１９）。
【００６４】この第２実施形態によれば、第１実施形態
と同様の効果を発揮することができる。
と同様の効果を発揮することができる。
【００６５】なお、上記各実施形態では対物レンズを用
いたが、ＤＣモータではなくピエゾ素子、ステッピング
モータ及び超音波モータ等を用いることもできる。
いたが、ＤＣモータではなくピエゾ素子、ステッピング
モータ及び超音波モータ等を用いることもできる。
【００６６】
【発明の効果】以上に説明したように請求項１に記載の
発明のレーザ走査顕微鏡によれば、試料が存在し、前に
取得した切片像と後で取得した切片像の画像情報が異な
っている間は、焦点面の移動と切片像の取得とを行い、
試料が存在しなくなり、前に取得した切片像と後で取得
した切片像の画像情報が同じになったとき、光軸方向の
移動と切片像の取得を終了させるので、試料の厚さを予
め計算しなくとも過不足なく切片像の画像情報を取得す
ることができる。
発明のレーザ走査顕微鏡によれば、試料が存在し、前に
取得した切片像と後で取得した切片像の画像情報が異な
っている間は、焦点面の移動と切片像の取得とを行い、
試料が存在しなくなり、前に取得した切片像と後で取得
した切片像の画像情報が同じになったとき、光軸方向の
移動と切片像の取得を終了させるので、試料の厚さを予
め計算しなくとも過不足なく切片像の画像情報を取得す
ることができる。
【００６７】また、蛍光を発する試料の場合でも、試料
の走査は１回でよいので、試料のダメージや蛍光の退色
を抑えることができる。
の走査は１回でよいので、試料のダメージや蛍光の退色
を抑えることができる。
【００６８】請求項２に記載の発明のレーザ走査顕微鏡
によれば、比較する前の輝度情報が予め定められた閾値
以上の値を所定の割合以上有するときには、試料が存在
すると判断され、切片像取得が続けられるので、切片像
間のピクセル値の差が小さい場合でも切片像の取得を終
了し、画像情報が不足してしまうという不都合が生じな
い。
によれば、比較する前の輝度情報が予め定められた閾値
以上の値を所定の割合以上有するときには、試料が存在
すると判断され、切片像取得が続けられるので、切片像
間のピクセル値の差が小さい場合でも切片像の取得を終
了し、画像情報が不足してしまうという不都合が生じな
い。
【００６９】請求項３に記載の発明のレーザ走査顕微鏡
によれば、比較結果が予め定められた閾値以下の値を所
定割合以上有するとき、試料が存在しないと判断され、
切片像の取得を終了させるので、切片像の画像情報にノ
イズ成分が多く含まれ、切片像間のピクセル値の差が零
にならない場合でも、確実に切片像の取得を終了し、意
味のない画像情報を取得してしまう不都合が生じない。
によれば、比較結果が予め定められた閾値以下の値を所
定割合以上有するとき、試料が存在しないと判断され、
切片像の取得を終了させるので、切片像の画像情報にノ
イズ成分が多く含まれ、切片像間のピクセル値の差が零
にならない場合でも、確実に切片像の取得を終了し、意
味のない画像情報を取得してしまう不都合が生じない。
【図１】図１はこの発明の第１実施形態に係る共焦点レ
ーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
ーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
【図２】図２はコンピュータによる切片画像の取得方法
を説明するフローチャートである。
を説明するフローチャートである。
【図３】図３はコンピュータによる切片画像の他の取得
方法を説明するフローチャートである。
方法を説明するフローチャートである。
【図４】図４は試料の厚さと切片像の枚数との関係を説
明する図である。
明する図である。
【図５】図５は試料の厚さと切片像の枚数との関係を説
明する図である。
明する図である。
１ レーザ光源 ２ ビームエクスパンダ ３ ダイクロイックミラー（光分離手段） ４ ２次元スキャンユニット（走査手段） ７ 対物レンズ ８ Ｚ軸コントローラ（駆動手段） １１ ピンホールフィルタ ２０ コンピュータ（制御手段） ２２ モニタ（観察手段）
Claims (3)
- 【請求項１】 励起レーザ光を反射するとともに蛍光を
透過する光分離手段と、 前記励起レーザ光を試料上で２次元走査する走査手段
と、 前記走査手段と前記試料との間に配置された対物レンズ
と、 前記試料と前記対物レンズとの光軸方向における相対位
置を移動可能な駆動手段と、 前記光分離手段を透過した蛍光を受光して、試料の切片
像を取得する観察手段とを備えたレーザ走査顕微鏡にお
いて、 前記駆動手段を駆動して前記相対位置を光軸方向へ所定
距離ずつ移動させ、その移動の度に、移動前後に取得さ
れる切片像同士の画像情報を比較し、この画像情報の比
較結果に基づいて前記切片像の取得を終了させる制御手
段を備えていることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。 - 【請求項２】 前記画像情報は各画素の輝度情報であ
り、前記比較する前の前記輝度情報が予め定められた閾
値以上の値を所定の割合以上有するとき、前記制御手段
は切片像の取得を続けることを特徴とする請求項１記載
のレーザ走査顕微鏡。 - 【請求項３】 前記画像情報は各画素の輝度情報であ
り、前記比較結果が予め定められた閾値以下の値を所定
割合以上有するとき、制御手段は切片像の取得を終了す
ることを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9212597A JPH1138324A (ja) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | レーザ走査顕微鏡 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9212597A JPH1138324A (ja) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | レーザ走査顕微鏡 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1138324A true JPH1138324A (ja) | 1999-02-12 |
Family
ID=16625339
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9212597A Withdrawn JPH1138324A (ja) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | レーザ走査顕微鏡 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1138324A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002258163A (ja) * | 2001-03-01 | 2002-09-11 | Olympus Optical Co Ltd | 顕微鏡制御装置、顕微鏡制御システム、顕微鏡の制御方法、プログラム、及び記録媒体 |
| WO2004001402A1 (ja) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | Olympus Corporation | 生体分子解析装置 |
| WO2004036283A1 (ja) * | 2002-09-06 | 2004-04-29 | Celestar Lexico-Sciences, Inc. | 顕微鏡画像処理システム、顕微鏡画像処理方法、プログラム、および、記録媒体 |
| WO2004061515A1 (ja) * | 2002-12-27 | 2004-07-22 | Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. | 多層観察型光学顕微鏡及び多層観察ユニット |
| JP2013120285A (ja) * | 2011-12-07 | 2013-06-17 | Canon Inc | 顕微鏡装置 |
| EP3425438A4 (en) * | 2016-02-29 | 2019-04-17 | FUJIFILM Corporation | APPARATUS AND METHOD FOR CELL OBSERVATION |
-
1997
- 1997-07-23 JP JP9212597A patent/JPH1138324A/ja not_active Withdrawn
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002258163A (ja) * | 2001-03-01 | 2002-09-11 | Olympus Optical Co Ltd | 顕微鏡制御装置、顕微鏡制御システム、顕微鏡の制御方法、プログラム、及び記録媒体 |
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| US6980294B2 (en) | 2002-06-21 | 2005-12-27 | Olympus Corporation | Biomolecule analyzer |
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| US11061214B2 (en) | 2016-02-29 | 2021-07-13 | Fujifilm Corporation | Cell observation apparatus and method |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20041005 |