WO2004061515A1 - 多層観察型光学顕微鏡及び多層観察ユニット - Google Patents

多層観察型光学顕微鏡及び多層観察ユニット Download PDF

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WO2004061515A1
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observation
optical
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Tetsuro Takamatsu
Katsumasa Fujita
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Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd.
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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/14—Condensers affording illumination for phase-contrast observation
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
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    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/06—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the phase of light

Definitions

  • the present invention relates to an optical microscope, and more particularly to a multilayer observation optical microscope capable of three-dimensionally observing the dynamics of a sample to be observed in real time, and a multilayer observation cut usable for these microscopes.
  • microscopes correspond to the depth of the sample surface to be observed by focusing, and confocal microscopes in particular have excellent resolution in the optical axis direction and can observe optical section images of specimens having a three-dimensional structure. It is an optical observation tool that has rapidly spread in recent years in the fields of medicine and biology.
  • the principle configuration is that the laser beam emitted from the laser light source 1 is converged by, for example, a microlens of a lens array disk 9 in a double rotating plate 2 (described in detail later), and Transmit through the mirror 11 and focus on the pinhole of the Nipkow disk 10 which is the other rotating plate.
  • This measurement is performed by reflecting the fluorescence after passing through the pinhole by the dichroic mirror 11, converging it by the convex lens 12, and making it incident on the high-speed CCD camera 3.
  • the object to be observed is a mouse or the like
  • the isolated heart 20 or the like is perfused using a force neura 21 and monitored using an electrocardiographic measurement device 22. Irradiating the area to be observed with a laser beam is also effective to some extent.
  • due to the high resolution of the confocal microscope in the direction of the optical axis it is necessary to observe multiple levels at different depths in order to capture real-time three-dimensional images of living cells and tissues.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. H06-3141955
  • Non-Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. H06-3141955
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. H06-3141955
  • Non-Patent Document 1 Olet-Patent Document 1
  • Synthesis column Internet URL: http: ⁇ www.nagano-itgo.jp / seimitu / setubi / se-shuuseki 10 /se-04iaser.html (Specification column)) See
  • real-time 3D observation was not possible. Disclosure of the invention
  • a basic object of the present invention is to provide an optical system structure that optically solves the difficulty of three-dimensional scanning in an optical microscope system including a conventional confocal laser microscope as described above.
  • a further object of the present invention is to provide an optical system structure capable of observing the three-dimensional dynamics of living tissue cells at a high speed with a fluorescence microscope.
  • a first aspect of the present invention is to dispose a convergent Z collimating lens pair on an objective lens in an optical axis through which an irradiation light beam to be incident on a sample to be observed from the lens is incident.
  • a phase changing means between these lenses to change the phase of the transmitted light within a predetermined range of the optical axis cross section, the phase of the irradiating light beam incident on the objective lens can be adjusted according to the phase of the wavefront.
  • the optical microscope is configured to irradiate the sample with a focal point at a depth.
  • the wavefront of the irradiating light beam that has exited the collimating lens via the phase changing means has a surface crossing the optical axis from the optical axis for each state of the phase changing means heading toward the collimating lens.
  • the degree of the phase shift occurring toward the periphery in the inside is different, and if the phase shift is large, the depth of the focal point which is incident on the objective lens and formed is correspondingly deep.
  • the width of this depth change can be widened according to the wavelength of the irradiated light beam. In the clear, it can be up to about 100 ⁇ in the visible wavelength range (depending on the magnification and magnification of the objective lens used).
  • the second invention is characterized in that an optical axis for arranging the converging / collimating lens pair is provided with an irradiating light beam applied to the sample to be observed through an objective lens in a confocal microscope. It is configured to have a common optical axis with an observation light beam emitted from the sample and passing through the objective lens in the opposite direction.
  • the technical effect of the first invention is that the confocal microscope Is best demonstrated in
  • the observation light beam is a light beam containing information on the sample to be observed, and is a fluorescent light or a reflected light excited by the irradiation light.
  • a third aspect of the present invention is the above-mentioned basic configuration, wherein the phase changing means arranges a plurality of phase plate segments having different optical characteristics in a stepwise manner, and each segment is sequentially arranged on the optical axis. It consists of a rotating plate that is installed across the road. '
  • the phase changing means composed of the rotating plate is capable of gradually changing the thickness of the isotropic transparent film which is an element of each phase plate segment, so that their optical characteristics can be improved. Can be different.
  • the phase changing means including the rotating plate is configured to change the refractive index of the isotropic transparent film, which is an element of each phase plate segment, in a stepwise manner.
  • Target characteristics can be different.
  • a sixth aspect of the present invention provides an object to be observed by synchronizing two-dimensional scanning of a sample stage of an optical microscope to which the present invention is applied and phase scanning of the phase changing means.
  • the three-dimensional dynamics of the sample can be observed.
  • a CCD camera arranged at the end of the fluorescence observation optical path for example, an existing intensified high-speed CCD camera with an imaging speed of 100 frames / second, a three-dimensional image of the generated tissue can be obtained. Dynamics can be observed at high speed.
  • the first observation position in the optical axis direction by moving the sample stage or objective lens A control means, a pair of converging / collimating lenses arranged in an optical axis through which an irradiation light to be incident on the sample to be observed from the lens to the objective lens, and a phase of the transmitted light between the lenses
  • a second optical axis direction observation position control means comprising a phase changing means for changing within a predetermined range of the axial cross section, observation of a sample to be observed in a deep optical axis direction is enabled. Observation in the optical axis direction can be observed in a short time in detail.
  • the control lengths of the first optical axis direction observation position control means and the second optical axis direction observation position control means must be standardized in advance. It becomes possible by keeping it. Also, by standardizing the control length of each of the first and second optical axis direction observation position control means, the length of the optical axis direction can be shortened by the second optical axis direction observation position control means in a short time.
  • a pair of converging and z-collimating lenses is arranged in the optical axis where the irradiation light beam is incident on the sample to be observed from the objective lens with respect to the objective lens, and the phase of the transmitted light is set between the lenses and the cross section of the optical axis.
  • the sample is focused at a depth corresponding to the phase of the wavefront of the irradiation light beam entering the objective lens.
  • three-dimensional inspection methods for samples in the medical and biological fields and samples in the electro-static field will be possible. That is, a step of preparing a sample to be observed having an optically three-dimensional structure, a step of placing the sample to be observed on a sample stage, and a step of preparing the sample to be observed by using the configuration of the optical microscope of the sixth invention.
  • the process of measuring the original digital data and the sample Setting three-dimensional inspection criteria digital data that can be judged as a normal three-dimensional shape, and comparing the measured three-dimensional digital data of the observed sample with the inspection criteria digital data. It is possible to determine whether the observed sample is normal. By repeatedly measuring three-dimensional data, dynamics can be detected.
  • a sample to be observed When preparing a sample in the medical and biological field, a sample to be observed can be prepared that can be optically and clearly observed by mixing a fluorescent material into the sample.
  • the preparation of a sample in the field of electro-exposition is a process of forming irregularities on the surface of a substrate to be manufactured.
  • a seventh aspect of the present invention provides a basic configuration that enables the focal depth of an objective lens to be adjusted regardless of a change in an optical path length, by sequentially adjoining a plurality of phase plate segments having different optical characteristics in a circumferential direction.
  • the phase plate segments are sequentially formed by the two rotating lenses arranged in such a manner that they enter the objective lens and are inserted between the two lenses in the converging / collimating lens pair arranged in the optical axis.
  • a multi-layer observation unit that acts as a phase changing means for changing the phase of transmitted light for each segment within a predetermined range of the cross section of the optical axis at different degrees when crossing the optical axis.
  • An object of the present invention is to provide a multi-layer observation unit in which the depth of focus is changed according to the phase of the wavefront of a light beam that enters the objective lens through the cut.
  • the multi-layer observation type real-time optical microscope of the present invention in particular, a confocal microscope, it is possible to observe the three-dimensional structure of a cell or a living tissue with high precision as it is.
  • the operation of the three-dimensional living tissue is originally visualized by replacing it with a two-dimensional plane by cell culture or the like in a petri dish. This is because it is hard to say that the subject has a natural appearance, but in the present invention, the operation of the living body is visualized at high speed and three-dimensionally.
  • FIG. 1 is an optical system configuration diagram showing a preferred embodiment of the multilayer observation type real-time confocal microscope of the present invention.
  • FIG. 2 is a configuration diagram of a multilayer observation unit which is a main part of the embodiment of FIG. 1 and shows a mode in which the depth of focus increases in the order of (a), (b), and (c).
  • FIG. 3 shows the two-dimensional scanning (optical) of (a) the shallowest Z1 level, (b) the intermediate Z2 level, and (c) the deepest Z3 level in the multilayer observation type real-time confocal microscope of the embodiment.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a procedure for performing a tomographic image) and synthesizing a three-dimensional image.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a state in which an actual living tissue is observed with the multilayer observation real-time confocal microscope of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a state in which rat heart tissue is observed by a conventional confocal microscope.
  • the present invention constitutes a multi-layer observation kit that enables high-speed observation of three-dimensional dynamics of cell tissues and the like.
  • the overall configuration of the microscope consists of a multi-layer observation unit (observation depth: z-direction) between a microscope that is already in practical use and observes a two-dimensional (xy) plane at high speed and a light source (laser) used for it.
  • an optical phase plate array disk is used as a phase changing means that constitutes a unit for observing a multi-layer structure.
  • segments (arc-shaped pieces) of an optical phase plate having sequentially different optical characteristics are arranged and arranged in a disk shape, and each segment is arranged so as to sequentially cross the optical axis by rotating, thus achieving high speed. Change the observation depth to each depth
  • Applicable optical microscopes include confocal microscopes, general fluorescent microscopes, two-photon microscopes, and other optical microscopes that irradiate a sample to be observed with light using an objective lens. Section describes the most effective confocal microscope.
  • FIG. 1 is a laser light source
  • 2 is a high-speed confocal scanner with a double rotating disk
  • 3 is an intensified high-speed CCD camera
  • 4 is a laser beam that has exited the pinhole of a high-speed confocal scanner 2.
  • a convex lens that collimates that is, collimates
  • 5 is a converging lens
  • 6 is a second convex lens that collimates one laser beam that has emerged from the converging lens 5 and has been inverted, and between the lenses 5 and 6.
  • An array disk of an optical phase plate as a phase changing means constituting the multilayer observation unit 7 of the present invention is arranged.
  • the collimated laser light emitted from the lens 6 enters the fluorescence phase contrast microscope unit 8.
  • the high-speed confocal scanner 2 has a microlens array disk 9 on the side of the laser light source 1 and a so-called two-bow disk 10 in which a number of pinholes are arranged spirally on the side of the collimating lens 4 and is coaxially and opposed to each other.
  • the micro-lens array of the disk 9 is of course also a spiral shape corresponding to the pin ho / rare array.
  • the high-speed rotation of both disks 9, 10, for example, results in a maximum of 100
  • the optical axis can be scanned X_y in frame Z seconds.
  • a dichroic mirror 11 that transmits the excitation laser beam and reflects the fluorescence returned from the observation sample is disposed between the two disks 9 and 10, and a convex lens 12 is disposed in the fluorescence reflection optical path.
  • An image is formed on the light receiving surface of the CCD camera 3.
  • the CCD camera 3 can capture an X-y scan image of the optical axis at a maximum speed of 1000 frames / second in correspondence with the high-speed confocal scanner 2.
  • the multilayer observation unit 7 of the present invention is shown only on the side together with the drive motor 13 in the optical system of FIG. 1, a specific configuration example is shown at the top of the figure.
  • a plurality of phase plate segments a, b, c--'having different optical characteristics are arranged in a disk shape.
  • the aspect in which the optical characteristics differ stepwise from segment to segment is as follows: when the isotropic transparent film (not shown separately in the perspective view) constituting the element of each phase plate segment is made of the same film material, it is oblique.
  • a force that changes the thickness stepwise, a stepless change in the refractive index while keeping the thickness constant, or a combination of both is adopted.
  • the laser beam passing from the collimating lens 6 through the multi-layer observation unit 7 enters the objective lens 14 in the fluorescence phase contrast microscope unit 8, and at a variable depth, as shown schematically here, Cells contained in a petri dish or the like are focused on the tissue sample 15. Also, in this case, for convenience of the optical system configuration, an optical path bending mirror 16 composed of a plane mirror is disposed in front of the objective lens 14 in the microscope unit 8 (see FIG. 1).
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing a procedure for depth adjustment to be performed.
  • (a) is the case where the phase plate element of the segment in the optical path of the multilayer observation unit 7 is the thinnest
  • (b) and (c) are the cases where the thickness becomes thicker in that order. Align the reference image plane with each intermediate level and draw! /.
  • phase plate element 7 (a) since the phase plate element is thin, it exits from the periphery of the converging lens 5, enters the phase plate element 7 (a), intersects with the optical axis, and then exits the element 7 (a). Is relatively short (therefore, the distance difference from the optical axis passage part is also short), and the phase difference between the part and the optical axis emission part (the former phase delay) is relatively small. Therefore, the level at which these light waves are focused by the objective lens 14 is the highest Z 1 in the sample 15.
  • the phase plate element since the phase plate element is slightly thicker than (a), it exits from the periphery of the converging lens 5 and enters the phase plate element 7 (b), and after crossing the optical axis, b)
  • the distance to exit is slightly longer (therefore, the distance difference from the optical axis passage part is also slightly longer), and the phase difference between that part and the optical axis emission part (the former phase delay) is also slightly longer.
  • the level at which these light waves are focused by the objective lens 14 is the next level (here, the intermediate position) Z 2 in the sample 15.
  • the phase plate element since the phase plate element is even thicker than (b), it exits from the periphery of the converging lens 5 and enters the phase plate element 7 (c), intersects with the optical axis, and c)
  • the distance before exiting is longer (therefore, the distance difference from the optical axis passage portion is further longer), and the phase difference between that portion and the optical axis exit portion (the former phase delay) is further longer. Therefore, the level at which these light waves are focused by the objective lens 14 is the next level (here, the lowest level) Z 3 in the sample 15.
  • the phase plate element of the multilayer observation unit 7 becomes thicker each time it is displaced with the segments a., B, c,. It can be seen that the depth of focus of the wavefront exiting from the optical axis point to the periphery effectively displaces a sufficient distance.
  • This depth displacement is not limited to the case where the thickness of each phase plate segment element (isotropic transparent film) in the multilayer observation unit 7 changes stepwise as in the above-described embodiment, and the thickness remains unchanged. It is clear that this also occurs when the refractive index is changed step by step, or when a combination of both is adopted.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the principle of the procedure for obtaining a real-time three-dimensional image by measuring optical tomographic images while sequentially changing the observation depth using the high-speed confocal microscope of the present invention and synthesizing them.
  • the observed sample is two-dimensionally scanned at the focus level Z1 established by the phase plate segment element in Fig. 2 (a).
  • the phase plate segment in Fig. 2 (b) is scanned.
  • the observed sample is two-dimensionally scanned at the focal level Z2 established by the element
  • Fig. 3 (C) the observed sample is two-dimensionally scanned at the focal level Z3 established by the phase plate segment element in Fig. 2 (C).
  • the plurality of lines 18 drawn at each level are scanning lines formed according to the number of microlenses / pinhole arrays in the double plates 9 and 10 of the high-speed confocal scanner 2 shown in FIG.
  • Reference numeral 19 denotes a focal point where the laser beam 17 is formed on the scanning line.
  • the fluorescent light that follows the same path as the outward laser beam in the opposite direction is similarly adjusted in wavefront phase by the multilayer observation unit 7, As described above, the light is received and image-processed by the high-speed CCD camera 3 through the pinhole at the optical axis position in the epoch disk 10 of the high-speed confocal scanner 2 and reflected by the dike mirror 11 through the convex lens 12. It is on the street.
  • the processes shown in FIGS. 3 (a) to 3 (c) are preferably performed in about 10 seconds, and are synthesized as a three-dimensional image after the image is acquired by the high-speed CCD camera 3.
  • FIG. 4 shows a case where the cells of the myocardial infarction 24 in the left ventricle 23 and the left coronary artery tissue of the living body are observed in real time by the real-time confocal microscope of the present invention.
  • FIG. The laser beam 17 emitted from the laser beam tip (objective lens) 25 of the confocal microscope is multi-layered two-dimensionally scanned according to the above-described embodiment, and the cells in this region 24 are observed in real time by a three-dimensional image. For example, it is easy to find out that gangrene has occurred.
  • 26 is the atrium and 27 is the aorta.
  • the entire left ventricle 23 can be observed by moving the sample stage or the objective lens in the optical axis direction.
  • the multi-layer observation unit By standardizing the moving distance of the sample stage or objective lens in the optical axis direction and the moving distance of the focal point by the multi-layer observation unit, and synchronizing the observation, it is possible to observe a wide area and local detailed observation as shown in Fig. 4. Three-dimensional observation can be performed by overlapping.
  • the depth of the sample to be observed in the optical axis direction can be measured quickly.
  • the depth of the different observation surfaces can be measured.
  • the focal length in the optical axis direction can be controlled in an analog manner.
  • a material having the Pockels effect for example, there is Li NbO 3 (lithium niobate) crystal.
  • CS 2 which is a liquid.
  • the microscope of the present invention can perform three-dimensional observation and length measurement simultaneously at an early time. Therefore, it is most suitable not only for testing but also for the inspection process at the production stage of microdevices.
  • the moving distance range in the optical axis direction can be widened.
  • the magnification of the converging Z-collimating lens of the multilayer observation unit according to the size of the sample to be observed, the sample to be observed can be three-dimensionally observed in one scan.
  • the size of the multilayer observation unit can be reduced. This downsizing of the phase changing means facilitates speeding up the phase changing.
  • a sample to be observed having an optically three-dimensional structure is prepared.
  • a sample to be observed that can be clearly observed optically by mixing a fluorescent material into the sample is prepared.
  • irregularities are formed on the surface of the wafer by etching or the like. Place the sample to be observed on the sample stage to determine whether it is normal or not, including the absolute value of the depth of the irregularities.
  • the three-dimensional digital data of the sample to be observed is measured using the configuration of the optical microscope of the present invention.
  • digital data obtained by observing a sample with a normal three-dimensional shape is set as inspection determination reference digital data.
  • inspection determination reference digital data By comparing the measured three-dimensional digital data of the inspection sample for inspection with the inspection determination reference digital data, it is possible to determine whether the inspection sample is normal.
  • By repeatedly measuring three-dimensional digital data it is possible to examine dynamics that change over time. In the case of this dynamic inspection, it becomes possible by performing synchronous evaluation of three-dimensional data scanning at an accurate time. For dynamic inspection, it is necessary to set three-dimensional digital data for inspection criteria that changes with time before the inspection.
  • the multilayer observation real-time optical microscope of the present invention particularly the confocal microscope, it is possible to observe the three-dimensional structure of cells or living tissue with high accuracy as it is.
  • the operation of the three-dimensional living tissue is originally visualized by replacing it with a two-dimensional plane by cell culture or the like in a petri dish.
  • the present invention provides a three-dimensional visualization of living organisms at high speed. Because it was done.
  • the real-time optical microscope of the present invention it is only necessary to insert the above-mentioned multilayer observation unit into the optical path immediately before the objective lens of the conventional optical microscope, so that it can be implemented at a relatively low cost.
  • the industrial benefits are also very large.

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Abstract

光学顕微鏡において、対物レンズ（１４）を通して被観察試料（１５）に照射される光線と、同試料から放射又は反射されて対物レンズを逆向きに通過した光線との共通光軸中に、収束／視準化レンズ対（５，６）を配置し、それらのレンズ間に透過光の位相を所定の範囲内で変化させるための位相変更手段（７）を設けたことにより、対物レンズに入射する光線の波面の位相に応じた深度において前記試料を合焦点照射するように構成したものである。

Description

多層観察型光学顕微鏡及び多層観察ュニット 技術分野
本発明は光学顕微鏡、 特にリアルタイムにおいて三次元的に被観察試料の動態 を観察することが可能な多層観察型光学顕微鏡、 及びこれらの顕微鏡に使用可能 な多層観察ュ-ットに関するものである。 発明の背景
顕微鏡一般は焦点整合により被観察試料面の深さに対応するものであり、 特に 共焦点顕微鏡は光軸方向に優れた分解能をもち、 三次元構造を有する標本の光学 的切片像を観察できるため、 医学及び生物学の分野において近年急速に普及した 光学的観察手段である。 その原理的構成は、 図 5に示すように、 レーザー光源 1 から出たレーザービームを、 例えば、 二重回転板 2 (後に詳述する） におけるレ ンズアレーディスク 9のマイクロレンズで収束し、 ダイクロイツクミラー 1 1を 透過させて、 もう一方の回転板であるニポゥディスク 1 0のピンホール中に合焦
-出射し、 更に対物レンズ 1 4を介して被観察体に照射し、 それにより励起発光 した蛍光を観測用光線として折り返し経路に乗せ、 同一のピンホールを通して
(所謂、 共焦点で） 計測するものである。
この計測はピンホール通過後の蛍光を、 ダイクロイツクミラー 1 1で反射し、 凸レンズ 1 2で収束させて高速 C C Dカメラ 3に入射させることにより行われる。 このような共焦点顕微鏡により生態組織を観察する場合、 被観察体がマウス等で あれば、 その摘出心 2 0等を力ニューレ 2 1を用いて灌流し、 心電図計測装置 2 2でモニターしながら被観察部位にレーザービームを照射して行うことも、 ある 程度は効果的に実施される。 ' しかしながら、 共焦点顕微鏡はその光軸方向の高分解能性の故に、 生きた細胞 や組織の三次元像をリアルタイムで捕らえるには、 深さの異なるレベルを多層的 に観察する必要があり、 これまでは標本ステ一ジゃ対物レンズといつた重量のあ るものを動かさなければ成らなかったため [例えば、 特許文献 1 (特開平 0 6— 3 4 1 9 5 5号公報） 、 及び非特許文献 1 (オリンパス光学工業 （株） カタログ、 「走査型レーザ顕微鏡」 2 0 0 2年 9月 3 0 日検索、 インターネッ ト URL:http：〃 www.nagano-itgo.jp/seimitu/setubi/se-shuuseki 10/se-04iaser.html (仕様の 欄） ） 参照] 、 リアルタイムでの三次元観察は不可能であった。 発明の開示
本発明の基本目的は、 上記のような従来の共焦点レーザ顕微鏡を含む光学顕微 鏡システムにおける三次元走査の困難性を光学的に解決した光学系構造を提供す ることにある。
本発明の更なる目的は、 生きた組織細胞の三次元的な動態をも高速に蛍光顕微 鏡観察できる光学系構造を提供することにある。
上記の目的を達成するための、 第 1の発明は、 対物レンズに対し、 そのレンズ から被観察試料に入射すべき照射光線を入射させる光軸中に、 収束 Z視準化レン ズ対を配置し、 それらのレンズ間に透過光の位相を光軸横断面の所定範囲内で変 化させるための位相変更手段を設けたことにより、 対物レンズに入射する照射光 線の波面の位相に応じた深度において前記試料を合焦点照射するようにした光学 顕微鏡を構成したものである。
上記の基本構成によれば、 位相変更手段を経て視準化レンズを出た照射光線の 波面は、 視準化レンズに向かう位相変更手段の状態ごとに、 光軸からその光軸を 横断する面内における周辺にかけて生ずる位相変位の度合が相違し、 その位相変 位度が大きければ、 更に対物レンズに入射して結ばれる焦点の深度がそれに応じ て深くなる。 この深度変化の幅は、 照射光線の波長に応じて広くできるが、 本発 明では可視波長域で 1 0 0 μ ιη程度まで可能である （使用する対物レンズの Ν Α， 倍率に依存する） 。
更に、 上記の目的を達成するための、 第 2の発明は、 前記収束/視準化レンズ 対を配置する光軸が、 共焦点顕微鏡において、 対物レンズを通して被観察試料に 照射される照射光線と、 同試料から放射されて対物レンズを逆向きに通過した観 測用光線との共通光軸からなるように構成したものであり、 上記第 1の発明の技 術的効果は、 この共焦点顕微鏡において最もよく発揮される。
観測用光線とは、 被観察試料の情報を含んだ光線であり、 照射光線により励起 された蛍光線あるいは反射光である。
更に、 上記の目的を達成するための、 第 3の発明は、 上記の基本構成における 位相変更手段が、 段階的に光学的特性の異なる複数の位相板セグメントを配列し、 各セグメントが順次光軸を横切るように設置された回転板からなるようにしたも のである。 '
第 4の発明によれば、 この回転板からなる位相変更手段は、 各位相板セグメン トの要素をなす等方性透明膜の厚さを段階的に変化させたことにより、 それらの 光学的特性を異ならしめることができる。
更に、 第 5の発明によれば、 この回転板からなる位相変更手段は、 各位相板セ グメントの要素をなす等方性透明膜の屈折率を段階的に変化させたことにより、 それらの光学的特性を異ならしめることができる。
前述した更なる目的を達成するための、 第 6の発明は、 本発明を適用する光学 顕微鏡の試料台の二次元走査と、 前記位相変更手段の位相走査とを同期させるこ とにより、 被観察試料の三次元動態を観察できるようにしたものである。 これに より、 蛍光観察光路の終端に配置された C C Dカメラ、 例えば、 既存の撮像速度 1 0 0 0フレーム/秒の、 インテンシファイ ド高速 C C Dカメラ等によれば、 生 きた組織の三次元的動態などをも、 高速に観察することが可能となる。
更に、 標本ステージあるいは対物レンズの移動による第 1の光軸方向観察位置 制御手段と、 対物レンズに対しそのレンズから被観察試料に入射すべき照射光線 を入射させる光軸中に配置された収束/視準化レンズ対と、 それらのレンズ間に 透過光の位相を光軸横断面の所定範囲内で変化させるための位相変更手段とから なる第 2の光軸方向観察位置制御手段とを設けることにより、 深い光軸方向の被 観察試料の観察を可能にすると共に、 光軸方向の観察を早い時間で詳細に観測す ることができる。 更に、 光学顕微鏡の試料台への試料光線の二次元走査と第 1の 光軸方向観察位置制御手段と第 2の光軸方向観察位置制御手段とを同期させるこ とにより、 被観察試料の三次元観察を深く且つ特定領域を局部的に詳細に観察す ることができる。 同期して得られた情報を三次元画像にするためには、 事前に第 1の光軸方向観察位置制御手段と第 2の光軸方向観察位置制御手段との各々の制 御長を規格化しておくことにより可能になる。 また、 第 1及び第 2の光軸方向観 察位置制御手段の各々の制御長を規格化しておくことにより、 第 2の光軸方向観 察位置制御手段によって光軸方向の長さを早い時間で計測できる。 即ち、 対物レ ンズに対し、 そのレンズから被観察試料に照射光線を入射させる光軸中に、 収束 z視準化レンズ対を配置し、 それらのレンズ間に透過光の位相を光軸横断面の所 定範囲内で変化させるための位相変更手段を設けたことにより、 対物レンズに入 射する照射光線の波面の位相に応じた深度において、 前記試料を合焦点照射する ように構成した多層観察型光学顕微鏡を用いて、 前記位相変更手段の第 1の設定 値により得られる第 1の観察面を観察する工程と、 前記位相変更手段の第 2の設 定値により得られる第 2の観察面を観察する工程と、 前記第 1の観察面と第 2の 観察面との光軸方向の距離を前記位相変更手段の第 1の設定値と前記位相変更手 段の第 2の設定値との差から測定することができる。
また、 医学生物分野の試料及びエレクトロ-タス分野の試料等の三次元検査方 法が可能になる。 即ち、 光学的に三次元構造を有する被観察試料を作成する工程 と、 その被観察試料を標本ステージに設置する工程と、 第 6の発明の光学顕微鏡 の構成を用いてその被観察試料の三^元デジタルデータを測定する工程と、 試料 が正常な三次元形状と判断できる三次元の検査判定基準デジタルデータを設定す る工程と、 その測定された被観察試料の三次元デジタルデータと検査判定基準デ ジタルデータとを比較する工程とから、 被観察試料が正常かどうかを判断するこ とができる。 繰り返し三次元データを測定することにより動態の検查も可能にな る。
医学生物分野の試料の作製は、 蛍光材料を試料に混入することにより光学的に 鮮明に観察できる被観察試料を準備できる。 エレクトロェクス分野の試料作成は、 製造する基体表面に凹凸を形成する工程となる。
二次元データの判断のみならず、 深さ方向のデータも含んだ三次元データによ る検査が可能になる。 半導体集積回路においてはますます表面構造が三次元化し ていくが、 本発明の三次元検査方法により高速で検査できるようになる。
更に、 第 7の発明は、 光路長変化によらない対物レンズの焦点深度調整を可能 にする基本的構成として、 段階的に光学的特性の異なる複数の位相板セグメント を円周方向に順次隣接するように配列した回転板からなり、 対物レンズへの入射 光軸中に配置された収束/視準化レンズ対における両レンズ間に揷入することに より、 前記位相板セグメントの各々が順次両レンズ間の光軸を横切る際に、 各セ グメントごとに透過光の位相を光軸横断面の所定範囲内において、 異なった度合 いで変化させるべき位相変更手段として作用する多層観察ュニットであって、 こ のュ-ットを経て対物レンズに入射する光線の波面の位相に応じて、 その焦点深 度を変更させるようにした多層観察ュニットを提供するものである。
本発明の多層観察型リアルタイム光学顕微鏡、 特に共焦点顕微鏡によれば、 細 胞ゃ生体組織の三次元構造を、 そのままの状態で高精度に観察することができる。 すなわち、 多層的に観察できない従来の方法では、 本来三次元的な生体組織の営 みを、 シャーレ内での細胞培養等により二次元平面に置き換えることで可視化し ているに過ぎず、 生体の自然な姿を捉えているとは言いがたいものであつたのに 対し、 本発明では、 生体の営みを高速且つ立体的に可視化したものだからである。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の多層観察型リアルタイム共焦点顕微鏡の好ましい実施例を示 す光学系構成図である。
図 2は、 図 1の実施例の要部をなす多層観察ユニットの構成図であり （a ) ，. ( b ) ， ( c ) の順に焦点深度が深まっていく態様を示している。
図 3は、 実施例の多層観察型リアルタイム共焦点顕微鏡において、 （a ) 最も 浅い Z 1レベル、 ( b ) 中間 Z 2レベル、 （c ) 最も深い Z 3レベルにおいて、 順次に二次元走査 （光学断層像の撮影） を行い、 三次元像を合成する手順を示す 模式図である。
図 4は、 本発明の多層観察型リアルタイム共焦点顕微鏡により、 実際の生体組 織を観察する状態を示す模式図である。
図 5は、 従来の共焦点顕微鏡により、 ラットの心臓組織を観察す.る状態を示す 略図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 細胞組織等の三次元動態の高速観察を可能とする多層観察ュ-ット を構成したものである。 顕微鏡全体の構成としては、 すでに実用化されている二 次元 （x-y)平面を高速に観察する顕微鏡と、 それに使用する光源 （レーザー） と の間に、 前記多層観察ユニット （観察深さ： z方向を多層的に変えて観察するュ ニット） を構成する位相変更手段としての光学位相板配列ディスクを揷入する形 をとる。 このュニットは順次異なった光学特性をもつ光学位相板のセグメント (円弧状片） をディスク状に配列構成し、 回転することにより各セグメントが順 次光軸を横切るように設置され、 かく して高速に観察深さを変更し、 各深さ
(層） における二次元スライス像を得て組織細胞の三次元画像を構築■再現する ことができる。 適用可能な光学顕微鏡としては、 共焦点顕微鏡のほか一般的な蛍光顕微鏡や二 光子顕微鏡、 その他対物レンズを用いて被観察試料に光照射する光学顕微鏡を用 いることができ、 以下の好ましい実施例においては最も効果的な共焦点顕微鏡に ついて説明する。
本発明の多層観察型リアルタイム共焦点顕微鏡の好ましい実施例は、 図 1に示 すとおりである。 図 1の光学系において、 1はレーザー光源、 2は二重回転円板 式高速共焦点スキャナー、 3はインテンシファイ ド高速 C C Dカメラ、 4は高速 共焦点スキャナー 2のピンホールを出たレーザー光をコリメート、 すなわち視準 化する凸レンズ、 5は収束レンズ、 6は収束レンズ 5から出て反転像化したレー ザ一光を視準化する第 2の凸レンズであり、 このレンズ 5， 6間に本発明の多層 観察ュニット 7を構成する位相変更手段としての光学位相板の配列ディスクが配 置される。 レンズ 6から出た視準レーザー光は蛍光位相差顕微鏡ュニット 8に入 射するようになっている。
高速共焦点スキャナー 2は、 レーザー光源 1側にマイクロレンズアレーデイス ク 9を、 コリメートレンズ 4側に多数のピンホールが渦巻き状に配置された所謂 二ボウディスク 1 0を同軸 ·対向的に設置したものであり （図 5参照） 、 当然な がらディスク 9のマイクロレンズアレーも、 ピンホー/レアレーに対応した渦巻き 状であり、 両ディスク 9， 1 0の高速回転により、 例えば、 最速で 1 0 0 0フレ ーム Z秒で光軸を X _ y走査することができる。
両ディスク 9， 1 0間には励起用レーザー光を透過し、 観察試料から返ってき た蛍光を反射するダイクロイツクミラー 1 1が配置され、 その蛍光反射光路中に は凸レンズ 1 2が配置され、 C C Dカメラ 3の受光面に結像するようになってい る。 C C Dカメラ 3は高速共焦点スキャナー 2に対応して最速で 1 0 0 0フレー ム /秒で光軸を X— y走査画像を撮影することができる。
本発明の多層観察ュニット 7は、 図 1の光学系内においては駆動用モーター 1 3と共に、 側面でのみ示しているが、 その具体的構成例としては、 図の上方に取 出して斜視図で示すように、 光学特性の異なる複数の位相板セグメント a, b, c - - · 'をディスク状に配列したものである。 光学特性がセグメントごとに段階 的に異なる態様としては、 各位相板セグメントの要素をなす等方性透明膜 （当該 斜視図においては区分図示していない） が同一膜物質から成る場合において、 斜 視図で拡大して示すように、 その厚さを段階的に変化させる力、 厚さは不変にし て屈折率を段階的に変えるか、 あるいはその両方の組み合わせを採用する。
多層観察ユニット 7を通り、 視準化レンズ 6から出たレーザービームは、 蛍光 位相差顕微鏡ュニット 8内の対物レンズ 1 4に入射し、可変の深度において、 こ こでは模式的に示した通り、 シャーレ等に収容された細胞 '組織試料 1 5内に焦 点を結ぶようになつている。 また、 この場合は光学系構成の便宜上、 顕微鏡ュニ ット 8内には、 対物レンズ 1 4の前に平面ミラーからなる光路折り曲げ鏡 1 6が 配置される （図 1参照） 。
図 2は、 上述の光路折り曲げ鏡 1 6を省略して、 収束 Z視準化レンズ対 5， 6 間に配置された多層観察ュニット 7の位相板により、 対物レンズ 1 4により結ば れる焦点が効果的に深度調整される手順を示す模式図である。 ここに （a ) は、 多層観察ュニット 7の光路中セグメントの位相板要素が最も薄いものであるとき、 ( b ) ， ( c ) は順次それより厚くなつた場合であり、 レンズ 5， 6間の基準中 間結像面と各中間レベルを整合させて描！/、たものである。
図 2 ( a ) では、 位相板要素が薄いため、 収束レンズ 5の周縁部から出て位相 板要素 7 ( a ) 内に入り、 光軸と交差してから同要素 7 ( a ) を出るまでの距離 が比較的短くなり （したがって光軸通過部との距離差も短くなり） 、 その部分と 光軸出射部との位相差 （前者の位相遅れ） は比較的小さい。 したがって、 これら の光波が対物レンズ 1 4により合焦するレベルは、 試料 1 5内の最上位 Z 1とな る。
図 2 ( b ) では、 位相板要素が （a ) より少し厚いため、 収束レンズ 5の周縁 部から出て位相板要素 7 ( b ) 内に入り、 光軸と交差してから同要素 7 ( b ) を 出るまでの距離がやや長くなり （したがって光軸通過部との距離差もやや長くな り） 、 その部分と光軸出射部との位相差 （前者の位相遅れ） もやや長くなる。 し たがって、 これらの光波が対物レンズ 14により合焦するレベルは、 試料 1 5内 の次のレベル （ここでは中間位） Z 2となる。
図 2 (c) では、 位相板要素が （b) より更に厚いため、 収束レンズ 5の周縁 部から出て位相板要素 7 (c) 内に入り、 光軸と交差してから同要素 7 (c) を 出るまでの距離が更に長くなり （したがって光軸通過部との距離差も更に長くな り） 、 その部分と光軸出射部との位相差 （前者の位相遅れ） も更に長くなる。 し たがって、 これらの光波が対物レンズ 14により合焦するレベルは、 試料 1 5内 の更に次のレベル （ここでは最下位） Z 3となる。
以上のことから、 本発明の実施例においては、 多層観察ユニット 7の位相板要 素がセグメント a.、 b, c, · · ' と変位するごとに厚くなるため、 対物レンズ 14の対物面における光軸点から周縁部にかけて出射する波面の合焦点の深度は、 効果的に十分な距離を変位することが理解できるであろう。 また、 この深度変位 は、 前述の実施例のごとく、 多層観察ュニット 7における各位相板セグメント要 素 （等方性透明膜） の厚さが段階的に変化する場合のほか、 厚さは不変にして屈 折率を段階的に変える場合、 あるいはその両方の組み合わせを採用する場合にも 生ずることは明らかである。
図 3は、 本発明の高速共焦点顕微鏡により観察深度を順次変更しながら、 光学 断層像を計測し、 これらを合成する画像処理により、 リアルタイム三次元像を得 る手順原理を示す模式図である。 図 3 (a) では、 図 2 (a) の位相板セグメン ト要素により確立した焦点レベル Z 1において観察試料を二次元走査し、 図 3 (b) では、 図 2 (b) の位相板セグメント要素により確立した焦点レベル Z 2 において観察試料を二次元走査し， 更に図 3 (C) では、 図 2 (C) の位相板セ グメント要素により確立した焦点レベル Z 3において観察試料を二次元走査した ものである。 各レベルにおいて描いた複数の線 1 8は、 図 1に示した高速共焦点スキャナー 2の二重板 9、 1 0におけるマイクロレンズ/ピンホールアレイの本数に応じて 形成される走査線であり、 1 9はその走査線上においてレーザービーム 1 7が結 ぶ焦点である。 かくして、 これらの合焦点レーザービームによりその試料点から 励起 '発光した蛍光のうち、 往路のレーザービームと同様の経路を逆にたどる蛍 光が、 多層観察ユニット 7により、 同じく波面位相を調整され、 高速共焦点スキ ャナー 2のェポゥディスク 1 0における光軸位置のピンホールを通り、 ダイク口 イツクミラー 1 1によって反射され、 凸レンズ 1 2を通って高速 C C Dカメラ 3 により受光及び撮像処理されることは前述した通りである。
実施例において、 図 3 ( a,) 〜 （c ) の過程は、 好ましくは 1 0秒程度で行 われ、 高速 C C Dカメラ 3で画像取得後三次元像として合成される。 例えば、 1 秒間 1 0 0 0フレームの高速 C C Dカメラを用いて 3層の三次元観察を行う場合、 1秒間に 1 0 0 0 / 3 = 3 3 3 . 3の立体像が得られる。
図 4は、 生体の左心室 2 3及び左冠状動脈組織における心筋梗塞巣 2 4の細胞 を、 本発明のリアルタイム共焦点顕微鏡によりリアルタイムで観察するため、 力 テーテル等、 何らかの方法でレーザー励起した場合の模式図である。 共焦点顕微 鏡のレーザー光路先端 （対物レンズ） 2 5から出たレーザービーム 1 7は前述の 態様にしたがって多層的に二次元走査され、 この領域 2 4の細胞が三次元画像に よりリアルタイムで観察され、 例えば、 壌疽を生じていること等が容易に発見で きるようになる。 なお、 2 6は心房、 2 7は大動脈である。
また、 標本ステージあるいは対物レンズを光軸方向に移動することによって左 心室 2 3全体も観察できる。 標本ステージあるいは対物レンズの光軸方向の移動 距離と多層観察ユニットによる焦点移動距離を規格化すると共に、 同期化して観 察することにより、 図 4のように広範囲な観察と局所的な詳細観察とを重ねて三 次元観察することができる。
標本ステージあるいは対物レンズの光軸方向の移動距離と多層観察ユニットに よる焦点移動距離を規格化することにより、 早い時間で被観察試料の光軸方向の 深さを測定することもできる。 移動距離を規格化する別な方法としては、 すでに 深さ方向の距離が測定済みの基準試料を事前に観察することにより、 多層観察ュ ニットによる焦点移動距離を規格化することもできる。 観察できる観察面と多層 観察ュニットによる焦点移動距離の差を測定することにより、 その異なる観察面 の深さを測定できる。 深さを測る場合には、 多層観察ユニットとしてアナログ的 に光軸方向の焦点移動距離を制御できる位相変更手段が好ましい。 位相変更手段 として印可電界によって制御できるポッケルス効果あるいはカー効果を持った電 気光学結晶デバイスを用いることによりアナログ的に光軸方向の焦点移動距離を 制御することができる。 ポッケルス効果を有する材料としては例えば L i N b O 3 (ニオブ酸リチウム） 結晶がある。 カー効果を示す材料としては液体であるが C S 2がある。 本発明の顕微鏡は、 三次元観察及び測長を早い時間で同時にでき る。 従って、 実験用だけではなくマイクロデバイス等の生産段階での検査工程に 最適である。
また、 多層観察ュ-ットの収束/視準化レンズの倍率を変えることにより光軸 方向の移動距離範囲を広くできる。 被観察試料の大きさに応じて多層観察ュ-ッ トの収束 Z視準化レンズの倍率を変えることにより、 被観察試料を 1回の走査で 三次元観察することができる。 収束/視準化レンズの倍率を変える構造を設けた ことにより、 位相変更手段の少ない位相変化でも効果的に移動距離範囲を光学的 移動距離範囲を広くできる。 言い換えれば、 多層観察ユニットを小型化すること ができる。 この位相変更手段の小型化は位相変更の高速化を容易にする。
更に、 高速に三次元観察ができるので、 医学生物分野の試料及びエレクト口- タス分野の試料の三次元検査が可能になる。 即ち、 まず、 光学的に三次元構造を 有する被観察試料を作製する。 例えば、 医学生物分野の試料の作製は、 蛍光材料 を試料に混入することにより光学的に鮮明に観察できる被観察試料を準備する。 半導体集積回路等のエレク トロ二タス分野の試料作製において、 製造されるシリ コンゥェハ表面は一般的にエツチング等で凹凸が形成される。 凹凸の深さの絶対 値を含めて正常かどうかを判断したいという、 その被観察試料を標本ステージに 設置する。 本発明の光学顕微鏡の構成を用いて、 その被観察試料の三次元デジタ ルデータを測定する。 被観察試料が正常な三次元形状であるか否か判断するため に、 別途正常な三次元形状の試料を観察して得られたデジタルデータを検査判定 基準デジタルデータとして設定しておく。 測定された検查用の被観察試料の三次 元デジタルデータと検査判定基準デジタルデータとを比較することにより、 被観 察試料が正常かどうかの判定をすることができる。 繰り返し三次元デジタルデー タを測定することにより、 時間的に変化する動態の検査も可能になる。 この動態 検査の場合には、 三次元データ走査を正確な時間で同期して評価することにより 可能になる。 動態の検査は、 時間と共に変化する検査判定基準三次元デジタルデ ータを検査前に設定しておく必要がある。
従来のシリコンウェハの集積回路のパターン検査は、 二次元的デジタルデータ の判断が一般的であった。 本発明の検查方法によれば、 深さ方向のデジタルデー タも含んだ三次元デジタルデータによる検査が可能になる。 半導体集積回路にお いては、 ますます表面構造が三次元化していくが、 本発明の顕微鏡を用いて三次 元検査を高速でできるようになる。 医療分野においても、 多くの試料を早く検査 する必要がある健康診断のような用途に用いることが可能になる。 産業上の利用の可能性
以上述べたとおり、 本発明の多層観察型リアルタイム光学顕微鏡、 特に共焦点 顕微鏡によれば、 細胞や生体組織の三次元構造を、 そのままの状態で高精度に観 察することができる。 すなわち、 多層的に観察できない従来の方法では、 本来三 次元的な生体組織の営みを、 シャーレ内での細胞培養等により二次元平面に置き 換えることで可視化しているに過ぎず、 生体の自然な姿を捉えているとは言いが たいものであつたのに対し、 本発明では、 生体の営みを高速且つ立体的に可視化 したものだからである。
上記のような本発明の技術的効果は、 その観察結果から、 これまでは見えなか つた多くの情報をもたらすであろう。 それはまた医学 '生物学、 並びに関連諸分 野において、 きわめて有用であるものと期待される。
更に、 本発明のリアルタイム光学顕微鏡の製作に当たっては、 従来の光学顕微 鏡の対物レンズ直前光路中に、 前述した多層観察ュニットを揷入するだけでよい ため、 比較的低コストで実施可能であり、 その産業上の利点もまた極めて大きい ものがある。

Claims

請求の範囲
1 . 対物レンズに対し、 そのレンズから被観察試料に照射光線を入射させる光 軸中に、 収束 視準化レンズ対を配置し、 それらのレンズ間に透過光の位相を光 軸横断面の所定範囲内で変化させるための位相変更手段を設けたことにより、 対 物レンズに入射する照射光線の波面の位相に応じた深度において前記試料を合焦 点照射するように構成したことを特徴とする多層観察型光学顕微鏡。
2 . 前記収束/視準化レンズ対を配置する光軸が、 共焦点顕微鏡において、 対 - 物レンズを通して被観察試料に照射する照射光線と、 同試料から放射あるいは反 射されて対物レンズを逆向きに通過した蛍光線との共通光軸であることを特徴と する請求項 1に記載の多層観察型光学顕微鏡。
3 . 前記位相変更手段が段階的に光学的特性の異なる複数の位相板セグメント を配列し、 各セグメントが順次光軸を横切るように設置された回転板からなるこ とを特徴とする請求項 1又は 2に記載の多層観察型光学顕微鏡。
4 . 前記位相変更手段が各位相板セグメントの要素をなす等方性透明膜の厚さ を段階的に変化させたことにより、 それらの光学的特性を異ならしめたことを特 徴とする請求項 3に記載の多層観察型光学顕微鏡。
5 . 前記位相変更手段が各位相板セグメントの要素をなす等方性透明膜の屈折 率を段階的に変化させたことにより、 それらの光学的特性を異ならしめたことを 特徴とする請求項 3に記載の多層観察型光学顕微鏡。
6 . 光学顕微鏡の試料台の二次元走査と、 前記位相変更手段の位相走査とを同 期させることにより、 被観察試料の三次元動態を観察できるようにしたことを特 徵とする請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の多層観察型光学顕微鏡。
7 . 段階的に光学的特性の異なる複数の位相板セグメントを円周方向に順次隣 接するように配列した回転板からなり、 対物レンズへの入射光軸中に配置された 収束 Z視準化レンズ対における両レンズ間に揷入することにより、 前記位相板セ グメントの各々が順次両レンズ間の光軸を横切る際に、 各セグメントごとに透過 光の位相を光軸横断面の所定範囲内において、 異なった度合いで変化させるべき 位相変更手段として作用する多層観察ュニットであって、 このュニットを経て対 物レンズに入射する光線の波面の位相に応じて、 その焦点深度を変更させるもの であることを特徴とする多層観察ユエット。
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