JP5221614B2 - 3次元共焦点観察用装置及び観察焦点面変位・補正ユニット - Google Patents
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Description
上記課題を解決するための本願第1発明の構成は、共焦点観察励起用の第1のレーザーの光源と、前記第1のレーザーを試料上で走査するための2次元走査光学系と、前記光源から供給される第1のレーザーを観察対象物たる蛍光性の試料上に集光する対物レンズと、前記蛍光性の試料から発せられた蛍光に基づいて蛍光共焦点像を検出する蛍光撮像用カメラとを備えた3次元共焦点観察用装置において、
前記対物レンズと蛍光撮像用カメラとの間には、前記試料の蛍光共焦点像の中間像を結ぶ中間結像レンズと、この中間結像レンズに対して同一光軸上で焦点位置が重なるように配置される中間対物レンズからなり、かつこれらの内の少なくとも一方のレンズがレンズ駆動手段によって光軸方向に移動可能とされている焦点面変位用レンズペアを配置し、又、
前記蛍光撮像用カメラにより得られた蛍光共焦点像と、サンプル試料の予備計測により予め取得された歪補正用データとを用いて、前記焦点面変位用レンズペアにおけるレンズの移動に起因する蛍光共焦点像の歪みをリアルタイムに補正して試料の3次元構築画像を得る演算手段を備えた計算機と、前記演算手段により得られた補正画像を表示する手段とを設け、更に、
前記焦点面変位用レンズペアと前記対物レンズとの間にビームスプリッタ又はダイクロイックミラーを備えさせ、光ピンセット用の第2のレーザーの光源から供給される第2のレーザーが、前記ビームスプリッタ又はダイクロイックミラーを介して、前記対物レンズを通過し試料上に集光される構成とした、3次元共焦点観察用装置である。
上記課題を解決するための本願第2発明の構成は、前記第1発明に係る3次元共焦点観察用装置において、2次元走査光学系がニッポウディスクあるいはラインスキャン型走査系を備える、3次元共焦点観察用装置である。
上記課題を解決するための本願第3発明の構成は、前記第1発明又は第2発明に係る3次元共焦点観察用装置において、焦点面変位用レンズペアのレンズ駆動手段が、ピエゾ素子、磁歪素子、ボイスコイルのいずれかである、3次元共焦点観察用装置である。
上記課題を解決するための本願第4発明の構成は、前記第1発明〜第3発明のいずれかに係る3次元共焦点観察用装置において、焦点面変位用レンズペアにおけるレンズ駆動手段の駆動と、蛍光撮像用カメラによる画像取得とのタイミングが同期するように調整されている、3次元共焦点観察用装置である。
上記課題を解決するための本願第5発明の構成は、前記第1発明〜第4発明のいずれかに係る3次元共焦点観察用装置において、試料の3次元構築画像を得る演算手段による演算をGPU(Graphics Processing Unit)によって行うものである、3次元共焦点観察用装置である。
上記課題を解決するための本願第6発明の構成は、前記第1発明〜第5発明のいずれかに係る3次元共焦点観察用装置が、更に、対物レンズと焦点面変位用レンズペアとの間に配置したビームスプリッタ又はダイクロイックミラーと、これらのビームスプリッタ又はダイクロイックミラーによって分離された試料の2次元画像を撮影するための結像レンズ及び明視野観察用カメラを備える、3次元共焦点観察用装置である。
上記課題を解決するための本願第7発明の構成は、共焦点観察励起用のレーザーの光源と、この光源から供給されるレーザーを蛍光性の試料上に集光する対物レンズと、前記試料から発せられた蛍光に基づいて蛍光共焦点像を検出する蛍光撮像用カメラとを備えた3次元共焦点観察用装置における前記対物レンズと前記蛍光撮像用カメラとの間に設置するユニットであって、
前記試料の蛍光共焦点像の中間像を結ぶ中間結像レンズと、この中間結像レンズに対して同一光軸上で焦点位置が重なるように配置される中間対物レンズからなり、かつこれらの内の少なくとも一方のレンズがレンズ駆動手段によって光軸方向に移動可能とされている焦点面変位用レンズペアを備え、更に、
前記蛍光撮像用カメラにより得られた蛍光共焦点像と、サンプル試料の予備計測により予め取得された歪補正用データとを用いて、前記焦点面変位用レンズペアにおけるレンズの移動に起因する蛍光共焦点像の歪みをリアルタイムに補正して試料の3次元構築画像を得る演算手段を備えた計算機と、前記演算手段により得られた補正画像を表示する手段とを備えている、観察焦点面変位・補正ユニットである。
2:対物レンズ
3:焦点面
4:光ピンセット用レーザー
5:ダイクロイックミラー
6:試料
7:下方位置
8:焦点面
9:下方位置
10:励起用レーザー光源
11:共焦点ユニット
12:対物レンズ
13:試料
14:中間結像レンズ
15:中間対物レンズ
16:共焦点観察用カメラ
17:ピエゾアクチュエータ
18:赤外レーザー光源
19:光ピンセット駆動用光学系
20:ダイクロイックミラー
21:ハーフミラー
22:明視野観察用カメラ
23:画像処理プロセス
24:断面像取得プロセス
25:光ピンセット制御プロセス
26:円柱断面
27:側面
28:円柱断面
29:側面
30:本体
31:固定腕
32:可動腕
33:円柱状突起部位
34:細胞
35:微小構造体本体
36:可動腕
37:円柱状突起部位
38:リング構造
39:操作対象の細胞
本発明に係る3次元共焦点観察用装置は、以下(1)〜(4)の構成を備える。
(2)前記対物レンズと蛍光撮像用カメラとの間には、前記試料の蛍光共焦点像の中間像を結ぶ中間結像レンズと、この中間結像レンズに対して同一光軸上で焦点位置が重なるように配置される中間対物レンズからなり、かつこれらの内の少なくとも一方のレンズがレンズ駆動手段によって光軸方向に移動可能とされている焦点面変位用レンズペアを配置し、又、
(3)前記蛍光撮像用カメラにより得られた蛍光共焦点像と、サンプル試料の予備計測により予め取得された歪補正用データとを用いて、前記焦点面変位用レンズペアにおけるレンズの移動に起因する蛍光共焦点像の歪みをリアルタイムに補正して試料の3次元構築画像を得る演算手段を備えた計算機と、前記演算手段により得られた補正画像を表示する手段とを設け、更に、
(4)前記焦点面変位用レンズペアと前記対物レンズとの間にビームスプリッタ又はダイクロイックミラーを備えさせ、光ピンセット用の第2のレーザーの光源から供給される第2のレーザーが、前記ビームスプリッタ又はダイクロイックミラーを介して、前記対物レンズを通過し試料上に集光される構成とした。
上記(1)の構成において、「2次元走査光学系」とは、励起用レーザー光の集光点を試料上で2次元的に走査して試料の特定深さ近傍の薄い断面像を得るための光学系であって、公知の各種2次元走査光学系を利用することができるが、特に好ましくは、ニッポウディスク(Nipkow disc)、あるいはラインスキャン型走査系を利用することができる。
上記(2)の構成において、焦点面変位用レンズペアを構成する中間結像レンズ及び中間対物レンズは、同一光軸上にあって互いの焦点位置が重なるように配置されており、かつ少なくとも一方のレンズがレンズ駆動手段によって光軸方向に移動可能とされている。即ち、いずれか一方のレンズが固定され他方のレンズが移動可能とされているか、又は、双方のレンズが移動可能とされている。但し、双方のレンズが移動可能とされている場合は駆動手段の正確な制御が困難となりやすいため、好ましくは、いずれか一方のレンズが固定され他方のレンズが移動可能とされており、更に好ましくは、対物レンズ側に固定の中間結像レンズが配置されると共に蛍光撮像用カメラ側に移動可能な中間対物レンズが配置される。
上記(3)の構成における「試料の3次元構築画像を得る演算」の意味を、3次元共焦点観察用装置の基本的な構成を簡略化して示した図3に基づいて説明する。図3において「Objective Lens 3」と表記した最上方のレンズが共焦点観察励起用のレーザーを試料上に集光する固定の対物レンズであり、その下方において「Objective Lens 2」及び「Objective Lens 1」と表記したものが、それぞれ、固定の中間結像レンズと移動可能な中間対物レンズである。
上記(4)の構成は、共焦点顕微鏡に光ピンセット技術を組み合わせるためのものであって、光ピンセット用の第2のレーザーは、ビームスプリッタ又はダイクロイックミラーを介して、共焦点顕微鏡における焦点面変位用レンズペアと対物レンズとの間の光路上に導入され、対物レンズを通過して試料上に集光される。
3次元共焦点観察用装置は、上記の各構成部分の他にも更に、対物レンズと焦点面変位用レンズペアとの間に配置したビームスプリッタ又はダイクロイックミラーと、これらのビームスプリッタ又はダイクロイックミラーによって分離された試料の2次元画像を撮影するための結像レンズ及び明視野観察用カメラを備えることができる。
本発明に係る観察焦点面変位・補正ユニットは、3次元共焦点観察用装置における上記の第2の構成部分及び第3の構成部分からなるものである。
〔実施例1:3次元共焦点観察用装置の構成及び作用・効果〕
本実施例に係る3次元共焦点観察用装置の構成を図2に示す。この3次元共焦点観察用装置において、励起用レーザー光源10からの励起用レーザーが、ニッポウディスク方式の共焦点ユニット11(横河電機社製
CSU-X)を通して分割・走査され、対物レンズ12(オリンパス光学社製 UPlanSApo100x)により、試料13上に集光される。
〔実施例2:3次元共焦点観察用装置の使用〕
実施例1の3次元共焦点観察用装置を用いて、直径3μmの蛍光性円柱構造体を共焦点観察した様子を図5に示す。前記した歪み補正を行わない場合、試料の底面から上方に焦点面が移動するに従ってレンズの倍率が拡大するため、試料の円柱断面26が実際より大きくなり、円柱構造体の側面27も逆台形に見えるが、GPUによるリアルタイム補正を行った場合は、円柱断面28、円柱構造体の側面29共に、実サイズの3次元像が得られた。
Claims (7)
- 共焦点観察励起用の第1のレーザーの光源と、前記第1のレーザーを試料上で走査するための2次元走査光学系と、前記光源から供給される第1のレーザーを観察対象物たる蛍光性の試料上に集光する対物レンズと、前記蛍光性の試料から発せられた蛍光に基づいて蛍光共焦点像を検出する蛍光撮像用カメラとを備えた3次元共焦点観察用装置において、
前記対物レンズと蛍光撮像用カメラとの間には、前記試料の蛍光共焦点像の中間像を結ぶ中間結像レンズと、この中間結像レンズに対して同一光軸上で焦点位置が重なるように配置される中間対物レンズからなり、かつこれらの内の少なくとも一方のレンズがレンズ駆動手段によって光軸方向に移動可能とされている焦点面変位用レンズペアを配置し、又、
前記蛍光撮像用カメラにより得られた蛍光共焦点像と、サンプル試料の予備計測により予め取得された歪補正用データとを用いて、前記焦点面変位用レンズペアにおけるレンズの移動に起因する蛍光共焦点像の歪みをリアルタイムに補正して試料の3次元構築画像を得る演算手段を備えた計算機と、前記演算手段により得られた補正画像を表示する手段とを設け、更に、
前記焦点面変位用レンズペアと前記対物レンズとの間にビームスプリッタ又はダイクロイックミラーを備えさせ、光ピンセット用の第2のレーザーの光源から供給される第2のレーザーが、前記ビームスプリッタ又はダイクロイックミラーを介して、前記対物レンズを通過し試料上に集光される構成としたことを特徴とする3次元共焦点観察用装置。 - 前記2次元走査光学系がニッポウディスクあるいはラインスキャン型走査系を備えることを特徴とする請求項1に記載の3次元共焦点観察用装置。
- 前記焦点面変位用レンズペアのレンズ駆動手段が、ピエゾ素子、磁歪素子、ボイスコイルのいずれかであることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の3次元共焦点観察用装置。
- 前記焦点面変位用レンズペアにおけるレンズ駆動手段の駆動と、蛍光撮像用カメラによる画像取得とのタイミングが同期するように調整されていることを特徴とする請求項1〜請求項3のいずれかに記載の3次元共焦点観察用装置。
- 前記試料の3次元構築画像を得る演算手段による演算をGPUによって行うものであることを特徴とする請求項1〜請求項4のいずれかに記載の3次元共焦点観察用装置。
- 前記3次元共焦点観察用装置が、更に、対物レンズと焦点面変位用レンズペアとの間に配置したビームスプリッタ又はダイクロイックミラーと、これらのビームスプリッタ又はダイクロイックミラーによって分離された試料の2次元画像を撮影するための結像レンズ及び明視野観察用カメラを備えることを特徴とする請求項1〜請求項5のいずれかに記載の3次元共焦点観察用装置。
- 共焦点観察励起用のレーザーの光源と、この光源から供給されるレーザーを蛍光性の試料上に集光する対物レンズと、前記試料から発せられた蛍光に基づいて蛍光共焦点像を検出する蛍光撮像用カメラとを備えた3次元共焦点観察用装置における前記対物レンズと前記蛍光撮像用カメラとの間に設置するユニットであって、
前記試料の蛍光共焦点像の中間像を結ぶ中間結像レンズと、この中間結像レンズに対して同一光軸上で焦点位置が重なるように配置される中間対物レンズからなり、かつこれらの内の少なくとも一方のレンズがレンズ駆動手段によって光軸方向に移動可能とされている焦点面変位用レンズペアを備え、更に、
前記蛍光撮像用カメラにより得られた蛍光共焦点像と、サンプル試料の予備計測により予め取得された歪補正用データとを用いて、前記焦点面変位用レンズペアにおけるレンズの移動に起因する蛍光共焦点像の歪みをリアルタイムに補正して試料の3次元構築画像を得る演算手段を備えた計算機と、前記演算手段により得られた補正画像を表示する手段とを備えていることを特徴とする観察焦点面変位・補正ユニット。
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