CN110062603B - 用于垂直横截面成像的多光子内窥显微镜 - Google Patents

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Abstract

一种多光子光学探针包括探针壳体、联接到横向镜组件的横向扫描台和联接到轴向镜组件的远程轴向扫描台。所述横向扫描台适于通过移动所述横向镜组件在样品的平面扫描区域上扫描输出激光能量。所述轴向扫描台适于在所述样品的垂直深度范围内扫描所述输出激光能量，所述垂直深度范围与所述平面扫描区域组合形成三维体积。控制器与联接到所述轴向镜组件的多个远程致动腿一起操作，以便提供水平成像平面，这继而提供清晰的扫描图像。

Description

用于垂直横截面成像的多光子内窥显微镜
政府支持声明
本发明是以国立卫生研究院授予的EB020644和CA142750拨款在政府支持下完成的。政府对本发明享有一定权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求名称为“具有远程MEMS扫描机构的多光子内窥显微镜中的垂直光束扫描(Vertical Beam Scanning In Multi-Photon Endomicroscopy with Remote MEMSScanning Mechanisms)”并于2016年12月2日提交的美国临时申请第62/429,438号的优先权，所述临时申请全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本公开总体涉及用于使用光学仪器对组织成像的技术，并且更具体地涉及用于使用光学仪器使得可进行二维(2D)和三维(3D)扫描的技术。
背景技术
本文提供的背景描述是为了总体上呈现本公开的背景。就本背景技术部分中所描述的程度而言，当前署名的发明人的工作，以及在提交时可不以其它方式具有资格作为现有技术的描述的方面，既不明确地也不隐含地被承认为本公开的现有技术。
内窥显微镜通常用于以平行于组织的表面的水平平面扫描对象。然而，垂直平面(在本文中也称为轴向平面或组织内平面)可对于对垂直于组织表面发育的生物过程、如正常上皮发育、干细胞迁移和肿瘤侵袭的过程进行成像更有用。对体内生物过程的垂直平面进行成像的需求推动了许多微型仪器(包括多光子显微镜装置)设计的开发。然而，先前的设计都不提供生成实时横截面图像所需的轴向位移和扫描速度，并且先前的设计都不以不严重损害样本的可用的形状因子这样做。举例来说，常规的内窥显微镜体积庞大并且不可重复进入待成像的区域，如结肠。
多光子显微镜使用长波长光的强脉冲提供高分辨率和显著的成像深度，所述长波长光的强脉冲能够穿透图像表面以通过非线性效应激发更短波长的光子。相对于其它深组织光学成像模态，多光子显微镜除了与各种靶向荧光生物标记物的相容性之外，还具有减少光漂白和激发内源荧光的能力的益处。
尽管有许多微型多光子仪器，但仍需要可通过轴向光束扫描对组织进行深度成像的内窥显微镜。能够进行深度成像的现有系统利用传统的台式显微镜，因此增加了实验复杂性、研究侵袭性和生物学行为。
为了在小型仪器中最好地利用多光子成像能力，期望支持超快激光的快速轴向(即，垂直或组织内)扫描。足够快速的轴向扫描可支持体内垂直光学切片，从而提供组织学家用于诊断和监测如结肠癌或食道癌的疾病的同一平面中的组织的实时横截面图像。然而，先前的内窥镜仪器为在多光子成像期间改变焦深提供了有限的支持。几个面对多光子内窥镜已经表征了平面外或z轴的分辨率，但仅通过物理移动被成像的样本。当在z轴上移动时，保持水平成像平面以提供清晰图像是特别重要的。
为了在垂直平面中创建图像，获取并且然后重建一系列水平平面图像。这种方法通常很慢并且难以实现，因为样品中的振动可导致运动伪影。
现有的扫描系统经常使用许多需要大的远端光学器件(例如，5-10mm)的大致动器生成光学透镜组件的轴向移动。这些系统可在轴向方向上采用Lissajous扫描或“平面内”扫描，其中成像装置必须移动到期望的深度、停止、扫描组织，然后行进到下一个期望的深度并重复此过程。在双轴共聚焦显微镜中，可采用压电致动，并且还可在X-Y和X-Z平面之间使用可选择的Lissajous扫描。在具有光栅或“平面外”扫描能力的系统中，只可在X-Z平面中进行成像。这些系统还需要大的远端光学器件。
发明内容
本申请描述了一种手持式光学装置，所述手持式光学装置可用作用于实时3D光学成像的显微镜系统。用于多光子内窥显微镜的系统利用微型垂直致动器，以除了使用微型化设备的大轴向(即垂直)位移之外，还提供快速轴向扫描。使用静电和薄膜压电致动器结合多光子成像模态获得垂直致动。轴向扫描基于可实现高速度和大位移扫描的静电驱动和参数共振实现。此外，此轴向扫描(即，沿Z轴)可与横向扫描结合，也可基于静电致动和参数共振，所述静电致动和参数共振能够扫描不同平面轴(即，X轴和Y轴)上方的光束。此外，此横向扫描可在不同的轴向扫描深度处实现，而不会改变扫描性能。轴向扫描器的不同共振模式与横向扫描器的共振模式的使用进一步允许在不同方向上更好地隔离扫描控制。
与共聚焦成像相比，多光子成像为上皮和其它区域的实时体内成像提供了许多益处。举例来说，多光子成像可提供更大的图像深度、更少的光漂白用于长期成像研究，并且还可提供增加的图像分辨率或减少的散射。虽然双轴共聚焦显微镜已经显示出具有可比较的成像深度和垂直切片分辨率的潜力，但由于需要在离轴角度提供光路径，因此需要更大的仪器直径以获得相等的深度。因为单个激发波长可激发多个荧光团，所以多光子成像比其它成像模态(如磁共振成像(MRI)和正电子发射断层扫描(PET))显著容易复用。进一步地，与其它技术相比，多光子激发产生减少的光损伤和平面外光漂白。多光子系统对入射光和返回光使用单个光路径(尽管路径可被分离以用于收集目的)，因此，与双轴成像系统相比，使用圆镜几何形状(与双轴使用的一般狗骨几何体相反)。进一步地，双轴系统中的透镜布置需要使用如抛物面固定镜的机构精确对准两个准直透镜，以确保分离的光束路径在同一点对准。多光子布置不具有这种对准问题，尽管这些系统需要适当的中继透镜配置来将扫描镜的轴向位移的改变映射到组织中的焦点的位移。本技术的一个优点是可在不需要使用组织和/或细胞的内源荧光的荧光标记的情况下进行成像。
本申请的系统使用镜扫描方法提供对组织的实时、轴向或垂直扫描。镜的这种轴向移动可使用薄膜压电和/或静电致动器来执行，所述薄膜压电和/或静电致动器可提供相当大的位移(例如，大约500微米)，同时仍然具有小直径(例如，大约3mm)。薄膜压电致动器可在较低的操作电压下产生较大的轴向平移，并且能够单独寻址致动腿以补偿不均匀的运动。静电致动器制作起来相对简单并且在较高的操作速度下起作用。另外，如果镜表面是单片构建的(即，作为单个部件)，则装置将具有更好的初始均匀性。
本多光子成像系统使用双光子效应，当两个较低能量(即较长波长)的光子同时到达生物分子以激发荧光时，会发生所述双光子效应。吸收两个光子的概率随着强度的平方而增加；因此，单轴配置中的高数值孔径物镜用于最大化焦点处的强度。由于这种物理原理，与单光子荧光相比，对组织散射的敏感性较低，并且光漂白减少。另外，使用的较长激发波长提供较深的组织穿透。
根据实例，多光子光学探针包括探针壳体、联接到横向镜组件并且至少部分地设置在探针壳体中的横向扫描台，以及联接到轴向镜组件并且至少部分地设置在探针壳体中的轴向扫描台。探针壳体具有近端和定位在样品处的远端，并且适于产生输出激光能量。横向扫描台适于通过移动横向镜组件在样品的平面扫描区域上扫描输出激光能量。轴向扫描台适于在样品的深度范围内扫描输出激光能量。深度范围和平面扫描区域形成三维体积。轴向扫描台包括围绕轴向镜组件轴向地定位的多个致动腿。
在一些实例中，用于多光子光学探针的轴向扫描台包括框架、联接到框架的镜平台、联接到框架和镜平台的多个致动器腿，以及围绕镜平台定位的多个电连接器。镜平台适于支撑镜元件。致动器腿适于沿垂直轴升高镜平台。致动器腿和电连接器围绕镜平台轴向地定位。
附图说明
为了更完整地理解本公开，应该参考以下详细描述和附图，其中相似的附图标号表示附图中的相似元件，并且其中：
图1A是具有轴向扫描单元、横向扫描单元和远端光学器件的光学探针的示意图，并且图1B是根据各种实施例的具有轴向和横向扫描单元和远端光学器件的实例多光子光学探针的图示；
图2是根据各种实施例的图1的光学探针的示意图；
图3A至图3C示出了根据各种实施例的实例横向扫描单元的俯视平面图(图3A)和分别描绘了内轴和外轴的机械扫描角大于5.5度的频率响应图(图3B和图3C)；
图4A至图4K是根据各种实施例的实例轴向扫描单元的俯视平面图(图4A)、示出垂直位移的频率响应图(图4B)，以及在示出在静止状态和在440Hz处共振的激光束斑点的激光位移传感器下表征的单元(图4C和图4D)、在移动轴向致动器时波前的变化的图示(图4E至图4G)、在平移轴向致动器时X轴的倾斜角(图4H)和Y轴的倾斜角(图4I)、描绘轴向扫描镜的位置与焦平面的深度之间的线性关系的图示(图J)，以及描绘在变化的成像深度上的横向放大率范围的图示(其中轴向扫描单元使用共振静电致动器来提供轴向移动)；
图5是根据各种实施例的使用薄膜压电致动器的实例轴向扫描致动器的透视图，所述薄膜压电致动器围绕镜平台以轴向或圆形形状因子布置。
图6和图7是根据各种实施例的图5的实例轴向扫描致动器的俯视平面图；
图8是根据各种实施例的图5至图7的实例轴向扫描致动器的透视图，其中致动器腿延伸以产生位移。
图9是根据各种实施例的处于完整配置的图5至图8的实例轴向扫描致动器的透视图；
图10是根据各种实施例的实例致动器的横截面视图，其示出了金属被放置在聚对二甲苯桥上和PZT层之间以改善电可靠性；
图11A-G是根据各种实施例的轴向MEMS扫描器的图10的致动器的制作图示；
图12A-F是根据各种实施例的用于改变向上和向下位移的点扩散函数的结果；
图13A-C是根据各种实施例的使用静电致动系统的横向和轴向扫描单元的组合的花粉粒的图像；
图14A和图14B是根据各种实施例的仅使用横向扫描单元以及使用横向和静电致动轴向扫描单元的组合的样品对象组织的图像；
图15是根据各种实施例的轴向MEMS扫描器的替代设计的透视图；
图16A-D示出根据各种实施例的在用于组装到成像系统的3D打印夹具中安装之前和之后完整的压电垂直致动器；和
图17描绘实例框图，其示出根据各种实施例的用于实施薄膜压电多光子内窥显微镜的示例性实施例的各种部件。
技术人员应了解，图中的元件仅为简单和清晰起见而进行示出，并且不一定按比例绘制。举例来说，图中元件的一些的尺寸和/或相对定位可相对于其它元件放大以有助于改善对本发明的各种实施例的理解。另外，在商业上可行的实施例中为有用的或必要的常见但很好理解的元件通常未描绘以便于较少妨碍这些各种实施例的视图。还应当理解，可以特定的发生顺序描述或描绘某些动作和/或步骤，而本领域技术人员将理解，实际上不需要关于序列的这类特定性。还应当理解，除了不同的特定含义以在本文中另有阐述，否则本文使用的术语和表达具有如上所述的技术领域的技术人员对这类术语和表达所赋予的普通技术含义。
具体实施方式
一般来说，根据这些各种实施例，光学仪器具有致动器机构，所述致动器机构提供高图像分辨率并且可快速深入扫描到组织中以产生体积图像。仪器的光学部件的尺寸可足够小，以便容易地在期望的组织中移动并被操纵。通过使用压电致动，低轮廓扫描装置可通过微致动实现光学部件(例如，镜)的大、高速位移，这允许组织的实时横截面和/或3D图像。
多光子成像可提供优于双轴成像系统的若干优点。举例来说，样本需要较少的光漂白，因为荧光仅在两个或更多个进入光子同时撞击分子时生成。另外，多光子成像提供了从多种细胞类型产生内源荧光的能力，而双轴成像系统仅可使用荧光分子标记的生物标记物来执行。多光子成像还提供增加的图像分辨率以及使用高强度超快激光进行激光手术的机会，这对于双轴系统是不可能的。使用多光子成像系统需要新的光学设计，所述设计可使用致动器位移来实现对组织的轴向扫描。与双轴扫描相比，多光子扫描设计对扫描运动的均匀性施加更严格的限制，因此应仔细考虑致动器设计和配置。
如图1A和图1B所示，多光子光学探针100包括轴向微机电系统(MEMS)扫描单元或台130、横向(MEMS)扫描单元或台140，以及远端光学器件150。横向扫描单元140适于通过移动横向镜组件在样品103的平面扫描区域上扫描输出激光能量，并且轴向扫描单元130联接到轴向镜组件并且适于在样品的深度范围内扫描输出激光能量。深度范围和平面扫描区域组合以形成三维体积。如将讨论的，轴向扫描单元包括围绕轴向镜组件轴向地定位的任何数量的致动腿。轴向扫描单元130、横向扫描单元140和远端光学器件150都通过光缆线缆102a、102b光联接到激光器和光收集电子器件(如任何数量的多模光纤、光电倍增管等，未示出)。任何数量的这些部件可至少部分地设置在单个手持式探针壳体框架101中。探针壳体框架101可包括近端101a和定位在样品103处的远端101b，并适于产生输出激光能量。
图2提供探针100的更详细的图示，其使用远程轴向扫描架构，其中利用在物镜处镜像的轴向扫描器平移在远端光学器件之前执行轴向和横向扫描。这类架构可支持具有紧凑的手持形状因子的小直径远端光学器件。在此方法中，通过静电旋转扫描镜执行横向扫描。
轴向扫描单元130和横向扫描单元140中的每一个可采用静电致动设计，和使用参数共振进行操作的设计。在本文所述的一些实例中，经由轴向扫描单元130的致动通过压电(PZT)致动器实现，所述致动器被组装或形成到安装夹具上，其中致动器被手动定位以消除扫描镜的任何静态轴外倾斜。每个致动器包括在轴向扫描或横向扫描物镜之前放置的镜或镜表面。
先前提及的激光器和光收集电子器件可包括具有大约690至1040nm的可调光谱范围的Ti-蓝宝石激光器104。此激光器104在80MHz下提供具有大约100fs脉冲宽度的激发105。可使用位于激光器壳体内部的色散预补偿单元来最小化脉冲持续时间。半波片106与线性偏振器107一起使用以调节激光功率。在通过偏振分束器(PBS)108之后，光束最初是p偏振的。在通过四分之一波片(QWP)109、从横向扫描单元140的横向扫描镜110(M1)反射，并通过QWP 109后，光束变为s偏振。
在以90°从PBS 108反射之后，激发光束通过焦距为大约35mm的第一透镜111(L1)和焦距为大约100mm的第二透镜112(L2)扩展以填充第一物镜113的后孔径。第二PBS 114将光束通过QWP 116反射到轴向扫描镜115(M2)上。波前然后通过QWP 116和PBS 114返回，然后由两者都具有75mm的焦距的一对望远镜透镜117(L3)和118(L4)扩展。然后，光束以90°从二向色镜119(DM)反射，并填充第二物镜120(Obj2)的后孔径，在此实例中，所述第二物镜120是水浸透镜。随着轴向MEMS扫描单元130的轴向扫描镜115的表面在轴向方向上移动。M2115的平移引起焦点在放大率小于约2:1比率的样本的组织表面下方轴向位移。
如图2中所示，由样品103生成的荧光122通过DM 119、从平面镜123(M3)反射，并且通过具有60mm的焦距的第一透镜124(L5)和具有35mm的焦距的第二透镜125(L6)聚焦，并通过带通滤波器126(BPF；在大约380-580nm之间的大约80％的透射率)，并且聚焦到光电倍增管检测器(PMT)127上。光电倍增管信号由高速电流放大器(未示出)放大。高速数据采集板将来自光电倍增器的荧光信号数字化并生成控制信号以驱动轴向扫描单元130和横向扫描单元140。在一些实例中，可将不同的、优化的驱动信号发送到各个镜和/或致动腿。第一板用于信号采集，并且第二板用于控制波形生成，使用定制软件的个人计算机可用于控制和同步数据采集板。来自信号采集板的通道可用于数字化具有期望采样率(例如，每秒10M样品)的电压信号。可在波形生成板中使用任意数量的通道(例如，三个)来生成具有期望采样速度(例如，每秒1M样品)的波形，以控制三个扫描轴。为了将一维数字化信号映射到2D图像，重要的是确保信号采集和波形生成精确同步。可在两个板之间使用实时系统集成(RTSI)线缆，使得它们可共享相同的定时源并且开始触发以保持同步。定制软件在Labview中写入，用于计算控制波形并将数据发送到波形生成板，同时从信号采集板读取数据。软件还可选择针对水平成像模式仅致动横向扫描器，或针对垂直成像模式致动横向和轴向扫描器。通过致动两个扫描单元140、130的不同轴，可在样品中的水平(XY)和垂直(XZ)平面之间改变扫描方向。
基于参数共振原理，提供不同的静电MEMS扫描器用于横向和轴向扫描。大机械致动可通过以2ω0/n驱动结构来实现，其中ω0是扫描器的固有频率，并且n是≥1的整数。图3A示出形成为横向扫描单元140的横向致动器系统140a的零件的镜110。虽然镜110可采用不同的形状，但是在所示的实例中，镜110是圆形镜。在所示的实例中，直径为1.8mm并且镜110能够适应垂直入射(与45°相反)的宽度为1.27mm宽度的激发光束。横向致动器系统140a的前侧用铝涂布，以在大约200至900nm波长之间实现大于大约85％的反射率，以反射多光子激发的波长范围。
在所示的实例中，横向致动器系统140a包括两个致动轴，镜110可围绕所述两个致动轴独立地旋转。如图所示定义X轴，所述X轴与内镜致动器的内腿或弹簧构件对准。Y轴被定义为与外镜致动器的外腿对准。每条腿分别是内和外梳状滤波器驱动器的零件。梳状滤波器驱动器提供静电致动，使得当由驱动信号驱动时，镜110分别围绕轴(X轴)和外轴(Y轴)旋转。内和外梳状滤波器驱动器中的每一个分别可以共振频率(例如，被选择在大约1kHz和大约4kHz之间的共振频率)操作。此外，可利用到每个梳状驱动器的选择的共振频率驱动信号驱动系统140a，使得镜110经历正弦扫描图案。在一个实例中，系统140a由共振频率驱动，以使用Lissajous扫描图案、并以每帧400×400像素扫描以≥5帧/秒成像。
横向致动器系统140a的内轴和外轴都可被致动以在水平(XY)平面中成像。这些轴的共振频率分别被设计为大约1kHz或4kHz。进一步地，通过组合横向扫描器的内轴的致动和轴向扫描器的平面外运动，可在垂直(XZ)平面中产生图像。当扫描对象时，形成密集的Lissajous扫描图案，所述图案以每秒5帧重复自身，以生成尺寸为400×400像素或400×320像素、100％覆盖的水平或垂直图像。MEMS扫描器通过LabView开发的定制软件驱动，所述软件还通过使用来自扫描器的校准运动轮廓将时间序列信号重新映射到2D图像以生成查找表来重建图像。换句话说，通过知道激光在特定时间被导引的位置，可映射返回激光的强度以形成2D图像。通过将轴向致动器安装在机动台上以精确地控制位置来量化轴向致动器系统130的位移与样本103中的焦点之间的关系。有利地，与传统成像装置相比，可以大约每秒5帧收集垂直区部，所述传统成像装置可需要几分钟来获取水平区部的堆叠并重建对应的垂直区部。
横向致动器系统140a可形成在尺寸为3×3mm2的芯片上。镜110安装在万向节框架141上，以最小化轴之间(即内轴和外轴驱动之间)的串扰。横向致动器系统140a以增加的共振频率操作，以便以较高的帧速率扫描。静电梳状驱动致动器145a、145b的正交组联接到内和外扭转腿或弹簧144a、144b，并基于它们的形状和配置确定扫描器的共振频率。图3B和图3C分别示出横向MEMS扫描器140在任一轴上的测量角度偏转，作为扫描器对于横向(即，水平)X轴和Y轴的60Vpp的正弦波输入的频率响应。可通过下扫描或上扫描来实现大扫描角度，但是通过下扫描可实现较大的偏转角度。对于X轴和Y轴两者，在所示的实例中，横向扫描器140可在60Vpp下利用接近8.2kHz和2kHz的驱动频率实现>5°的机械扫描角度。使用8570Hz和2100Hz的驱动频率分别在X轴和Y轴上产生4285Hz和1050Hz的实际倾斜频率。结果是密集的Lissajous扫描图案，所述图案以5Hz重复本身以针对250×250μm2的FOV涵盖尺寸为400×400像素具有100％覆盖的图像。
在一些实例中，控制系统可被配置为实现Lissajous扫描。由于致动器运动均匀性增加，如果轴向镜扫描频率太接近横向镜扫描频率，则使用Lissajous扫描。通过调整轴向致动器设计以在特定频率下操作，获得快速Lissajous帧速率。
现在参照图4A至图9讨论轴向扫描单元130，特别是轴向致动器系统130a的细节。一维共振MEMS扫描器沿光轴在50V处具有大于约400μm的平面外(轴向)平移，以在垂直于组织表面的平面中产生图像。该位移将在样本下方提供超过大约200μm的轴向位移，这足以通过上皮层成像。直径为2mm的圆形轴向扫描镜(或反射器)115附接到镜平台132上，并通过位于每个拐角的蛇形弹簧134附接在两个U形杆133上。四列静电梳状驱动致动器(例如，梳状驱动器135)设置在镜115的每一侧上，以在每个杆上提供大的驱动力，这引起杆133绕Y轴的旋转运动。使两个杆133同相旋转引起圆形镜115的平面外位移。然而，当两个杆133异相时，镜115绕Y轴旋转。因此，当期望从另外稳定的平面镜进行轴向扫描(即，沿Z轴)时，将同相驱动信号提供给两个不同的梳状驱动器135。当期望组合的轴向扫描和旋转扫描时，将使用异相驱动信号或同相和异相驱动信号的某种组合。蛇形弹簧134确定每个梳状驱动器135的共振频率，并且它们确定每个扫描模式(即轴向(或垂直)扫描模式和旋转扫描模式)的共振频率。弹簧134被设计成增加垂直和旋转模式之间的频率间隔，以避免在致动期间的串扰。在实例中，对于垂直运动，共振频率为大约500Hz。
为了提供清晰的图像，轴向扫描镜115定位在与物镜120处的工作距离相同的轴向距离处，并保持对准，使得镜115的垂直轴沿着与透镜相同的轴和激光路径。这类对准依赖于镜115的水平对准，使得激光在其上居中。
对于轴向扫描镜115，频率响应通过使用激光位移传感器测量平面外位移表征。通过使用频率上扫描(低到高)或下扫描(高到低)以各种电压和占空比来扫描施加到致动器的驱动频率来测量扫描器性能。
与横向扫描单元140类似，轴向扫描单元130可形成在尺寸为3.7×3.2mm2的芯片上；并且镜115的直径为大约2mm。如图4B所示，通过使用60Vpp方波以30％占空比扫描在870Hz和1000Hz之间的驱动频率来示出轴向扫描单元130的频率响应。与横向扫描单元140不同，轴向扫描单元130在上扫描期间具有较大的位移。对于成像，扫描器以930Hz的驱动频率致动，从而引起在930Hz的驱动频率下多于400μm的轴向位移，这根据参数共振效应引起在465Hz下的致动。注意，轴向扫描单元130的共振频率在与横向扫描单元140不同的频率范围内，这允许对每种扫描模态进行更好的个性化控制。
在一些实例中，可观察到由于弹簧中的软化效应引起的上扫描与下扫描的镜偏转幅度的相当大的差异。在离静止镜位置更远的距离处，静电力减小，这可引起具有两个稳定模式的动态分叉。一个这类节点出现在原点处，并且第二个节点出现在产生大偏转的稳定极限循环处。当从较高频率接近时(例如，在下扫描期间)，可观察到最大的偏转，这是由于来自在此方向上倾斜的软化共振峰的振荡幅度逐渐增加。当从较低频率接近时(例如，在上扫描期间)，原点保持在稳定的分叉分支处，直到上扫描和下扫描响应收敛的点。在一些实例中，轴向扫描单元130可出现相反的效果。
如图4C和图4D所示，轴向MEMS扫描单元130被提供在激光位移传感器(未示出)下方，所述激光位移传感器在施加驱动信号之前和之后生成所示的激光束斑点139。
如图4E至图4G所示，激发光束的波前随着轴向镜115的镜表面在任一方向上远离图4E所示的中性位置(ZM2＝0μm)移动而改变。当镜115距第一物镜113200μm(ZM2＝-200μm)时，波前会聚到第二物镜120上，并且焦平面朝向组织表面移动大约100μm，如图4F所示。类似地，当镜115移动靠近第一物镜113(ZM2＝200μm)时，波前发散，并且焦平面以较大的深度轴向地移动到组织中，如图4G所示。
如果轴向扫描镜115的镜表面在平移期间倾斜，则激发光束可变得未对准。因此，位置感测检测器(PSD)用于在轴向位移期间在驱动频率范围内测量围绕X轴和Y轴的倾斜角。当以930Hz驱动镜时，在X轴上测量最大倾斜角<0.004°(参见图4H)，并且在Y轴上测量最大倾斜角<0.19°(参见图4I)。在小于大约1200Hz的频率下观察到此扫描器的旋转模式，这超出了致动器的操作范围。这些结果说明，在X轴或Y轴上以非常小的倾斜角可实现Z轴的大的轴向扫描位移。此外，通过适当地设计弹簧参数和位置，可为轴向扫描单元130分离轴向扫描和旋转(即，倾斜)扫描模式之间的频率范围。这类高性能轴向(即垂直)扫描器可使用功率变化小于10％的远程扫描设置实现轴向光束扫描。
如图4J所示，在焦平面的位置和轴向MEMS镜115的位置之间观察到线性关系。由FWHM限定的轴向分辨率在镜114的扫描范围内从4.5μm到7μm变化，如图4K所示。利用在中间位置的镜115，测量270×270μm2的横向FOV。在平移镜115时，随着焦平面从中性位置从-100μm移动到100μm，横向放大率从大约1.2减小到0.9，并且横向FOV从320μm减小到240μm。此差异是由第一物镜113和第二物镜120之间的光学参数的轻微不匹配引起的，所述第一物镜113和第二物镜120分别是空气和水浸透镜。
使用薄膜压电致动的轴向致动器系统530a的实例布置在图5至图9中提供，并且包括硅框架531、镜515设置在其上的镜平台532、提供驱动力的多个致动器腿535，以及用于电联接的多个接合垫537。应理解，轴向致动器系统530a可包括用于正确操作的任何数量的附加部件。在此实例布置中，部件，特别是腿535围绕镜平台532以圆形阵列分布。在一些实例中，腿535中的每一个可从镜平台532的中点等距分布，而在其它实例中，任何数量的腿535可以与镜平台532不同的长度分布。腿535以圆形阵列分布，以在腿535被致动时增强镜平台的稳定性，从而减少成像期间伪影的发生。换句话说，腿535可配对，使得成对的腿535位于镜的相对侧上并且在径向方向上延伸大约180度。然而，在一些实例中，腿535的三个均匀间隔的组可围绕镜平台532以彼此远离大约60度的角度设置。其它实例也是可能的。腿可在外支撑结构处附接到硅框架531并且可附接到镜平台532。压电层和电极层在硅框架531的顶部上延伸。通常，压电层重叠的区域用金或其它金属层加强。在一些实例中，厚聚合物涂层用作加强物。
在这些实例中的一些中，腿535被配置为将对称压电力施加到镜平台532。换句话说，镜平台532上的力的强度可均匀地分布在腿535之间。举例来说，如果一对腿535与镜平台532等距离地设置，则每个单独的腿535可适于向镜平台532施加相等的力。相反地，如果一对腿535与镜平台532不等距，则两个腿535中的一个可施加比另一个腿535更大的力，以便在镜平台532上施加组合的对称压电力。应当理解，任何数量的致动器腿535可协作以施加对称的压电力。
腿535中的每个可包括协作以生成镜平台532的轴向移动的任何数量的单独区部。各个区部可在水平平面中以回转(或蛇形)图案配置，由此在相邻端部处彼此连接的扭转区段产生围绕连接点的延伸。
在所示的实例中，多个铝垫设置在致动器腿535的顶部电极和底部电极上。由于这些部件的尺寸小，可难以在致动器腿和接合垫537之间形成强电连接。聚对二甲苯桥和其它材料层沉积在致动器腿535上，以产生从PZT膜的顶部和底部电极到接合垫537的电跳线或连接件。
另外，任何数量的致动器腿535可具有与其联接的任何数量的压阻传感器，以提供垂直位置的精确测量。如前所述，这种光学布置依赖于轴向扫描器的均匀垂直运动。传感器提供反馈机制，用于调节各个腿的电压，以平衡垂直运动并提供更均匀的运动。在一些实例中，传感器可提供反馈以使用闭环控制系统控制致动器。
如图10和11A-G所示，致动器由具有30μm装置层的绝缘体上硅晶片制成。首先，通过深反应离子蚀刻(DRIE)将窄沟槽蚀刻到埋式氧化物层，并通过原硅酸四乙酯(TEOS)化学气相沉积(CVD)二氧化硅再填充(图11A)。晶片的顶部表面经过化学机械抛光，并涂布有为PZT沉积提供均匀的基层的附加的高温低压化学气相沉积(LPCVD)二氧化硅。通过此步骤产生的装置层中的隔离结构成为精确定义的完整平台(如框架和镜平台)的刚性硅元件。
接下来，在制备的晶片上沉积底电极(Ti/Pt，200nm)、压电(PNZT晶种/化学溶液PZT，1.2μm)和顶部电极(Pt，120nm)，并通过反应离子蚀刻(RIE)依次图案化。如图11B所示，然后通过剥离工艺将结构铝层(1μm)图案化到电极的选定区域的顶部表面，以改善接合垫强度并调节悬臂梁的下弯部分的中性轴。如前所述并如图10和图11C所示，为了提高电互连的可靠性，沉积聚对二甲苯-C膜(560nm)、二氧化硅(230nm)层和附加铝层(1μm)以产生从PZT膜的顶部和底部电极到直接在二氧化硅晶片表面上图案化的接合垫的电跳线，其对于在内窥显微镜仪器的受限空间中所需的引线接合具有明显更好的可靠性。
使用一系列深沟槽蚀刻步骤从硅晶片释放致动器腿535。首先，如图11D所示，执行硅DRIE和二氧化硅RIE步骤以蚀刻穿过致动腿之间的埋式氧化物。接下来，执行两级背面DRIE，其中在各个致动器腿下方进行初始蚀刻(图11E)，然后在所有运动零件下方进行完全背面区域蚀刻(图11F)。通过在完成背面DRIE工艺之前蚀刻最初由背面蚀刻的较深部分暴露的二氧化硅层，可释放独立的薄膜PZT梁元件，同时保留固体硅平台作为镜平台或镜本身(图11G)。在此最后的释放步骤期间，由于在较早步骤中形成的二氧化硅填充的沟槽(图11A)，可利用SF6或XeF2蚀刻来处理硅的不均匀蚀刻或微柱的形成。利用优化的蚀刻参数和层厚度，可省略装置层中的保护性二氧化硅沟槽(图11A)的形成。
两个光子激发的荧光强度与焦点处的光子通量具有非线性关系，因此当轴向扫描单元130在平面外时激光强度必须是稳定的。在致动器系统130a的制作中，DRIE和其它过程可引起腿的结构不对称。因此，大的平面外运动可引起镜表面产生小的倾斜角，并因此可使光束散焦。为了确定倾斜角如何影响成像，执行光线跟踪模拟。开发了具有近轴透镜的模型，所述模型具有与透镜113和120相同的焦距。当镜扫描时，轴向扫描单元130在不同的轴向位置处并且以不同的倾斜角使用点扩散函数。轴向点扩散函数的峰强度可用作评估焦点处激光功率变化的度量。
使用此模型，可确定轴向MEMS扫描器130所需的轴向位移和镜尺寸。此信息可用于设计MEMS扫描器的参数，以便实现在轴向扫描期间峰强度变化小于10％的水平或垂直平面中的250×250μm2的视野。
为了证明轴向MEMS扫描器130的性能，在XY和XZ平面中成像直径为大约30至40μm的自发荧光花粉。通过以1μm步长在轴向方向上移动样品50μm来获得在水平(XY)平面收集的图像的3D堆叠。然后重建垂直投影(XZ)并与利用轴向扫描器在垂直平面(XZ)中收集的图像进行比较。
根据模拟结果，轴向扫描单元130的位移和焦斑具有大约1:1的放大率。示出在倾斜角为0°、0.8°和1.6°的情况下，轴向扫描器在Z轴中100μm上位移(图12A-C)或100μm下位移(图12D-F)的点扩散函数的变化的结果。对于模拟结果，倾斜角小至1.6°可将峰强度降低20％以上。
转到图13A-C，图13A是在水平扫描模式下的花粉的XY图像，其中视野为100×100μm2。收集水平图像，同时以50μm的增量轴向地移动样本。从随后的3D重建中提取垂直图像，如图13B所示。相比之下，我们通过平移图13C中的镜115直接在垂直平面中收集图像，两种类型的XZ图像的视野都为100×50μm2。在这两种类型的垂直图像之间没有观察到明显的分辨率或强度变化。换句话说，无论是否执行XY或XZ扫描，都可看到作为成像深度的函数的相同强度的返回光。
图14A是示出不同的隐窝结构的在水平(XY)平面上在270×270μm2的FOV中获得的样本的代表性图像。可区分六边形包装的圆形隐窝(如箭头所示)，其具有围绕中心内腔(l)的均匀尺寸。在细胞质(c)中可看到粘蛋白填充的杯状细胞(g)，其产生均匀的荧光。可在固有层(lp)中识别个体炎性细胞(箭头)。图14B是在相同的位置的视野为270×200μm2的XZ图像。内腔(1)现在垂直取向，并且看到杯状(g)细胞在顶端到基底方向上分布。
图15至图16D示出轴向致动器系统630a的替代设计。替代设计可在硅晶片上适应附加的方形致动器。中心镜或镜平台632由四个蛇形压电弯曲梁、腿或致动器635支撑，其中压电堆叠材料变化以在梁635的连续区段中产生选择性上弯或下弯运动。这引起镜表面632的明确限定的垂直平移在理想条件下通过结构的对称性进一步增强。
轴向致动器系统630a具有用于最终集成到5mm直径或更小的内窥显微镜仪器中的大约3mm×3mm×0.5mm的总尺寸，以及致动器635设计，所述设计包括四个1.2mm长的单独光束以产生沿光轴的约400μm的垂直(即，平面外)位移，以利用约100Hz的固有频率在垂直于组织表面的平面中产生图像。致动器635在近共振下操作，其中Lissajous扫描用于从垂直压电致动器和面内静电扫描镜的组合运动中提取图像。使用共振操作可在低电压下实现大扫描范围，以及镜的动态平衡，以用于均匀的垂直运动，即使只有单个输入到四个驱动腿。
前面的描述证明了一种新颖的多光子显微镜，所述多光子显微镜使用远程扫描配置和MEMS扫描器来提供实时可切换的XY/XZ成像。轴向MEMS扫描器以大约440Hz的机械共振频率在共振模式下工作，产生200um范围的880Hz的线扫描速率。这种高速轴向扫描技术可用于研究快速生物过程，如活体动物中神经元之间的动作电位。虽然超快脉冲聚焦在轴向MEMS上，但在50mW激光功率下暴露一小时后，没有观察到镜表面损坏的迹象。通过将镜涂层从铝改变为金，可进一步提高损伤阈值。横向MEMS扫描器也以内轴和外轴的共振频率为大约4kHz和1kHz在共振模式下工作。Lissajous扫描用于FOV分别为250μm×250μm和250μm×200μm、帧速率为5Hz的水平或垂直平面成像。这些MEMS扫描器非常紧凑，占地面积为约3mm×3mm，同时维持良好的机械性能。它们还具有高可靠性、低成本且易于批量生产。这些MEMS扫描器可以是传统显微镜中使用的大型致动器的良好替代物。通过使用这种扫描策略，可开发出具有实时水平和垂直切片功能的超紧凑型活体显微镜，或甚至微型装置。另外，在一些系统中，可在具有与本文所述的轴向扫描致动器类似的几何形状的布置中使用电热、电磁和/或其它微致动器，或使用具有偏移电极的静电致动器来实现低频(DC)扫描来完成轴向扫描。
在依赖于弯曲梁架构的大位移垂直台中，中心台运动可对各个腿中的不对称非常敏感，这可以是由于残余应力的局部变化、光刻未对准或其它加工非理想性造成的。处理非均匀中心台运动的一种方式是通过向两个或更多个腿施加不同的电压来校准和补偿不对称性。通过识别多个振动模式的贡献产生几乎纯垂直平移的频率，可实现均匀的垂直运动，从而允许仅通过输入到台的电压来执行平衡。
图17是示出用于实施本文所讨论的薄膜压电多光子内窥显微镜802的实例实施例的各种部件的实例框图800。本文先前讨论的光学器件150可根据执行所公开实施例的功能而定位在样本103附近或可操作地联接到样本103。装置802可具有控制器804，所述控制器804经由连接到输入/输出(I/O)电路812的链路822可操作地连接到数据库814。应当注意，虽然未示出，但是可以已知的方式将附加数据库链接到控制器804。控制器804包括程序存储器806、处理器808(可称为微控制器或微处理器)、随机存取存储器(RAM)810和输入/输出(I/O)电路812，所有这些都是通过地址/数据总线820互连。应当理解，尽管仅示出了一个微处理器808，但是控制器804可包括多个微处理器808。类似地，控制器804的存储器可包括多个RAM 810和多个程序存储器806。尽管I/O电路812被示出为单个块，但是应当理解，I/O电路812可包括许多不同类型的I/O电路。举例来说，RAM 810和程序存储器806可被实施为半导体存储器、磁性可读存储器和/或光学可读存储器。链路824可通过I/O电路812将控制器804可操作地连接到光学器件150。
程序存储器806和/或RAM 810可存储由微处理器808执行的各种应用程序(即，机器可读指令)。举例来说，操作系统830通常可控制内窥显微镜802的操作并向测试设备提供用户界面以实施本文描述的过程。程序存储器806和/或RAM 810还可存储用于访问内窥显微镜802的特定功能的各种子例程832。作为实例而非限制，子例程832可尤其包括：用于控制如本文所述的光学装置150或其它内窥镜装置的操作的子例程；用于利用如本文所述的光学器件150捕获图像的子例程；和其它子例程，例如，实施软件键盘功能、与内窥显微镜802中的其它硬件交接的子例程等。程序存储器806和/或RAM 810还可存储与内窥显微镜802的配置和/或操作有关、和/或与一个或多个子例程的操作有关的数据。举例来说，数据可以是由光学器件150收集的数据、由处理器808确定和/或计算的数据等。除了控制器804之外，内窥显微镜802还可包括其它硬件资源。内窥显微镜802还可联接到各种类型的输入/输出硬件，如视觉显示器826和(一个或多个)输入装置828(例如，小键盘、键盘等)，以微调轴向和横向扫描器的致动。在实施例中，显示器826是触敏的，并且可与软件键盘例程协作作为软件例程832中的一个以接受用户输入。
在整个本说明书中，多个示例可实施被描述为单个示例的部件、操作或结构。尽管一个或多个方法的各个操作被示出并描述为单独的操作，但是可同时执行单独的操作中的一个或多个，并且不需要以所示的顺序执行操作。在实例配置中作为单独部件呈现的结构和功能可被实施为组合结构或部件。类似地，作为单个部件呈现的结构和功能可被实施为单独的部件。这些和其它变化、修改、添加和改进都落入本文主题的范围内。
另外，本文将某些实施例描述为包括逻辑或许多例程，子例程、应用程序或指令。这些可构成软件(例如，在非暂时性机器可读介质上体现的代码)或硬件。在硬件中，例程等是能够执行某些操作的有形单元，并且可以某种方式配置或布置。在实例实施例中，一个或多个计算机系统(例如，独立的客户端或服务器计算机系统)或计算机系统的一个或多个硬件模块(例如，处理器或处理器组)可由软件(例如，应用程序或应用程序部分)配置为操作以执行如本文所述的某些操作的硬件模块。
在各种实施例中，硬件模块可机械地或电子地实施。举例来说，硬件模块可包含永久配置的专用电路或逻辑(例如，作为专用处理器，如现场可编程门阵列(FPGA)或专用集成电路(ASIC))以执行某些操作。硬件模块还可包含由软件临时配置以执行某些操作的可编程逻辑或电路(例如，包含在通用处理器或其它可编程处理器内)。应当理解，可通过成本和时间考虑来驱动机械地在专用和永久配置的电路中或在临时配置的电路中(例如，由软件配置)实施硬件模块的决定。
因此，术语“硬件模块”应该被理解为包含有形实体，即被物理构造、被永久配置(例如，硬连线)或被临时配置(例如，编程)为以某种方式操作或执行本文描述的某些操作的实体。考虑其中临时配置(例如，编程)硬件模块的实施例，不需要在任何一个时刻配置或实例化硬件模块中的每个。举例来说，在硬件模块包含使用软件配置的通用处理器的情况下，通用处理器可在不同时间被配置为相应的不同硬件模块。因此，软件可配置处理器，以例如在一个时刻构成特定硬件模块，并在不同时刻构成不同的硬件模块。
硬件模块可向其它硬件模块提供信息并从其接收信息。因此，所描述的硬件模块可被视为通信地联接。在同时存在多个这类硬件模块的情况下，可通过连接硬件模块的信号传输(例如，通过适当的电路和总线)来实现通信。在其中在不同时间配置或实例化多个硬件模块的实施例中，可例如通过存储和检索多个硬件模块可访问的存储器结构中的信息来实现这类硬件模块之间的通信。举例来说，一个硬件模块可执行操作并将所述操作的输出存储在与其通信联接的存储器装置中。然后，另一硬件模块可稍后访问存储器装置以检索和处理存储的输出。硬件模块还可启动与输入或输出装置的通信，并且可对资源进行操作(例如，信息收集)。
本文中所描述的实例方法的各种操作可至少部分地由被临时配置(例如，通过软件)或被永久配置为执行相关操作的一个或多个处理器执行。无论是临时配置还是永久配置，这类处理器可构成操作以执行一个或多个操作或功能的处理器实施的模块。在一些实例实施例中，本文提及的模块可包含处理器实施的模块。
类似地，本文所描述的方法或例程可至少部分是处理器实施的。举例来说，方法的操作中的至少一些可通过一个或多个处理器或处理器实施的硬件模块执行。操作的特定性能可分布在不仅驻存在单一机器内，而且还跨越多个机器部署的一个或多个处理器当中。在一些实例实施例中，一个或多个处理器可位于单个位置中(例如，位于家庭环境、办公室环境或服务器集群内)，而在其它实施例中，处理器可跨越多个位置分布。
操作的特定性能可分布在不仅驻存在单一机器内，而且还跨越多个机器部署的一个或多个处理器当中。在一些实例实施例中，一个或多个处理器或处理器实施的模块可位于单个地理位置中(例如，家庭环境、办公室环境或服务器集群内)。在其它实例实施例中，一个或多个处理器或处理器实施的模块可跨越多个地理位置分布。
除非另有特定说明，否则在本文中使用如“处理”、“运算”、“计算”、“确定”、“呈现”、“显示”等词的论述可指操控或变换一个或多个存储器(例如，易失性存储器、非易失性存储器或其组合)、寄存器或接收、存储、传输或显示信息的其它机器部件内的表示为物理(例如，电子、磁性或光学)量的数据的机器(例如，计算机)的动作或过程。
如本文所使用，对“一个实施例”或“实施例”的任何参考意味着结合实施例所描述的特定元件、特征、结构或特性包括于至少一个实施例中。短语“在一个实施例中”在说明书中的各处的出现不一定都指相同实施例。
可使用表达“联接”和“连接”以及它们的派生词来描述一些实施例。举例来说，可使用术语“联接”来描述一些实施例，以指示两个或更多个元件处于直接物理或电接触。然而，术语“联接”还可表示两个或更多个元件彼此不直接接触，但仍然彼此协作或交互。实施例不限于此上下文。
本领域的技术人员将认识到，在不脱离本发明的范围的情况下，可关于上述实施例作出各种修改、改变和组合，且这类修改、改变和组合被视为在本发明概念的范围内。

Claims (18)

1.一种多光子光学探针，包含：
探针壳体，其具有近端和定位在样品处的远端，所述探针壳体适于产生输出激光能量；
横向扫描台，其联接到横向镜组件并且至少部分地设置在所述探针壳体中，所述横向扫描台适于通过移动所述横向镜组件在所述样品的平面扫描区域上扫描所述输出激光能量；和
轴向扫描台，其联接到轴向镜组件并且至少部分地设置在所述探针壳体中，所述轴向扫描台适于在所述样品的深度范围内扫描所述输出激光能量，其中所述深度范围和所述平面扫描区域形成三维体积；
其中所述轴向扫描台包含围绕所述轴向镜组件轴向地定位在水平平面中的多个致动腿，并且
其中所述横向扫描台和所述轴向扫描台是被定位为提供单轴多光子探针的独立扫描台。
2.根据权利要求1所述的多光子光学探针，其中所述多个致动腿围绕所述轴向镜组件对称地定位。
3.根据权利要求1所述的多光子光学探针，其中所述轴向扫描台包含至少一个传感器，所述传感器适于感测所述多个致动腿中的至少一个的位移。
4.根据权利要求3所述的多光子光学探针，其中所述至少一个传感器包含设置在至少一个致动腿上的压阻传感器。
5.根据权利要求1所述的多光子光学探针，其进一步包含围绕所述轴向镜组件轴向地定位的多个电连接器。
6.根据权利要求5所述的多光子光学探针，其中所述多个电连接器中的每一个包含从顶部电极和底部电极延伸到在所述轴向扫描台上图案化的接合垫的电跳线。
7.根据权利要求6所述的多光子光学探针，其中所述电跳线包含聚对二甲苯膜、二氧化硅层和金属层。
8.根据权利要求1所述的多光子光学探针，其进一步包含适于扫描所述样品的远端光学器件。
9.根据权利要求8所述的多光子光学探针，其中所述远端光学器件的直径小于3.4mm。
10.根据权利要求1所述的多光子光学探针，其进一步包含至少部分地设置在所述探针壳体中的激光器和光收集电子器件，所述激光器和光收集电子器件包含半波片、线性偏振器和至少一个透镜。
11.根据权利要求8所述的多光子光学探针，其中所述横向扫描台、所述轴向扫描台和所述远端光学器件通过光纤连接联接。
12.根据权利要求8所述的多光子光学探针，其中所述横向扫描台邻近所述远端光学器件定位，并且所述轴向扫描台远离所述远端光学器件定位。
13.一种用于多光子光学探针的轴向扫描台，所述轴向扫描台包含：
框架；
镜平台，其联接到所述框架，所述镜平台适于支撑镜元件；
多个致动器腿，其联接到所述框架和所述镜平台，所述多个致动器腿适于沿垂直轴升高所述镜平台；和
多个电连接器，其围绕所述镜平台定位；
其中所述多个致动器腿和所述多个电连接器围绕所述镜平台轴向地定位。
14.根据权利要求13所述的轴向扫描台，其中所述多个致动器腿和所述多个电连接器围绕轴向镜组件对称地定位。
15.根据权利要求13所述的轴向扫描台，其进一步包含至少一个传感器，所述传感器适于感测所述多个致动器腿中的至少一个的位移。
16.根据权利要求15所述的轴向扫描台，其中所述至少一个传感器包含设置在至少一个致动器腿上的压阻传感器。
17.根据权利要求13所述的轴向扫描台，其中所述多个电连接器中的每一个包含从顶部电极和底部电极延伸到在所述轴向扫描台上图案化的接合垫的电跳线。
18.根据权利要求17所述的轴向扫描台，其中所述电跳线包含聚对二甲苯膜、二氧化硅层和金属层。
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