JP4605447B2 - ３次元共焦点顕微鏡システム - Google Patents

Description

本発明は、３次元共焦点顕微鏡システムに関し、詳しくは、観察試料に対し光刺激を行うためのレーザ光を照射する機能を備えた３次元共焦点顕微鏡システムに関するものである。

共焦点顕微鏡は、試料を薄切片にすることなくスライス画像が得られ、そのスライス画像から試料の正確な３次元立体像を構築できるので、生物やバイオテクノロジーなどの分野における生きた細胞の生理反応観察や形態観察あるいは半導体市場におけるＬＳＩの表面観察などに使用されている（例えば、特許文献１参照）。

図７は特許文献１に記載の共焦点顕微鏡システムの構成図である。ビデオレートカメラ１、共焦点スキャナ２、顕微鏡３、アクチュエータ４および対物レンズ５は、同じ光軸上に配置されている。共焦点スキャナ２は、多数のピンホールを持つニポウディスクと、それに対応するマイクロレンズアレイを有するもので、シンプルな光学系から成るニポウディスク方式を採用したコンパクトなアドオンタイプである。

この共焦点スキャナ２は顕微鏡３のカメラポートに取り付けられる。共焦点顕微鏡は、レーザ光を使用して、対物レンズ５、アクチュエータ４および顕微鏡３を経由して、試料の像を共焦点スキャナ２に入力する。共焦点スキャナ２は、試料の共焦点画像を得て、ビデオレートカメラ１に入力する。

図８は、図７の共焦点顕微鏡システムが取り扱う各種信号のタイムチャートである。ビデオレートカメラ１は、共焦点画像をビデオ信号１０１に変換し、共焦点スキャナ２、同期インターフェイスボックス９の信号入力端子および画像処理装置６の画像入力端子にビデオ信号１０１を入力する。共焦点スキャナ２は、ビデオ信号１０１に同期して、ニポウディスクの回転同期制御を行う。

画像処理装置６にビデオテープデッキを採用する場合、ビデオテープデッキは、画像入力端子から入力されるビデオ信号１０１と、音声入力端子から入力される開始信号１０３を長時間用のビデオテープに同時に記録する。ビデオテープには、リアルタイムに変化する共焦点画像と対物レンズ５の焦点位置の走査開始のタイミングが同時に記録される。

同期インターフェイスボックス９は、ビデオ信号１０１の偶数側パルス列または奇数側パルス列の何れか一方を抽出し、内部Ａ信号を作成する。任意波形発生器７は、Ｈレベルのパルス信号であるトリガ信号１０２を発生し、同期インターフェイスボックス９のトリガ入力端子に入力して、焦点面の走査の開始タイミングに利用する。

同期インターフェイスボックス９は、トリガ信号１０２の立下りに同期して、内部Ｂ信号を作成する。内部Ｂ信号は、Ｈレベルのパルス幅時間が３５ｍｓｅｃ程度であり、ビデオレートカメラ１のビデオレートの時間に比して若干長いパルス信号である。同期インターフェイスボックス９は、内部Ａ信号の反転信号と内部Ｂ信号とを論理積演算することにより、開始信号１０３を発生し、画像処理装置６および任意波形発生器７の同期入力端子に入力する。

画像処理装置６は、同期入力端子からの開始信号１０３の立上りに同期して、ビデオ信号１０１を画像データに変換し記録するキャプチャを開始する。同期インターフェイスボックス９は、信号入力端子からのビデオ信号１０１に基づいて、共焦点スキャナ２によるニポウディスクの回転同期制御、画像処理装置６によるビデオ信号の取得の開始タイミング、および光学制御系による対物レンズの焦点位置の走査開始のタイミングを全て同期させる。

任意波形発生器７は、開始信号１０３の立上りに同期して、光学制御系による対物レンズ５の焦点位置の走査を開始する。任意波形発生器７は、走査信号１０４を発生し、コントローラ８に入力する。走査信号１０４は、ＬレベルからＨレベルまで一定時間で直線的に増加するノコギリ波状の信号である。コントローラ８は、走査信号１０４をアクチュエータ４に入力する。アクチュエータ信号１０５は実際のアクチュエータの位置信号であり、伸びきってから一気に原点に戻ったあとにオーバーシュートがあり、この間は不感帯となる。

アクチュエータ４は、顕微鏡３の対物レンズレボルバーと対物レンズ５との間に取り付けられ、ピエゾ駆動により走査信号１０４のレベルに比例して画像の焦点方向の長さが変化し、対物レンズ５の焦点位置を制御する。共焦点顕微鏡は、走査信号１０４に基づいて、焦点面を走査することにより、試料のスライス画像を取得する。

このような構成によれば、ニポウディスクの回転同期制御、画像処理装置によるビデオ信号の取得の開始タイミングおよび光学制御系によるレンズの焦点位置の走査開始のタイミングが、すべてビデオ信号に同期することにより、共焦点画像の位置精度が向上し、複数のスライス画像を取得する際に個々の取得時間のバラツキがなくなるので、信頼性の高いスライス画像が得られる。

図９は、従来の共焦点顕微鏡の一例を示した構成図である。
図９において、共焦点スキャナ１１０は、顕微鏡１２０のポート１２２に接続してあり、レーザ光１１１は、マイクロレンズアレイディスク１１２のマイクロレンズ１１７により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１１３を透過後、ピンホールアレイディスク（以下、ニポウディスクという。）１１４の個々のピンホール１１６を通過し、顕微鏡１２０の対物レンズ１２１により、ステージ１２３上の試料１４０に集光される。

試料１４０から出た蛍光信号は、再び対物レンズ１２１を通り、ニポウディスク１１４の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した蛍光信号は、ダイクロイックミラー１１３で反射され、リレーレンズ１１５を介してイメージセンサ１３１に結像されるように共焦点スキャナ１１０より出射される。このような装置では、図示しないモータでニポウディスク１１４を一定速度で回転させており、この回転よるピンホール１１６の移動により試料１４０への集光点を走査している。

ニポウディスク１１４のピンポールが並んでいる平面と、試料１４０の被観察平面と、イメージセンサ１３１の受光面とは互いに光学的に共役関係に配置してあるので、イメージセンサ１３１上には試料１４０の光学的断面像、即ち共焦点画像が結像される（例えば、特許文献２参照。）。
また、上述のニポウディスク方式の共焦点顕微鏡の他にガルバノミラーを用いて試料への集光点を走査し、共焦点画像を取得するものもある（例えば、特許文献３参照。）。

特開２００２−７２１０２号公報 特開平５−６０９８０号公報 特開平５−２１００５１号公報

このような共焦点顕微鏡を用いた画像計測では、細胞などの試料に対して光刺激を行い、時間経過に対する状態変化（フォトアクチベーションやＦＲＡＰ（fluorescence recovery after photobleaching）など）を観察したいという要求がある。フォトアクチベーションとは、例えば細胞の所定の部分に画像測定用レーザ光以外の第２のレーザのスポット光を照射して、その部分の蛍光色を変化させてマーキングする。このマーキングが時間経過により、細胞に広がっていく様子を観察するものである。
また、ＦＲＡＰ（蛍光褪色法）とは、蛍光タンパクを発現した細胞の蛍光を、第２のレーザ光の照射により部分的に褪色させて、細胞における蛍光褪色後のタンパク質の局在変化を観察するものである。

しかしながら、上述の従来のニポウディスク方式の共焦点顕微鏡には、試料に光刺激を与えてその変化を観察する機能を備えたものはない。
また、ガルバノミラー方式の共焦点顕微鏡では２次元走査のためのガルバノミラーの制御に時間がかかり、光刺激や蛍光褪色などの高速な反応についてはリアルタイムでの画像計測が困難である。
さらに、３次元構造を持つ試料に対しては、光刺激が届かない、あるいは不十分であることが考えられる。それにより、光刺激後の試料観察の結果に正確さを欠くことになるという問題があった。

本発明は、このような従来の共焦点顕微鏡が有していた問題を解決しようとするものであり、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に光刺激のための第２のレーザ光を照射する機能を付加した共焦点顕微鏡を用いて、３次元の画像計測を行うことにより、光刺激後の試料の観察を３次元的に正確に行える３次元共焦点顕微鏡システムを実現することを目的とするものである。

本発明は次の通りの構成になった共焦点顕微鏡である。

（１）顕微鏡を介して試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、
前記共焦点画像の画像データを出力するビデオカメラと、
前記顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータと、
このアクチュエータを介して前記対物レンズを光軸方向に走査するための走査波形信号を発生する制御部と、
前記ビデオカメラで取得した画像データに基づき前記試料の３次元画像を生成する画像処理部と、
を備えた３次元共焦点顕微鏡システムであって、
前記顕微鏡に接続され、前記試料に刺激を与えるレーザ光を出力するレーザ光出力手段を有し、
前記対物レンズを走査して前記試料に対して光軸方向に刺激を与え、
前記対物レンズの一方向の走査で刺激を与え、これに続いて他方向の走査で前記共焦点画像を取得することを特徴とする３次元共焦点顕微鏡システム。

（２）前記試料に刺激を与えるレーザ光のスポット径を調整する可変絞り手段を備えたことを特徴とする（１）に記載の３次元共焦点顕微鏡システム。

（３）前記試料に刺激を与えるレーザ光を２次元に走査させる走査手段を有することを特徴とする（１）または（２）に記載の３次元共焦点顕微鏡システム。

（４）前記レーザ光出力手段は、前記試料に刺激を与えるレーザ光と、このレーザ光が前記試料へ照射される位置を示すためのレーザ光とを合波して出力することを特徴とする（１）から（３）のいずれかに記載の３次元共焦点顕微鏡システム。

（５）前記試料を刺激する際の走査波形と前記試料を観察する際の走査波形をそれぞれ任意に設定することを特徴とする（１）から（４）のいずれかに記載の３次元共焦点顕微鏡システム。

（６）前記３次元共焦点顕微鏡システムは、フォトアクチベーションまたは蛍光褪色に用いられることを特徴とする（１）から（５）のいずれかに記載の３次元共焦点顕微鏡システム。

本発明によれば、以下のような効果がある。

請求項１および請求項６に記載の発明によれば、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に光刺激用のレーザ光を照射する機能を備えたことによって、フォトアクチベーションやＦＲＡＰなどが可能となる。
また、蛍光観察、すなわち画像計測はニポウディスク式共焦点スキャナで行うことで高速性（例えば１０００フレーム／秒のスキャンスピード）が実現できるため、光刺激や蛍光褪色に係る高速反応をリアルタイムで観察することができる。
さらに、このような共焦点顕微鏡を用いて、３次元の画像計測を行うことにより、光刺激後の試料の観察を３次元的に正確に行える共焦点顕微鏡を実現することができる。

請求項２に記載の発明によれば、可変絞り手段を設けて、光刺激用レーザ光の照射ＮＡ（開口数）を変えることにより、光刺激のスポット径を可変にし、光刺激する範囲の大きさを変えられるようになる。

請求項３に記載の発明によれば、光刺激用のレーザ光の２次元スキャンにより、試料の形状に合わせた光刺激を可能にする。

請求項４に記載の発明によれば、光刺激用のレーザ光と刺激を与えている位置を示すためのレーザ光とを合波して試料に照射することにより、光刺激用のレーザ光が紫外光であっても位置表示用のレーザ光により励起された蛍光波長が可視光であるため、光刺激を行うポイントが目視可能となる。

請求項１に記載の発明によれば、例えば、対物レンズ駆動の上り（焦点位置を試料の下から上に移動させる）で光刺激を行い、対物レンズ駆動の下り（焦点位置を試料の上から下に移動させる）で画像計測を行うことにより、光刺激から画像計測までの時間を短縮できる。

請求項５に記載の発明によれば、例えば、対物レンズ駆動の上りを直線的に走査して光刺激を行い、対物レンズ駆動の下りは、ステップ波形で走査するような、異なる波形を組み合わせることにより、光刺激や画像計測に適した走査波形により試料の観測を行うことができる。

以下図面を用いて本発明を詳細に説明する。図１は本発明に係る３次元共焦点顕微鏡システムの一実施例を示す構成図である。前出の図と同様の構成要素には同様の符号を付けてその部分の説明は省略する。

図１において、共焦点スキャナ２ａは、従来技術で説明したものと同様のニポウディスク方式であり、多数のピンホールを持つニポウディスクと、それに対応するマイクロレンズアレイを有する。

この共焦点スキャナ２ａは顕微鏡（蛍光顕微鏡）３ａの第１のポート２４（カメラポート）に光路２２を介して取り付けられ共焦点顕微鏡が構成される。共焦点顕微鏡は、レーザ光を使用して、対物レンズ５ａ、アクチュエータ４ａおよび蛍光顕微鏡３ａを経由して、試料２０の蛍光像を共焦点スキャナ２ａに入力する。共焦点スキャナ２ａは、試料２０の共焦点画像を得て、光路２３を介してその共焦点画像をカメラ１ａに入力する。カメラ１ａは、共焦点画像を撮像し画像データを取得する。カメラ１ａ、共焦点スキャナ２ａおよび蛍光顕微鏡３は支持台２１に設置されている。

画像計測レーザ光源３０は、ファイバ３１を介して共焦点スキャナ２ａに試料２０の共焦点画像を得るための蛍光励起を行う波長λ１のレーザ光を供給する。光刺激レーザ光源３２は、蛍光顕微鏡３ａの第２のポート２５にファイバ３３を介して取り付けられ、光刺激を行う波長λ２のレーザ光を供給する。試料２０は観察対象の細胞などであり、ステージ２６に固定される。ステージ２６はステージ支持部２７に取り付けられている。

同期信号制御器１０は、波形発生器７ａの２ＣＨから出力される垂直同期信号を受けて、これを基に各種のトリガ信号を生成する。
波形発生器７ａは、同期信号制御器１０からの走査波形発生トリガ信号を受信すると、あらかじめパーソナルコンピュータ２８（以下ＰＣ２８という。）の波形計算部１１から送られ記憶した走査波形を１ＣＨから発生して、アクチュエータドライバ１２へ送る。

波形計算部１１は、試料２０を観察する際の対物レンズ５ａの走査周期と光軸方向の走査距離から、走査波形を計算によって求め、それを走査波形データとして波形発生器７ａに出力する。
アクチュエータドライバ１２は、波形発生器７ａから出力される走査波形信号に基づいて、アクチュエータ４ａを駆動するための駆動信号を発生する。
このアクチュエータ４ａを介して対物レンズ５ａを光軸方向に走査するための走査波形信号を発生する部分が制御部である。

アクチュエータ４ａは、蛍光顕微鏡３ａの対物レンズレボルバーと対物レンズ５ａとの間に取り付けられ、ピエゾ駆動により走査信号のレベルに比例して画像の焦点方向の長さが変化し、対物レンズ５ａの焦点位置を制御する。つまり、波形発生器７ａの出力波形に従って対物レンズ５ａが光軸方向に走査される。
これにより、試料に対して３次元の光刺激が行えると共に画像計測時は試料２０の光軸方向のスライス画像がカメラ１ａにより取得される。

また、アクチュエータ４ａには、自身の位置をセンシングする位置センサ（図示せず）が設けられている。この位置センサが位置信号を出力してアクチュエータドライバ１２ａにフィードバックすることにより、アクチュエータ４ａの位置制御が行われる。

ＰＣ２８の画像処理部６ａは、対物レンズ５ａの走査開始に同期してカメラ１ａからの画像データが入力され、試料２０の断面スライス像を連続的に取得する。これらのスライス画像を合成することにより、試料の３次元画像を生成する。

このような構成の動作を、図２に示す各信号のタイムチャートを参照して説明する。
図２は、図１に記載の３次元共焦点顕微鏡システムで取り扱われる各信号のタイムチャートである。横軸が時間を示し、縦軸が信号レベルを示している。

波形発生器７ａは、ユーザが設定する画像取込のフレームレートに合わせて、周期的なパルス信号（垂直同期信号（ａ））を出力する。同期信号制御器１０では、この周期的なパルス信号を元に、各種トリガ信号を生成する。

波形発生器７ａから同期信号制御器１０に予め設定された周期の垂直同期信号（ａ）が送られると、同期信号制御器１０では、この垂直同期信号（ａ）を基に共焦点スキャナ２ａへニポウディスクの回転同期制御を行う同期信号を送ると共に、各種トリガ信号すなわち光刺激のための走査波形発生トリガ信号（ｂ）、画像計測のための走査波形発生トリガ信号（ｄ）を生成する。

また、同期信号制御器１０は、垂直同期信号（ａ）をそのままカメラ１ａに出力し、カメラ１ａは、この垂直同期信号（ａ）に同期して画像を取り込み、内部メモリに保存していく。保存された画像データは、メモリが一杯になると最古のデータが最新のデータに上書きされる。

同期信号制御器１０では、ＰＣ２８から画像取込開始信号を受信すると、画像取込開始信号がLOWになった後の最初の垂直同期信号に同期した光刺激のための走査波形発生トリガ信号（ｂ）を波形発生器７ａへ送る。

同時に、光刺激レーザ光源３２に、この走査波形発生トリガ信号（ｂ）に同期した照射ＯＮ／ＯＦＦ信号（ｃ）を送信し、内蔵されたシャッタ（図示せず）を開けて光刺激用のレーザ照射をＯＮ状態にする。
光刺激用レーザ光の照射ＯＮ時間は、光刺激を行うための焦点位置の走査開始から終了までの時間であって、ＰＣから同期信号制御器１０に設定される。
なお、画像取込開始信号は、操作者によりＰＣ２８から任意のタイミングで同期信号制御器１０に入力する信号であり、そのパルス幅は垂直同期信号の周期の２倍以上である。

波形発生器７ａは、走査波形発生トリガ信号（ｂ）を受信すると、予めＰＣ２８にある波形計算部１１から送られてきた走査波形データに基づき走査波形信号（ｆ１）を発生して、アクチュエータドライバ１２に送信し、アクチュエータ４ａを駆動する。焦点位置は走査波形の信号レベルに応じて変化するので走査波形信号（ｆ１）の変化を焦点位置の変化として示している。
このように、アクチュエータ４ａの駆動によって対物レンズ５ａの焦点面を連続的に変えて、試料２０に対して光刺激を３次元的に行う。

光刺激動作が終了すると、同期信号制御器１０では、画像計測のための走査波形発生トリガ信号（ｄ）を波形発生器７ａへ送信すると共にＰＣ２８へ垂直同期信号（ａ）に同期した画像取込信号（ｇ）を送る。
同時に、画像計測用レーザの照射ＯＮ／ＯＦＦ信号（ｅ）を共焦点スキャナ２ａに送信し、内蔵されているシャッタ（図示せず）を開き画像計測用のレーザ照射をＯＮ状態にする。

波形発生器７ａでは、走査波形発生トリガ信号（ｄ）を受信すると、予めＰＣにある波形計算部１１から送られてきた走査波形データに基づき走査波形信号（ｆ１）を発生して、アクチュエータドライバ１２に送信し、アクチュエータ４ａを駆動する。
ＰＣ２８は、画像取込信号（ｇ）を受けて、この画像取込信号（ｇ）に同期したカメラ制御信号によりカメラ１ａから画像データを出力させる。

このように、アクチュエータ４ａの駆動によってレンズの焦点面を連続的に変え、アクチュエータ４ａの走査に同期して、カメラ１ａで試料の断面スライス像を連続的に生成した画像データをＰＣ２８の画像処理部６ａで３次元画像に合成する。

走査波形信号（ｆ１）は、ステップ波形（段階的に増加して元のレベルにもどる波形）であり、試料の深さ（光軸）方向の各ステップ（平らな部分）で蛍光画像計測を行うため鮮明な画像を取得できる。

また、アクチュエータ４ａを走査する走査波形には図３に示すような波形を用いてもよい。
図３は、図１に記載の３次元共焦点顕微鏡システムで取り扱われる各信号の他のタイムチャートである。前出の図２と同様の信号には同様の名称と符号を付してその説明は省略する。

図３において、走査波形（ｆ２），（ｆ３），（ｆ４）は、波形発生器７ａが、波形発生トリガ信号（ｄ）を受信することにより出力する走査波形を例示したものであって、予めＰＣ２８にある波形計算部１１から送られてきた走査波形データをアナログ波形に変換したものである。これらの走査波形のいずれかを用いてアクチュエータを駆動する。

走査波形（ｆ２）によれば、ステップ波形のステップごとに対物レンズ駆動の上り（焦点位置を試料の下から上に移動させる）で光刺激を行い、対物レンズ駆動の下り（焦点位置を試料の上から下に移動させる）で画像計測を行う。これにより、光刺激から画像計測までの時間を短縮できる。

走査波形（ｆ３）によれば、二等辺三角形状の走査波形を用いて走査波形（ｆ２）と同様に対物レンズ駆動の上りで光刺激を行い、対物レンズ駆動の下りで画像計測を行う。これにより、試料に対して深さ方向の光刺激をもれなく行うことができる。また、画像計測においても、１フレームを撮像する間に試料の深さ方向に焦点位置が移動することによりその間の共焦点画像を平均した画像（光の強度を平均したもの）を取り込むことができ、試料の深さ方向の画像情報がもれなく取得される。

また、走査波形（ｆ４）のように、対物レンズ駆動の上りを直線的に走査して光刺激を行い、対物レンズ駆動の下りは、ステップ波形で走査するようしてもよい。このような、異なる波形を組み合わせることにより、光刺激や画像計測に適した走査波形により試料の観測を行うことができる。

ここで、このような３次元共焦点顕微鏡システムに適用される共焦点顕微鏡の構成を図を用いて説明する。以下の実施例では顕微鏡に共焦点スキャナを搭載した構成の共焦点顕微鏡を示しているが共焦点顕微鏡としては図１に示したものと同等である。
図４は、本発明に適用される共焦点顕微鏡の一実施例を示した構成図である。前出の図と同様の構成要素には同様の符号を付けてその部分の説明は省略する。
図４において、顕微鏡４０の第１のポート４１には共焦点スキャナ１１０が取り付けられ、波長λ１のレーザ光１１１（第１のレーザ光）を試料１４０に照射する共焦点顕微鏡を構成する。顕微鏡４０内に入ったレーザ光１１１は、ダイクロイックミラー４３を透過して対物レンズ４４により、ステージ４６上の細胞などの試料１４０に集光される。このレーザ光１１１の照射により試料１４０が蛍光する。試料１４０から出た蛍光信号は、再び対物レンズ４４を通り、ダイクロイックミラー４３を透過し共焦点スキャナ１１０を介して従来例と同様にイメージセンサ１３１に結像される。

顕微鏡４０の第２のポート４２にはレーザ光出力手段５０が取り付けられる。このレーザ光出力手段５０は、レーザ光源５１とコリメータレンズ５２を備えている。レーザ光源５１はλ２の波長の第２のレーザ光５３を発光し、コリメータレンズ５２は、この第２のレーザ光５３を平行光にして第２のポート４２から顕微鏡４０内に入れる。顕微鏡４０に入った第２のレーザ光５３は、ダイクロイックミラー４３で反射して、対物レンズ４４により、試料１４０上に波長λ２の光刺激用レーザ光の光ビームスポットを結像させる。
なお、この場合のλ１とλ２との関係は、λ２＜λ１である。

ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に光刺激用の第２のレーザ光を照射する機能を備えたことによって、フォトアクチベーションのアプリケーションやＦＲＡＰなどが可能となる。また、蛍光観察、すなわち画像計測はニポウディスク式共焦点スキャナで行うことで高速性（例えば１０００フレーム／秒のスキャンスピード）が実現できるため、光刺激や蛍光褪色に係る高速反応をリアルタイムで観察することができる。

ここで、図４に示した構成において、第２のレーザ光５３が例えば紫外光のような可視光でない場合、第２のレーザの照射ポイントが目視できないことになる。この問題を解決するため、図５に示すように、第２のレーザ光のビームスポットに可視光のレーザスポットを重ねるようにする。

図５は、本発明に適用される共焦点顕微鏡の第２の実施例を示した構成図である。前出の図４と同様の構成要素には同様の符号を付けてその部分の説明は省略する。
図５において、顕微鏡４０の第１のポート４１には共焦点スキャナ１１０が取り付けられ、波長λ１のレーザ光１１１を照射する共焦点顕微鏡を構成する。顕微鏡４０内に入ったレーザ光１１１は、ダイクロイックミラー４３を透過して対物レンズ４４により、ステージ４６上の試料１４０に集光される。このレーザ光１１１の照射により試料１４０が蛍光する。試料１４０から出た蛍光信号は、再び対物レンズ４４を通り、ダイクロイックミラー４３を透過し共焦点スキャナ１１０を介して従来例と同様にイメージセンサ１３１に結像される。

顕微鏡４０の第２のポート４２にはレーザ光出力手段６０が取り付けられる。このレーザ光出力手段６０は、レーザ光源６１，６５、コリメータレンズ６２，６６、ダイクロイックミラー６４、全反射ミラー６７、可変絞り手段６８を備えている。

レーザ光源６１は実線で示した波長λ２の第２のレーザ光６３を発光する。コリメータレンズ６２は、この第２のレーザ光６３を平行光にする。ダイクロイックミラー６４は、その分光特性により、平行光となった第２のレーザ光６３を透過する。可変絞り手段６８は、ダイクロイックミラー６４を透過した第２のレーザ光６３のビーム径を可変させる。可変絞り手段６８を通った第２のレーザ光６３は、顕微鏡４０の第２のポート４２から顕微鏡４０内に入る。顕微鏡４０に入った第２のレーザ光６３は、ダイクロイックミラー４３で反射して、対物レンズ４４により、試料１４０上に波長λ２の光刺激用レーザ光の光ビームスポットを結像させる。

また、レーザ光源６５は破線で示した波長λ３の第３のレーザ光６９を発光する。コリメータレンズ６６は、この第３のレーザ光６９を平行光にする。全反射ミラー６７は、平行光になった第３のレーザ光６９を反射してダイクロイックミラー６４に当てる。ダイクロイックミラー６４は、その分光特性により、第３のレーザ光６９を反射し、可変絞り手段６８を介して第２のポート４２から顕微鏡４０内に入れる。顕微鏡４０に入った第３のレーザ光６９は、ダイクロイックミラー４３で反射して、対物レンズ４４により、試料１４０上に波長λ３の光ビームスポットを結像させる。

これにより第２の蛍光信号４５が発生する。この第２の蛍光信号４５は、再び対物レンズ４４を通り、ダイクロイックミラー４３を透過し共焦点スキャナ１１０を介し、レーザ光１１１による蛍光信号と同様にイメージセンサ１３１に結像される。なお、λ１，λ２，λ３の関係はλ２＜λ１＜λ３となっている。また、第２の蛍光信号４５は、可視光であってλ３よりも長波長である。

λ２とλ３の光を合波して試料１４０に照射することにより、第２のレーザ光（λ２）が紫外光であっても第３のレーザ光（λ３）により励起された蛍光波長が可視光であれば、光刺激を行うポイントが目視可能となる。
また、可変絞り手段６８を設けて、第２，第３のレーザ光の照射ＮＡ（開口数）を変えることにより、光刺激のスポット径を可変にし、光刺激する範囲の大きさを変えられるようにしている。

図６は本発明に適用される共焦点顕微鏡の第３の実施例を示した構成図である。前出の図と同様の構成要素には同様の符号を付けてその部分の説明は省略する。
図６において、共焦点スキャナ１１０および顕微鏡１の構成は、前出の図５で示したものと同様である。
顕微鏡４０の第２のポート４２にはレーザ光出力手段７０が取り付けられる。このレーザ光出力手段７０は、レーザ光源６１，６５、コリメータレンズ６２，６６、ダイクロイックミラー６４、全反射ミラー６７、走査手段７１を備えている。

レーザ光源６１，６５、コリメータレンズ６２，６６、ダイクロイックミラー６４、全反射ミラー６７の構成及び動作は図５で示した第２の実施例と同様であり、この構成に走査手段７１を付加した。

走査手段７１は、ミラースキャン型の走査系を構成するものである。図示しないが、例えばガルバノミラーを用いて２次元でレーザ光を走査する。ガルバノミラーは、ＤＣモータにより縦・横方向に回転できる機構になっている。制御ユニットからの信号によりＤＣモータを制御してガルバノミラーを回転させて、２次元の任意の位置にレーザスポットを照射することができる。

走査手段７１から出力された第２，第３のレーザ光６３，６９が顕微鏡４０に入り、ダイクロイックミラー４３で反射され、対物レンズ４４で集光されて試料１４０にスポット光を照射する。走査手段７１の第２，第３のレーザ光６３，６９の２次元スキャンにより、試料１４０の形状に合わせた光刺激を可能にする。また、第２の実施例と同様に、光刺激を与える第２のレーザ光６３が紫外光であっても、第３のレーザ光６９により、刺激を与えている部分を目視することができる。

光刺激についての観察が、試料に対して２次元の平面で行われる場合には、３次元構造を持つ試料の深さ方向に対しては、光刺激が届かない、あるいは不十分であることが考えられる。それにより、光刺激後の試料観察の結果に正確さを欠くことになる。
また、光刺激を行い試料である細胞の一部をマーキングした場合に、このマーキングが、平面方向だけでなく深さ方向に広がる様子を正確に観察することができない。
このような問題を解決するために、上述したように光刺激機能を備えたニポウディスク方式の共焦点顕微鏡を用いて、３次元の画像計測を行うことにより、光刺激後の試料の観察を３次元的に正確に行えるようにすることができる。

なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。

本発明に係る３次元共焦点顕微鏡システムの一実施例を示す構成図である。 本発明に係る３次元共焦点顕微鏡システムで取り扱われる各信号のタイムチャートである。 本発明に係る３次元共焦点顕微鏡システムで取り扱われる各信号の他のタイムチャートである。 本発明に適用される共焦点顕微鏡の一実施例を示す構成図である。 本発明に適用される共焦点顕微鏡の第２の実施例を示す構成図である。 本発明に適用される共焦点顕微鏡の第３の実施例を示す構成図である。 従来の共焦点顕微鏡システムの一例を示す構成図である。 図７の共焦点顕微鏡システムが取り扱う各種信号のタイムチャートである。 従来の共焦点顕微鏡の一例を示す構成図である。

符号の説明

１ａ カメラ
２ａ 共焦点スキャナ
３ａ 蛍光顕微鏡
４ａ アクチュエータ
５ａ 対物レンズ
６ａ 画像処理部
７ａ 波形発生器
１０ 同期信号制御器
１１ 波形計算部
１２ アクチュエータドライバ
２０ 試料
２１ 支持台
２２ 光路
２３ 光路
２４ 第１のポート
２５ 第２のポート
２６ ステージ
２７ ステージ支持部
２８ ＰＣ
３０ 画像計測レーザ光源
３１ ファイバ
３２ 光刺激レーザ光源
３３ ファイバ
４０ 顕微鏡
４１ 第１のポート
４２ 第２のポート
４３ ダイクロイックミラー
４４ 対物レンズ
４６ ステージ
５０ レーザ光出力手段
５１ レーザ光源
５２ コリメータレンズ
５３ 第２のレーザ光
６０ レーザ光出力手段
６１ レーザ光源
６２ コリメータレンズ
６３ 第２のレーザ光
６４ ダイクロイックミラー
６５ レーザ光源
６６ コリメータレンズ
６７ 全反射ミラー
６８ 可変絞り手段
６９ 第３のレーザ光
７０ レーザ光出力手段
７１ 走査手段
１１０ 共焦点スキャナ

Claims (6)

1. 顕微鏡を介して試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、
   前記共焦点画像の画像データを出力するビデオカメラと、
   前記顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータと、
   このアクチュエータを介して前記対物レンズを光軸方向に走査するための走査波形信号を発生する制御部と、
   前記ビデオカメラで取得した画像データに基づき前記試料の３次元画像を生成する画像処理部と、
   を備えた３次元共焦点顕微鏡システムであって、
   前記顕微鏡に接続され、前記試料に刺激を与えるレーザ光を出力するレーザ光出力手段を有し、
   前記対物レンズを走査して前記試料に対して光軸方向に刺激を与え、
   前記対物レンズの一方向の走査で刺激を与え、これに続いて他方向の走査で前記共焦点画像を取得することを特徴とする３次元共焦点顕微鏡システム。
2. 前記試料に刺激を与えるレーザ光のスポット径を調整する可変絞り手段を備えたことを特徴とする請求項１に記載の３次元共焦点顕微鏡システム。
3. 前記試料に刺激を与えるレーザ光を２次元に走査させる走査手段を有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の３次元共焦点顕微鏡システム。
4. 前記レーザ光出力手段は、前記試料に刺激を与えるレーザ光と、このレーザ光が前記試料へ照射される位置を示すためのレーザ光とを合波して出力することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の３次元共焦点顕微鏡システム。
5. 前記試料を刺激する際の走査波形と前記試料を観察する際の走査波形をそれぞれ任意に設定することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の３次元共焦点顕微鏡システム。
6. 前記３次元共焦点顕微鏡システムは、フォトアクチベーションまたは蛍光褪色に用いられることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載の３次元共焦点顕微鏡システム。

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