JP6797574B2

JP6797574B2 - 走査型顕微鏡

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Description

本発明は、走査型顕微鏡に関するものである。

従来、複数のピンホールを有するピンホールアレイディスクを備え、ピンホールディスクを中心軸回りに回転させて、レーザ光を通過させるピンホールを次々に替えることにより、標本上でのレーザ光のスポット位置を移動させてレーザ光を走査するディスクスキャン型の走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。ディスクスキャン型の走査型顕微鏡は、複数のピンホールにより多点（マルチポイント）でレーザ光を走査することで、共焦点画像を高速に取得することができる。

特開２００６−７８７７２号公報

しかしながら、ディスクスキャン型の走査型顕微鏡により、標本を光刺激してその反応を観察する場合において、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ−Ｃｏｕｐｌｅｄｄｅｖｉｃｅ）などの撮像部に強度が高い刺激光が入射してしまうと、画像上に帯状の線のようないわゆるスミアが発生したりしてしまい、光刺激後の適切な画像を取得することができないという問題がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、刺激光の影響が画像に重畳するのを防止し、光刺激後の標本の反応を精度よく観察することができる走査型顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本に照射する照明光の光束を制限する複数の微小開口が中心軸周りにアレイ状に配置された開口ディスクと、該開口ディスクを前記中心軸回りに回転させる回転駆動部と、該回転駆動部により前記中心軸回りに回転させられている前記開口ディスクの前記微小開口を通過した前記照明光を前記標本に照射する一方、該標本において発生する観察光を集光して前記微小開口に入射させる対物レンズと、該対物レンズにより集光されて前記微小開口を通過した前記観察光を繰り返し撮影し、前記標本の画像情報を取得する画像取得部と、前記標本に刺激光を照射する刺激光照射部とを備え、前記画像取得部が、１回の露光期間と、取得した画像情報を読み出す読み出し期間とを交互に繰り返し、前記刺激光照射部が、前記画像取得部の露光期間中は前記標本を刺激する刺激光の強度を低減し、前記露光期間と前記露光期間との間の読み出し期間は前記刺激光の強度を増大する調光部を備える走査型顕微鏡を提供する。

本発明によれば、回転駆動部により開口ディスクが中心軸回りに回転させられて、照明光が通過する微小開口がその配列パターンに従って次々に替わることにより、標本上での照明光のスポット位置が移動して、標本上で照明光が走査される。そして、照明光が走査されることにより標本において発生して対物レンズを介して微小開口を通過した観察光が画像取得部により繰り返し撮影されることで、標本の画像が取得される。また、刺激光照射部により、標本に刺激光を照射することで、標本に光刺激が与えられる。したがって、刺激光照射部により光刺激を与えた標本の画像を画像取得部により取得することで、光刺激後の標本の反応を観察することができる。

この場合において、刺激光照射部の調光部により、画像取得部の露光期間に応じて刺激光の強度を調整し、露光期間中は刺激光の強度を低減することで、画像取得部より画像が取得されているときに強度が高い刺激光が画像取得部に入射するのを防ぐことができる。これにより、高強度の刺激光の影響が画像情報に重畳するのを防止し、光刺激後の標本の反応を精度よく観察することができる。

上記発明においては、前記調光部が、露光期間中は、前記刺激光の照射を停止しまたは前記刺激光を所定の閾値以下の強度にすることとしてもよい。
このように構成することで、刺激光の照射を停止した場合には、画像取得部に刺激光が入射するのを回避し、刺激光を所定の閾値以下の強度にした場合には、仮に画像取得部に刺激光が入射したとしても、画像情報への影響を抑制することができる。したがって、刺激光の影響が画像情報に重畳するのをより確実に防ぐことができる。

上記発明においては、前記画像取得部が、前記微小開口の配列パターンおよび前記回転駆動部の回転数に基づいて算出されるフレームレートの１フレーム分を走査するのに掛かる走査時間以上の長さの前記露光期間を有することとしてもよい。
このように構成することで、画像取得部により、前記フレームレート、すなわち微小開口の配列パターンおよび回転駆動部の回転数に基づいて算出されるフレームレートの１フレーム分以上の標本からの観察光の撮影を繰り返して、照明光の走査範囲の全体に亘る標本の画像を取得することができる。

上記発明においては、前記露光期間が、前記走査時間の略整数倍に設定されていることとしてもよい。
このように構成することで、画像取得部により、前記フレームレートの複数のフレーム分ごとに標本からの観察光の撮影を繰り返して、照明光の走査範囲の全体に亘る標本の画像を取得することができる。

上記発明においては、前記照明光の光路と前記刺激光の光路とを合成する光路合成部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、光路合成部により、照明光を照射する標本の観察範囲に刺激光を効率的に照射することができる。これにより、光刺激による標本の直接の反応を観察することができる。

上記発明においては、前記刺激光が、前記回転駆動部により前記中心軸回りに回転している前記開口ディスクの前記微小開口を通過して前記標本に照射され、前記調光部が、前記微小開口の配列パターンおよび前記回転駆動部の回転数に基づいて算出されるフレームレートの１フレーム分を走査するのに掛かる走査時間以上の長さの刺激期間に、前記刺激光の強度を増大することとしてもよい。

このように構成することで、照明光と刺激光との光源を共通にして、顕微鏡を小型および簡易な構成にすることができる。この場合において、開口ディスクおよび調光部により前記フレームレートの１フレーム分以上の範囲ごとに強度が高い刺激光が照射されるので、観察範囲全体を光刺激した場合の標本の反応を観察することができる。

上記発明においては、前記刺激期間が、前記走査時間の略整数倍に設定されていることとしてもよい。
このように構成することで、調光部により、前記フレームレートの複数のフレーム分の範囲ごとに光刺激を与えていくことができる。

上記発明においては、前記調光部が、前記露光期間と前記露光期間との間の期間において前記刺激光の強度を増大するタイミングを調整可能であってもよい。
このように構成することで、刺激光の強度の変更を開始してから変更が完了するまでに掛かる遅れ時間を考慮し、画像情報への刺激光の影響を回避しつつ、刺激光を効率的に増大して標本に照射することができる。

本発明によれば、刺激光の影響が画像に重畳するのを防止し、光刺激後の標本の反応を精度よく観察することができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る走査型顕微鏡の概略構成図である。図１のピンホールアレイディスクにおける複数のピンホールの配列の一例を示す平面図である。図２のピンホールアレイディスクとカメラの露光時間および読み出し時期間との関係を示す平面図である。カメラの露光時間と光刺激のタイミング信号との関係の一例を示すタイミングチャートである。図４のタイミングチャートの読み出し時間の拡大図である。本発明の第１実施形態の変形例に係る走査型顕微鏡の概略構成図である。本発明の第２実施形態に係る走査型顕微鏡の概略構成図である。図７のピンホールアレイディスクとカメラの露光時間および読み出し時期間との関係を示す平面図である。カメラの露光時間、光刺激のタイミング信号、照明光のＯＮ／ＯＦＦ、刺激光のＯＮ／ＯＦＦの関係の一例を示すタイミングチャートである。図９のタイミングチャートの読み出し時間の拡大図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る走査型顕微鏡について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡１は、図１に示すように、標本Ｓを載置するステージ３と、標本Ｓの画像を取得する観察光学系５と、標本Ｓに刺激光を照射する刺激光学系（刺激光照射部）７と、これら観察光学系５および刺激光学系７を制御する制御装置９とを備えている。

観察光学系５は、照明光としてのレーザ光を発生するイメージング用レーザ光源（以下、イメージング用光源という。）１１と、イメージング用光源１１から発せられた照明光を導光する光ファイバ１３と、光ファイバ１３により導光されてきた照明光を平行光に変換するコリメートレンズ１５と、コリメートレンズ１５により平行光に変換された照明光を走査させる共焦点スキャナ１７と、共焦点スキャナ１７により走査された照明光を標本Ｓに照射する一方、標本Ｓから戻る蛍光（観察光）を集光する対物レンズ１９とを備えている。

また、観察光学系５には、対物レンズ１９により集光されて照明光の光路を戻る蛍光を照明光の光路から分岐させるダイクロイックミラー２１と、ダイクロイックミラー２１により分岐された蛍光を結像させる結像レンズ２３と、結像レンズ２３により結像された像を撮影するＣＣＤ等のカメラ（画像取得部）２５とが備えられている。

共焦点スキャナ１７は、ディスク方式のスキャナである。この共焦点スキャナ１７は、複数のピンホール（微小開口）２７が回転軸（中心軸）Ｃ周りにアレイ状に配置されたピンホールアレイディスク（開口ディスク）２９と、複数のマイクロレンズ３１が回転軸Ｃ周りにアレイ状に配置されたマイクロレンズアレイディスク３３と、これらピンホールアレイディスク２９およびマイクロレンズアレイディスク３３を回転軸Ｃ回りに回転させる回転駆動部３６とを備えている。

回転駆動部３６は、後述するディスク制御部４５との通信を行うインターフェース回路３６ａと、ＤＣサーボモータ３６ｂとで構成されている。なお、ＤＣサーボモータ３６ｂには、回転速度信号を出力できる不図示のエンコーダが内蔵されている。本実施形態ではＤＣサーボモータ３６ｂを使用しているが、これに限らず、ＡＣサーボモータなど、速度制御可能なモータであればよい。

マイクロレンズアレイディスク３３およびピンホールアレイディスク２９は、互いに回転軸Ｃに沿う方向に間隔を空けて一体的に構成され、イメージング用光源１１側にマイクロレンズアレイディスク３３が配され、標本Ｓ側にピンホールアレイディスク２９が配されている。また、マイクロレンズアレイディスク３３およびピンホールアレイディスク２９は、回転駆動部３６により共通の回転軸Ｃ回りに一体的に回転させられるようになっている。

また、共焦点スキャナ１７は、ピンホールアレイディスク２９の各ピンホール２７とマイクロレンズアレイディスク３３の各マイクロレンズ３１とが同一のディスクパターン（配列パターン）で形成されており、各ピンホール２７と各マイクロレンズ３１とが対応付けられて配されている。したがって、各マイクロレンズ３１に入射した照明光は、それぞれのマイクロレンズ３１に対応するピンホール２７に集光されるようになっている。

ピンホールアレイディスク２９は、例えば、図２に示すように、回転軸Ｃを中心に周方向に３０°の扇状の領域ごとに、ピンホールアレイディスク２９の中心部から外縁部に向かって複数のピンホール２７が周方向に徐々に位置をずらしながら配置されていれる。マイクロレンズアレイディスク３３の各マイクロレンズ３１も同様である。これにより、ピンホールアレイディスク２９およびマイクロレンズアレイディスク３３が回転軸Ｃ回りに３０°回転するごとに、標本Ｓの面全体、すなわち、カメラ２５の１フレーム分を走査することができるようになっている。

また、各ピンホール２７は、対応するマイクロレンズ３１により集光された照明光を標本Ｓに向けて通過させる一方、対物レンズ１９により集光された蛍光の内、標本Ｓにおける対物レンズ１９の焦点位置において発生した蛍光のみを照明光とは逆方向に通過させるようになっている。

ダイクロイックミラー２１は、マイクロレンズアレイディスク３３とピンホールアレイディスク２９との間の照明光の光軸上に配されている。このダイクロイックミラー２１は、各マイクロレンズ３１により対応するピンホール２７に集光される照明光を透過させる一方、ピンホール２７を通過した標本Ｓからの蛍光を結像レンズ２３に向けて反射するようになっている。

刺激光学系７は、刺激光としてのレーザ光を発生する刺激用ＬＥＤ光源（以下、刺激用光源という。）３５と、刺激用光源３５から発せられた刺激光を導光して、標本Ｓに照射する光ファイバ３７とを備えている。刺激用光源３５は、電流による直接変調により調光することができるようになっている。

制御装置９は、共焦点スキャナ１７およびカメラ２５を制御する制御部４１と、刺激用光源３５から刺激光を発生するタイミングを生成する刺激タイミング生成部（調光部）４３とを備えている。この制御装置９には、ＰＣ（ＰｅｒｓｏｎａｌＣｏｍｐｕｔｅｒ）６１が接続されている。ＰＣ６１には、ユーザがカメラ２５の露光時間等を入力するマウス６３やキーボード６５等の入力部６７や、モニタ６９が接続されている。

制御部４１は、回転駆動部３６の回転数を制御するディスク制御部４５と、カメラ２５の露光時間を制御するカメラ制御部４７とを備えている。また、制御部４１は、刺激タイミング生成部４３との通信を行うインターフェース回路(不図示)を備えている。

ディスク制御部４５には、回転駆動部３６に駆動信号を送出するための不図示のドライブ回路や回転駆動部３６から送られてくる回転速度信号をもとに回転数を制御する不図示のフィードバック回路、ＰＣ６１とのデータの送受信を行う不図示のＰＣインターフェース回路が備わっており、回転駆動部３６を１００００ｒｐｍの回転数で回転させるようになっている。

カメラ制御部４７には、カメラ２５より画像信号を受け取ったりカメラ２５に露光信号を送出したりするためのカメラインターフェース回路(不図示)や、各種信号処理を行うプロセッサ(不図示)、ＰＣ６１に画像情報を送出するためのＰＣインターフェース回路(不図示)が備わっている。

ここで、ピンホールアレイディスク２９のディスクパターン（１ｆｒａｍｅ＝３０°）と回転駆動部３６の回転数（１００００ｒｐｍ）とに基づいて、カメラ２５の最短の露光時間Ｔｍｉｎを算出することができる。共焦点スキャナ１７が回転軸Ｃ回りに１回転することにより取得可能なフレーム数は、３６０°／３０°＝１２枚であり、最速のフレームレートは、１００００ｒｐｍ／６０ｓｅｃ×１２枚＝２０００［ｆｐｓ］である。よって、フレームレートの１フレーム分を走査するのに掛かる最短の露光時間Ｔｍｉｎは、１／２０００［ｆｐｓ］＝０．５［ｍｓ］となる。

制御部４１においては、例えば、ユーザが設定する露光時間Ｔが最短の露光時間Ｔｍｉｎ以上の値に制限され、最短の露光時間Ｔｍｉｎの略整数倍（Ｔｍｉｎ×Ｎ）が露光時間Ｔの推奨値として設定されている。最速の場合は、例えば、露光時間Ｔ＝最短の露光時間Ｔｍｉｎ×１＝０．５［ｍｓ］が設定される。

カメラ制御部４７は、ユーザが設定したカメラ２５の露光時間Ｔと、カメラ２５により取得された画像情報がＰＣ６１に転送される読み出し時間Ｔｒとから、図３および図４に示すように、露光時間Ｔ（Ｔ１，Ｔ２，Ｔ３・・・）の期間（露光期間）と読み出し時間Ｔｒ（Ｔｒ１，Ｔｒ２・・・）の期間とを交互に繰り返す露光信号を生成するようになっている。読み出し時間Ｔｒは、カメラ２５に規定の最速値を最小値として調整可能となっている。また、カメラ制御部４７は、生成した露光信号に基づいてカメラ２５を駆動するようになっている。

刺激タイミング生成部４３は、カメラ制御部４７により生成される露光信号に基づいて、カメラ２５の露光時間Ｔの期間中は標本Ｓを刺激する刺激光の強度を低減し、露光時間Ｔと露光時間Ｔとの間の期間は刺激光の強度を増大するように、刺激用光源３５を調光するようになっている。

具体的には、図４に示すように、刺激タイミング生成部４３は、露光時間Ｔと露光時間Ｔとの間の期間ごと、すなわち、読み出し時間Ｔｒの期間ごとに刺激用光源３５から刺激光を発生させ（ＯＮ）、露光時間Ｔの期間ごと、すなわち、読み出し時間Ｔｒと読み出し時間Ｔｒとの間の期間ごとに刺激用光源３５からの刺激光の発生を停止する（ＯＦＦ）光刺激のタイミング信号を生成して、刺激用光源３５のＯＮ／ＯＦＦを切り替えるようになっている。なお、光刺激のタイミング信号は、読み出し時間Ｔｒの期間を認識可能な信号であればよく、例えば、カメラ２５からの信号やカメラ２５へのトリガ信号を基に生成することとしてもよい。

また、刺激タイミング生成部４３は、読み出し時間Ｔｒの期間において、刺激用光源３５から刺激光を発生させるタイミングを調整することができるようになっている。例えば、図５に示すように、読み出し時間Ｔｒが開始してから刺激用光源３５から刺激光を発生させる直前までの期間Ｔｗ１と、刺激用光源３５から刺激光を実際に発生させている期間Ｔｗ２と、刺激用光源３５からの刺激光の発生を停止してから読み出し時間Ｔｒが終了するまでの期間Ｔｗ３とをユーザが設定することができるようになっている。

これらの期間Ｔｗ１，Ｔｗ２，Ｔｗ３は、刺激用光源３５の立上り／立下りに掛かる遅れ時間を考慮し、読み出し時間Ｔｒの期間内のみ刺激用光源３５から刺激光が発せられるように設定することが好ましい。このようにすることで、画像情報への刺激光の影響を回避しつつ、刺激用光源３５から強度が高い刺激光を効率的に標本Ｓに照射することができる。

このように構成された走査型顕微鏡１の作用について説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡１により標本Ｓを光刺激して、その反応を観察する場合は、まず、ユーザが入力部６７により、カメラ２５の露光時間Ｔと読み出し時間Ｔｒの期間内の刺激光の発生に関する期間Ｔｗ１，Ｔｗ２，Ｔｗ３とを設定する。例えば、露光時間Ｔ＝０．５ｍｓとする。次いで、観察光学系５において、回転駆動部３６により共焦点スキャナ１７を回転軸Ｃ回りに回転させ、イメージング用光源１１から照明光を発生させる。

イメージング用光源１１から発せられた照明光は、光ファイバ１３により導光されてコリメートレンズ１５により平行光とされた後、共焦点スキャナ１７に入射される。共焦点スキャナ１７に入射された照明光は、照明光の光路に配されたマイクロレンズ３１により集光されてダイクロイックミラー２１を透過し、同じく照明光の光路に配されたピンホール２７を通過して、対物レンズ１９により標本Ｓに照射される。

共焦点スキャナ１７の回転により照明光が通過するマイクロレンズ３１およびピンホール２７が次々に替わることで、これらマイクロレンズ３１およびピンホール２７のパターンに従い、標本Ｓ上での照明光のスポット位置が移動して、標本Ｓ上で照明光が走査される。

照明光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生する蛍光は、対物レンズ１９により集光されて照明光の光路を戻り、ピンホール２７を通過してダイクロイックミラー２１により結像レンズ２３に向けて反射される。そして、蛍光は、結像レンズ２３により結像されて、カメラ２５により撮影される。これにより、カメラ２５において、撮影した蛍光に基づく標本Ｓの画像情報が取得される。

次に、本実施形態に係る走査型顕微鏡１により標本Ｓに光刺激を与える場合は、刺激光学系７において、刺激用光源３５から照明光よりも強度が高い刺激光を発生させ、光ファイバ３７を介して標本Ｓに刺激光を照射する。これにより、標本Ｓが光刺激される。

このようにして、観察光学系５により標本Ｓの画像情報を取得して、モニタ６９等でユーザが標本Ｓを見ながら、刺激光学系７により標本Ｓに光刺激を与えることで、光刺激後の標本Ｓの反応を観察することができる。

この場合において、カメラ制御部４７により、ユーザが設定した露光時間Ｔとカメラ２５の読み出し時間Ｔｒとから生成される露光信号に基づいてカメラ２５が制御され、図３および図４に示すように、露光時間（Ｔ１，Ｔ２，Ｔ３・・・）の期間と読み出し時間（Ｔｒ１，Ｔｒ２・・・）の期間とが交互に繰り返される。そして、カメラ２５により、露光時間Ｔの期間に標本Ｓからの蛍光が撮影され、読み出し時間Ｔｒの期間にその画像情報がＰＣ６１に転送される。

また、刺激タイミング生成部４３により、カメラ制御部４７の露光信号から生成される光刺激のタイミング信号に基づいて刺激用光源３５が調光され、カメラ２５の露光時間Ｔの期間は刺激用光源３５からの刺激光の発生が停止され（ＯＦＦ）、カメラ２５の読み出し時間Ｔｒの期間に刺激用光源３５から刺激光が発せられる（ＯＮ）。

これにより、カメラ２５の露光時間中、すなわちカメラ２５によって画像情報が取得されているときに、強度が高い刺激光がカメラ２５に入射するのを防ぐことができる。したがって、本実施形態に係る走査型顕微鏡１によれば、高強度の刺激光の影響が画像情報に重畳するのを防止し、光刺激後の標本Ｓの反応を精度よく観察することができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
例えば、図６に示すように、走査型顕微鏡１が、光ファイバ３７に代えて、照明光の光路と刺激光の光路とを合成するダイクロイックミラー（光路合成部）４９を備えることとしてもよい。

この場合、ダイクロイックミラー４９は、共焦点スキャナ１７と対物レンズ１９との間の照明光および蛍光の光路上に配置することとすればよい。また、ダイクロイックミラー４９は、イメージング用光源１１からの照明光および標本Ｓからの蛍光を透過し、刺激用光源３５から発せられる刺激光を対物レンズ１９に向けて反射することとすればよい。

このようにすることで、ダイクロイックミラー４９により、照明光を照射する標本Ｓの観察範囲に刺激光を効率的に照射することができる。これにより、光刺激による標本Ｓの直接の反応を観察することができる。
本変形例においては、刺激用光源３５から発せられた刺激光を標本Ｓ上で走査させるガルバノスキャナ等の走査部を設けることとしてもよい。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る走査型顕微鏡について説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡５１は、イメージング用光源１１、光ファイバ３７および刺激用光源３５に代えて、図７に示すように、波長が異なる照明光と刺激光とを選択的に発生可能なレーザ光源５３を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る走査型顕微鏡１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

レーザ光源５３は、異なる波長のレーザ光を択一的に発生することができるようになっている。レーザ光源５３から発せられた照明光および刺激光は、第１実施形態のイメージング用光源１１から発せられる照明光と同様に、光ファイバ１３により導光されてコリメートレンズ１５により平行光にされた後、共焦点スキャナ１７および対物レンズ１９を介して標本Ｓに照射されるようになっている。また、レーザ光源５３は、刺激タイミング生成部４３により、光刺激のタイミング信号に基づいて調光されるようになっている。

カメラ制御部４７は、カメラ２５の読み出し時間Ｔｒ≧最短の露光時間Ｔｍｉｎとして、入力部６７によりユーザが設定するカメラ２５の露光時間Ｔと、カメラ２５の読み出し時間Ｔｒとから、図８および図９に示すように、露光時間Ｔの期間と読み出し時間Ｔｒの期間とを交互に繰り返す露光信号を生成するようになっている。読み出し時間Ｔｒは、最短の露光時間Ｔｍｉｎ以上として、最短の露光時間Ｔｍｉｎの略整数倍が推奨値として設定され、ユーザが調整することができるようになっている。

刺激タイミング生成部４３は、カメラ制御部４７により生成される露光信号に基づいて、例えば、図９に示すように、ピンホールアレイディスク２９のディスクパターンと回転駆動部３６の回転数とに基づいて算出されるフレームレートの１フレーム分を走査するのに掛かる走査時間以上の長さの読み出し時間Ｔｒの期間（刺激期間）に、レーザ光源５３から照明光よりも強度が高い刺激光を発生させる光刺激のタイミング信号を生成するようになっている。

また、刺激タイミング生成部４３は、読み出し時間Ｔｒの期間において、図１０に示すように、読み出し時間Ｔｒが開始してから刺激用光源３５から刺激光を発生させる直前までの期間Ｔｗ１と、刺激用光源３５から刺激光を実際に発生させている期間Ｔｗ２と、刺激用光源３５からの刺激光の発生を停止してから読み出し時間Ｔｒが終了するまでの期間Ｔｗ３をユーザが設定することができるようになっている。

このように構成された走査型顕微鏡５１の作用について説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡５１により標本Ｓを光刺激して、その反応を観察する場合は、まず、ユーザが入力部６７により、カメラ２５の露光時間Ｔと読み出し時間Ｔｒの期間内の刺激光の発生に関する期間Ｔｗ１，Ｔｗ２，Ｔｗ３とを設定した後、回転駆動部３６により共焦点スキャナ１７を回転軸Ｃ回りに回転させて、レーザ光源５３から照明光を発生させる。例えば、露光時間Ｔ＝０．５ｍｓ、読み出し時間Ｔｒ＝０．５ｍｓとする。以下、標本Ｓの画像情報の取得については、第１実施形態と同様であるので説明を省略する。

次に、標本Ｓに光刺激を与える場合は、共焦点スキャナ１７を回転軸Ｃ回りに回転させたままの状態で、レーザ光源５３から照明光に代えて強度が高い刺激光を発生させる。レーザ光源５３から発せられた刺激光は、照明光と同様に、光ファイバ１３により導光されてコリメートレンズ１５により平行光に変換された後、共焦点スキャナ１７を介して対物レンズ１９により標本Ｓに照射される。これにより、共焦点スキャナ１７のディスクパターンに応じて、標本Ｓ上で照明光と同様に刺激光が走査される。

このようにして、共通のレーザ光源５３を用いて、観察光学系５により標本Ｓの画像情報を取得し、モニタ６９等でユーザが標本Ｓを見ながら、刺激光学系７により標本Ｓに光刺激を与えることで、光刺激後の標本Ｓの反応を観察することができる。

この場合において、カメラ制御部４７により、ユーザが設定した露光時間Ｔとカメラ２５の読み出し時間Ｔｒとから生成される露光信号に基づいてカメラ２５が制御され、図８および図９に示すように、露光時間（Ｔ１，Ｔ２・・・）の期間と読み出し時間（Ｔｒ１，Ｔｒ２・・・）の期間とが交互に繰り返される。そして、カメラ２５により、露光時間Ｔの期間に標本Ｓからの蛍光が撮影され、読み出し時間Ｔｒの期間にその画像情報がＰＣ６１に転送される。

また、刺激タイミング生成部４３により、カメラ制御部４７の露光信号から生成される光刺激のタイミング信号に基づいてレーザ光源５３が調光され、カメラ２５の露光時間Ｔの期間中はレーザ光源５３からの刺激光の発生が停止され（ＯＦＦ）、カメラ２５の読み出し時間Ｔｒの期間にレーザ光源５３から刺激光が発せられる（ＯＮ）。これにより、カメラ２５よって画像情報が取得されているときに強度が高い刺激光がカメラ２５に入射するのを防ぐことができる。

以上説明したように、本実施形態に係る走査型顕微鏡５１によれば、照明光と刺激光とを共通のレーザ光源５３から発生させることで、走査型顕微鏡５１を小型および簡易な構成にすることができる。また、共焦点スキャナ１７および刺激タイミング生成部４３により、ピンホールアレイディスク２９のディスクパターンと回転駆動部３６の回転数とに基づいて算出されるフレームレートの１フレーム分の範囲ごとに強度が高い刺激光が照射されるので、観察範囲全体を光刺激した場合の標本Ｓの反応を観察することができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、上記各実施形態においては、刺激タイミング生成部４３が、露光時間Ｔの期間は刺激光の発生を停止することとしたが、これに代えて、例えば、露光時間Ｔの期間は刺激光を所定の閾値以下の強度に低減することとしてもよい。例えば、露光時間Ｔと露光時間Ｔの間の期間は、刺激用光源３５およびレーザ光源５３から照明光よりも強度が高い通常の刺激光を発生させ、露光時間Ｔの期間は、刺激用光源３５およびレーザ光源５３から所定の閾値以下の強度の刺激光を発生させることとすればよい。

所定の閾値は、例えば、刺激光が標本Ｓに照射されても標本Ｓが刺激されない強度の最大値とすればよい。このようにした場合も、仮にカメラ２５に刺激光が入射したとしても、画像情報への影響を抑制することができる。刺激用光源３５およびレーザ光源５３からの刺激光の発生を停止してしまうと、次に刺激用光源３５およびレーザ光源５３を立ち上げるまでに時間が掛かり、所望のタイミングで強度が高い刺激光を発生することができないような場合に有効である。

また、上記各実施形態においては、刺激用光源３５を直接変調によって調光することとしたが、これに代えて、例えば、音響光学素子を採用して、刺激用光源３５およびレーザ光源５３から発せられた刺激光を音響光学素子により調光することとしてもよい。また、刺激用光源３５から発せられる刺激光の光路上に光チョッパやシャッタを配置し、これら光チョッパやシャッタによる光路の開閉により、刺激光の発生（ＯＮ）と停止（ＯＦＦ）とを切り替えることとしてもよい。この場合、刺激タイミング生成部４３により、光チョッパやシャッタの駆動を制御することとすればよい。

また、上記各実施形態においては、読み出し時間Ｔｒの期間ごとに刺激用光源３５およびレーザ光源５３から刺激光を発生させることとしたが、これに代えて、複数の読み出し時間Ｔｒの内、いずれか単一の読み出し時間Ｔｒの期間のみ刺激用光源３５およびレーザ光源５３から刺激光を発生させることとしてもよいし、いずれか複数の読み出し時間Ｔｒを設定して、その複数の読み出し時間Ｔｒの期間のみ刺激用光源３５およびレーザ光源５３から刺激光を発生させることとしてもよい。

また、上記各実施形態においては、共焦点スキャナ１７が回転軸Ｃ回りに３０°回転するごとに、フレームレートの１フレーム分が走査されるようにピンホール２７およびマイクロレンズ３１を配置したが、この配置に限定されることはなく、例えば、共焦点スキャナ１７が回転軸Ｃ回りに１５°や４５°あるいは６０°等、３０°以外の角度回転するごとに、フレームレートの１フレーム分が走査されるように複数のピンホール２７およびマイクロレンズ３１を配置することとしてもよい。
また、上記各実施形態においては、刺激用光源３５としてＬＥＤを例示して説明したが、刺激用光源として例えばレーザや水銀光源を採用することとしてもよい。

１、５１走査型顕微鏡
７刺激光学系（刺激光照射部）
１９対物レンズ
２５カメラ（画像取得部）
２７ピンホール（微小開口）
２９ピンホールアレイディスク（開口ディスク）
３６回転駆動部
４３刺激タイミング生成部（調光部）
４９ダイクロイックミラー（光路合成部）
Ｓ標本

Claims

標本に照射する照明光の光束を制限する複数の微小開口が中心軸周りにアレイ状に配置された開口ディスクと、
該開口ディスクを前記中心軸回りに回転させる回転駆動部と、
該回転駆動部により前記中心軸回りに回転させられている前記開口ディスクの前記微小開口を通過した前記照明光を前記標本に照射する一方、該標本において発生する観察光を集光して前記微小開口に入射させる対物レンズと、
該対物レンズにより集光されて前記微小開口を通過した前記観察光を繰り返し撮影し、前記標本の画像情報を取得する画像取得部と、
前記標本に刺激光を照射する刺激光照射部とを備え、
前記画像取得部が、１回の露光期間と、取得した画像情報を読み出す読み出し期間とを交互に繰り返し、
前記刺激光照射部が、前記画像取得部の露光期間中は前記標本を刺激する刺激光の強度を低減し、前記露光期間と前記露光期間との間の読み出し期間は前記刺激光の強度を増大する調光部を備える走査型顕微鏡。
前記調光部が、露光期間中は、前記刺激光の照射を停止しまたは前記刺激光を所定の閾値以下の強度にする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
前記画像取得部が、前記微小開口の配列パターンおよび前記回転駆動部の回転数に基づいて算出されるフレームレートの１フレーム分を走査するのに掛かる走査時間以上の長さの前記露光期間を有する請求項１または請求項２に記載の走査型顕微鏡。
前記露光期間が、前記走査時間の略整数倍に設定されている請求項３に記載の走査型顕微鏡。
前記照明光の光路と前記刺激光の光路とを合成する光路合成部を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の走査型顕微鏡。
前記刺激光が、前記回転駆動部により前記中心軸回りに回転している前記開口ディスクの前記微小開口を通過して前記標本に照射され、
前記調光部が、前記微小開口の配列パターンおよび前記回転駆動部の回転数に基づいて算出されるフレームレートの１フレーム分を走査するのに掛かる走査時間以上の長さの刺激期間に、前記刺激光の強度を増大する請求項１から請求項５のいずれかに記載の走査型顕微鏡。
前記刺激期間が、前記走査時間の略整数倍に設定されている請求項６に記載の走査型顕微鏡。
前記調光部が、前記露光期間と前記露光期間との間の期間において前記刺激光の強度を増大するタイミングを調整可能である請求項１から請求項７のいずれかに記載の走査型顕微鏡。
前記読み出し期間が調整可能である請求項１から請求項８のいずれかに記載の走査型顕微鏡。