JP2007304421A - レーザ走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】光刺激領域における光刺激開始から終了までの光刺激実行時間を短縮することのできるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的としている。
【解決手段】 刺激用レーザ光Ｌ２を出射する刺激用レーザ光源１５と、刺激用レーザ光Ｌ２のビーム径を調節するビーム径調節部１６と、ビーム径が調節された後の刺激用レーザ光Ｌ２をライン状の刺激用レーザ光Ｌ２に変換する変換部１８とを備え、ライン状の刺激用レーザ光を標本Ｐに照射することにより、光刺激を行うレーザ走査型顕微鏡１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。

従来、試料を観察するための観察用走査光学系と、試料に光刺激を与える刺激用走査光学系とを備えるレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特開平１０−２０６７４２号公報参照。）。
このようなレーザ走査型顕微鏡では、刺激用レーザ光源から発せられた刺激用レーザ光をスキャナによって２次元的に走査し、標本に照射することで、光刺激領域に対して光刺激を与えている。
特開平１０−２０６７４２号公報

ところで、上述した光刺激は、光刺激領域の全域に対して略同時に与えることが好ましい。しかしながら、上述した従来のレーザ走査型顕微鏡では、刺激用レーザ光を標本上で２次元的に走査させて光刺激を行うことから、光刺激の開始から終了までに時間がかかるという問題があった。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、光刺激領域における光刺激開始から終了までの光刺激実行時間を短縮することのできるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、刺激用レーザ光を出射する刺激用レーザ光源と、前記刺激用レーザ光のビーム径を調節するビーム径調節手段と、ビーム径が調節された後の前記刺激用レーザ光をライン状の刺激用レーザ光に変換する変換手段とを備え、前記ライン状の刺激用レーザ光を標本に照射することにより光刺激を行うレーザ走査型顕微鏡を提供する。

このような構成によれば、刺激用レーザ光源から出射された刺激用レーザ光は、ビーム径調節手段によりビーム径が調節され、その後、変換手段により、ライン状の刺激用レーザ光に変換されることとなる。ライン状の刺激用レーザ光は、標本上に照射されることにより、光刺激が行われる。このように、ライン状の刺激用レーザ光を標本に照射させることが可能となるので、点状の刺激用レーザ光を標本上で２次元的に走査させる場合に比べて、光刺激を効率的に行うことが可能となる。
上記ビーム径とは、光軸に直交する面における刺激用レーザ光の断面の直径である。

上記レーザ走査型顕微鏡において、前記変換手段をシリンドリカルレンズとしても良い。このように、シリンドリカルレンズを変換手段として採用することにより、簡素な構成によってライン状の刺激用レーザ光を形成することができる。

上記レーザ走査型顕微鏡において、前記ビーム径調節手段が、刺激用レーザ光の光軸上に配置された複数のレンズを備え、更に、前記レンズ間の距離が調整可能とされていてもよい。
このように、ビーム径調節手段が刺激用レーザ光の光路上に配置された複数のレンズによって構成されていることにより、簡素で安価な装置構成とすることができる。更に、これらレンズ間の距離が調整可能にされていることにより、刺激用レーザ光のビーム径を任意に調節することができ、この結果、光刺激レーザ光のライン長を調節することができる。上記ライン長とは、例えば、光軸に直交する面における前記刺激用レーザ光の断面の長手方向の長さである。

上記レーザ走査型顕微鏡において、光刺激を与える光刺激領域の範囲に応じて、前記ビーム径調節手段のレンズ間の距離を調節する制御手段を備えることとしても良い。

このような構成によれば、光刺激領域の範囲に応じて、刺激用レーザ光のビーム径を調節することが可能となる。これにより、刺激用レーザ光のビーム径を光刺激領域の幅などに一致させるように、ビーム径調節手段のレンズ間の距離を調節することにより、刺激用レーザ光のライン長を光刺激領域の一辺と一致させることが可能となる。この結果、光刺激を更に効率的に行うことができる。

上記レーザ走査型顕微鏡において、前記変換手段が前記刺激用レーザ光の光路に対して着脱可能とされていても良い。このように、変換手段が刺激用レーザ光の光路に対して着脱可能に構成されていることにより、ライン状の刺激用レーザ光を標本上で走査させるラインスキャンモードと、点状の刺激用レーザ光、換言すると、スポット光を標本上で２次元的に走査させるポイントスキャンモードとを任意に切り替えて実施することが可能となる。これにより、光刺激領域の形状に応じて、最適なモードにて、光刺激を実施することができる。

また、上記レーザ走査型顕微鏡において、上記変換手段に加えて、前記ビーム径調節手段についても、前記刺激用レーザ光の光路に対して着脱可能とされていてもよい。

本発明によれば、光刺激領域における光刺激開始から終了までの光刺激実行時間を短縮することができるという効果を奏する。

以下、本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図を参照して説明する。本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡は、レーザ走査型共焦点顕微鏡である。

〔第１の実施形態〕
本発明の第１の本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、観察用レーザ光Ｌ１を走査する観察用走査光学系２と、刺激用レーザ光Ｌ２を走査する刺激用走査光学系３と、観察用レーザ光Ｌ１および刺激用レーザ光Ｌ２を合波するダイクロイックミラー４と、合波された観察用レーザ光Ｌ１および刺激用レーザ光Ｌ２を集光して標本Ｐに照射する一方、観察用レーザ光Ｌ１を標本Ｐに照射することにより、標本Ｐ内の蛍光物質が励起されて発生した蛍光Ｆを集光する対物レンズ５と、該対物レンズ５により集光された蛍光Ｆを検出する光検出器６とを備えている。符号７は、結像レンズである。

観察用走査光学系２は、観察用レーザ光Ｌ１を出射する観察用レーザ光源８と、観察用レーザ光源８から発せられた観察用レーザ光Ｌ１を光軸に交差する方向に２次元的に走査する第１のスキャナ９とを備えている。符号１０はリレーレンズ、符号１１はミラーである。

また、観察用走査光学系２の観察用レーザ光源８と第１のスキャナ９との間には、標本Ｐにおいて発生し、対物レンズ５により集光され、結像レンズ７、ダイクロイックミラー４、ミラー１１、リレーレンズ１０、および第１のスキャナ９を経由して戻る蛍光Ｆを観察用レーザ光Ｌ１から分岐して光検出器６に向かわせるダイクロイックミラー１２が備えられている。
第１のスキャナ９は、後述する蛍光画像の左右方向に対応する主走査方向に観察用レーザ光Ｌ１を走査する第１のガルバノミラー９ａと、蛍光画像の上下方向に対応する副走査方向に観察用レーザ光Ｌ１を走査する第２のガルバノミラー９ｂとを備える、いわゆる近接ガルバノミラーである。これにより、観察用レーザ光Ｌ１がラスタスキャン方式で標本Ｐ上に２次元的に走査されるようになっている。

刺激用走査光学系３は、刺激用レーザ光Ｌ２を出射する刺激用レーザ光源１５と、該刺激用レーザ光源１５から発せられた刺激用レーザ光Ｌ２のビーム径を調節するビーム径調節部（ビーム径調節手段）１６と、ビーム径が調節された後の刺激用レーザ光Ｌ２をライン状のレーザ光に変換する変換部（変換手段）１７と、変換部１７によりライン状に変換された刺激用レーザ光Ｌ２を光軸に交差する方向に２次元的に走査可能な第２のスキャナ１８とを備えている。符号１９はリレーレンズである。

上記刺激用走査光学系３において、ビーム径調節部１６は、刺激用レーザ光Ｌ２の光路上に配置された複数のレンズ１６ａ，１６ｂにより構成されている。これらレンズ１６ａ，１６ｂは、レンズ間距離が調節可能に構成されている。本実施形態では、レンズ１６ｂの位置は固定されており、レンズ１６ａが光軸方向に移動可能に支持されている。
変換部１７は、例えば、シリンドリカルレンズにより構成されている。

第２のスキャナ１８は、上述の第１のスキャナ９と同様の構成を備えているが、第１のスキャナ９が主走査方向および副走査方向に観察用レーザ光Ｌ１を走査するのに対し、第２のスキャナ１８は、主走査方向または副走査方向にのみ刺激用レーザ光Ｌ２を走査させる点で異なる。
本実施形態では、後述する蛍光画像の上下方向に対応する副走査方向に刺激用レーザ光Ｌ２を走査する第４のガルバノミラー１８ｂの位置を所定の位置で固定し、主走査方向に刺激用レーザ光Ｌ２を走査する第３のガルバノミラー１８ａのみを走査させる。
これにより、上記変換部１７によってライン状に変換された刺激用レーザ光Ｌ２が標本Ｐ上で主走査方向にのみ走査されることとなる。

光検出器６は、測光フィルタ２０、レンズ２１、共焦点ピンホール２２及び光電変換素子２３を備えて構成される。光電変換素子２３は、Ａ／Ｄ変換器（図示せず）を介して制御装置（制御手段）２５に接続されている。制御装置２５は、第１のスキャナ９による観察用レーザ光Ｌ１の標本Ｐ上における走査位置情報と、光検出器６により検出された蛍光Ｆの光強度情報とに基づいて、２次元的な蛍光画像を構築し、ディスプレイ２６に表示するようになっている。

また、制御装置２５は、ディスプレイ２６に表示した蛍光画像の各画素位置と第２のスキャナ１８の走査位置とを対応付けて記憶している。これにより、ディスプレイ２６に表示した蛍光画像上において、オペレータにより光刺激領域が指定された場合には、その光刺激領域に刺激用レーザ光Ｌ２が照射されるように、第２のスキャナ１８の第３のガルバノミラー１８ａを走査するようになっている。これにより、後述するように、標本Ｐ上における光刺激領域内において、刺激用レーザ光Ｌ２がライン的に走査されることとなる。

また、制御装置２５は、刺激用レーザ光Ｌ２のビーム径とビーム径調節部１６のレンズ１６ａ，１６ｂ間の距離とを対応付けて記憶している。この制御装置２５は、オペレータによって光刺激領域が指定された場合に、刺激用レーザ光のビーム径が、該光刺激領域の幅Ｗ（図３参照）に一致するように、レンズ１７ａの位置を光軸方向に移動させるようになっている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の作用について以下に説明する。
まず、図２のステップＳＡ１において、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１を用いて標本Ｐを観察する。この場合、制御装置２５は、観察用レーザ光源８、第１のスキャナ９を作動させる。これにより、観察用レーザ光源８から出射された観察用レーザ光Ｌ１は、第１のスキャナ９によって２次元的に走査され、リレーレンズ１０、ミラー１１、ダイクロイックミラー４、結像レンズ７、および対物レンズ５を経て、標本Ｐに照射される。標本Ｐに観察用レーザ光Ｌ１が照射されると、標本Ｐ内に存在する蛍光物質が観察用レーザ光Ｌ１によって励起され、蛍光Ｆが発生する。標本Ｐにおいて発生した蛍光Ｆは、対物レンズ５、結像レンズ７、ダイクロイックミラー４、ミラー１１、リレーレンズ１０および第１のスキャナ９を経由して観察用レーザ光Ｌ１と同じ経路を戻り、ダイクロイックミラー１２によって観察用レーザ光Ｌ１と分離されて、光検出器６に導かれる。

光検出器６において、蛍光Ｆは、測光フィルタ２０により特定の波長の光が選択透過され、さらにレンズ２１、共焦点ピンホール２２により観察面からの光のみが選択されて、光電変換素子２３へ入射され、電気信号に変換される。光電変換素子２３の出力信号は、Ａ／Ｄ変換器（図示せず）へ導かれてディジタル信号に変換され、制御装置２５に転送される。制御装置２５では、このディジタル信号に基づいて２次元的な蛍光画像が構築され、ディスプレイ２６に表示される。これにより、ディスプレイ２６には、図３に示すように、観察面における蛍光画像が表示されることとなる。

次に、ディスプレイ２６に表示された蛍光画像において、図３に示すように、オペレータにより光刺激領域が指定されると（図２のステップＳＡ２）、制御装置２５は指定された光刺激領域の幅Ｗに基づいてビーム径調節部１６におけるレンズ１６ａの位置を調節する（図２のステップＳＡ３）。具体的には、制御装置２５は、刺激用レーザ光Ｌ２のビーム径が、指定された光刺激領域の幅Ｗに一致するように、レンズ１６ａの位置を調節する。

続いて、制御装置２５は、上記光刺激領域の位置に応じて第２のスキャナ１９の走査範囲を決定する。具体的には、制御装置２５は、光刺激開始時において、対物レンズ５から標本Ｐに照射されるライン状の刺激用レーザ光Ｌ２が、光刺激領域の上辺ＰＬ１に一致するように、第４のガルバノミラー１８ｂの位置を固定させる（図２のステップＳＡ４）。

このようにして、光刺激の準備が完了すると、制御装置２５は、刺激用レーザ光源８、および第２のスキャナ１８における第３のガルバノミラー１８ａを作動させることによって、光刺激を開始する（図２のステップＳＡ５）。

これにより、刺激用レーザ光源１５から刺激用レーザ光Ｌ２が出射され、ビーム径調節部１６に入射することによって、そのビーム径Ｄが光刺激領域の幅Ｗと一致するように調整される。ビーム径Ｄが調整された刺激用レーザ光Ｌ２は、変換部１７に入射することで、図４に示すように、ビーム径Ｄに応じた長さのライン状のレーザ光に変換される。ライン状に変換された刺激用レーザ光Ｌ２は、第２のスキャン１８における第３のガルバノミラー１８ａの位置にて集光して第４のガルバノミラー１８ｂに向けて反射され、第４のガルバノミラー１８ｂ、リレーレンズ１９を経由してダイクロイックミラー４に導かれる。

ダイクロイックミラー４において、刺激用レーザ光Ｌ２は、観察用レーザ光Ｌ１と合波され、結像レンズ７、対物レンズ５を介して標本Ｐに照射される。この場合において、刺激用レーザ光Ｌ２は、光刺激領域の幅Ｗと同じ長さのライン状の光として標本Ｐに照射されることとなる。制御装置２５が第２のスキャナ１８の第３のガルバノミラー１８ａを走査することにより、ライン状の刺激用レーザ光Ｌ２は標本上Ｐを主走査方向（図３参照）に走査されることとなる。そして、図３において指定された光刺激領域の全域に対する光刺激が終了すると、制御装置２５は、刺激用光学系３の作動を停止させる。
一方、光刺激が行われている間も、制御装置２５が観察用光学系２の第１のスキャナ９等を継続的に作動させる。これにより、光刺激前後の蛍光画像が取得され、ディスプレイ２６に表示されることとなる。

以上、説明してきたように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、ライン状の刺激用レーザ光Ｌ２を標本Ｐに照射させることが可能となるので、ライン状の刺激用レーザ光Ｌ２を一方向にのみ走査させることで、効率的に光刺激を実施することができる。この結果、光刺激が開始されてから終了するまでの光刺激実行時間を短縮することができる。
更に、ビーム径調節部１６において、レンズ１６ａ，１６ｂ間の距離が調節可能に構成されているので、光刺激領域の範囲に応じて刺激用レーザ光Ｌ２のビーム径Ｄを調節することが可能となる。この結果、刺激用レーザ光Ｌ２のライン長を光刺激領域の範囲に合わせて自由に調節することができる。

なお、上述の実施形態においては、図３に示すように、刺激用レーザ光Ｌ２のライン長Ｄを光刺激領域の幅Ｗに一致するように調整し、このライン状の刺激用レーザ光Ｌ２を主走査方向に走査させたが、これに代えて、図５に示すように、刺激用レーザ光Ｌ２のライン長Ｄを光刺激領域の縦方向の長さＬに一致するように調整し、このライン状の刺激用レーザ光Ｌ２を副走査方向に走査させることとしても良い。
この場合には、変換部１７を構成するシリンドリカルレンズ１７を図１に示した状態から９０度回転させて配置することが必要となるほか、ビーム径調節部１６におけるレンズ１６ａ，１６ｂ間の距離を光刺激領域の縦方向の長さＬに一致するように調節し、更に、第３のガルバノミラー１８ａを光刺激領域の位置に応じて固定する必要がある。そして、この状態で、第４のガルバノミラー１８ｂを走査すればよい。

また、シリンドリカルレンズ１７を光軸に対して軸回転可能に設け、光刺激領域の形状に応じて、配置角度を切り替え（０度または９０度）、この切り替えに伴って、ビーム径調節部１６および第２のスキャン１８の制御についても切り替えることとしても良い。例えば、図３に示すように、光刺激領域の幅Ｗが長さＬよりも長い場合には、シリンドリカルレンズ１７を図１に示すように配置した上で、刺激用レーザ光Ｌ２のライン長を幅Ｗに一致させて、この刺激用レーザ光Ｌ２を主走査方向に走査させ、一方、図４に示すように、光刺激領域の幅Ｗが長さＬよりも短い場合には、シリンドリカルレンズ１７を９０度軸回転させるとともに、刺激用レーザ光Ｌ２のライン長を長さＬに一致させて、この刺激用レーザ光Ｌ２を副走査方向に走査させる。このように構成することで、光刺激の効率を更に高めることができ、光刺激時間を更に短縮させることができる。

〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態について、図を用いて説明する。
本実施形態のレーザ走査型顕微鏡が第１の実施形態と異なる点は、変換部１７が刺激用レーザ光Ｌ２の光軸から着脱可能に設けられている点である。変換部１７が刺激用レーザ光Ｌ２の光路から着脱可能に設けられているので、上述したようなライン状の刺激用レーザ光Ｌ２を標本Ｐに照射させる態様のほか、点状、換言すると、スポット状の刺激用レーザ光Ｌ２を第２のスキャナ１８によって２次元的に走査させることも可能となる。

このようなレーザ走査型顕微鏡にて光刺激を行う場合には、まず、上述した第１の実施形態と同様に、観察用光学系２を作動させて標本Ｐの蛍光画像を取得し（図７のステップＢ１）、この蛍光画像上において光刺激領域が指定されると（図７のステップＳＢ２）、オペレータがスキャンモードを選択する（図７のステップＳＢ３）。本実施形態においては、ライン状の刺激用レーザ光Ｌ２を標本Ｐ上で走査させるラインスキャンモード、あるいは、点状の刺激用レーザ光Ｌ２を標本Ｐ上で２次元的に走査させるポイントスキャンモードのいずれかを選択することができる。

オペレータによってラインスキャンモードが選択された場合には、上述した第１の実施形態と同様の手順により、ビーム径調節部１６のレンズ１６ａの位置が調整され（図７のステップＳＢ５）、更に、第２のスキャナ１８の第４のガルバノミラー１８ｂの位置が調節されて（図７のステップＳＢ６）、光刺激が開始されることとなる（図７のステップＳＢ８）。一方、ステップＳＢ４において、ポイントスキャンモードが選択された場合には、変換部１８が刺激用レーザ光Ｌ２の光軸から外された後に（図７のステップＳＢ７）、光刺激が開始される。この場合には、第２のスキャナ１８における第３及び第４のガルバノミラー１８ａ，１８ｂがともに走査されることにより、点状の刺激用レーザ光Ｌ２が標本Ｐ上で２次元的に走査されることとなる。

以上、説明してきたように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、変換部１７が刺激用レーザ光Ｌ２の光路に対して着脱可能に構成されていることにより、ライン状の刺激用レーザ光Ｌ２を標本Ｐ上で走査させるラインスキャンモードと、点状の刺激用レーザ光Ｌ２を標本Ｐ上で２次元的に走査させるポイントスキャンモードとを任意に選択することが可能となる。これにより、光刺激領域の形状に応じて、最適なモードを選択することが可能となる。

なお、上述した実施形態では、変換部１７のみを刺激用レーザ光Ｌ２の光軸に対して着脱可能に構成することとしたが、変換部１７に加えて、ビーム径調節部１６についても刺激用レーザ光Ｌ２の光軸に対して着脱可能に構成することとしても良い。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。 本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の処理手順の一例を示したフローチャートである。 蛍光画像上に指定された光刺激領域の一例を示した図である。 シリンドリカルレンズの作用について説明するための説明図である。 本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の他の走査例を説明する場合に用いられる蛍光画像上に指定された光刺激領域の一例を示した図である。 本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。 本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の処理手順の一例を示したフローチャートである。

符号の説明

Ｐ 標本
Ｆ 蛍光
Ｌ１ 観察用レーザ光
Ｌ２ 刺激用レーザ光
１ レーザ走査型顕微鏡
２ 観察用光学系
３ 刺激用光学系
４ ダイクロイックミラー
５ 対物レンズ
６ 光検出器
８ 観察用レーザ光源
９ 第１のスキャナ
９ａ 第１のガルバノミラー
９ｂ 第２のガルバノミラー
１５ 刺激用レーザ光源
１６ ビーム径調節部
１７ 変換部
１８ 第２のスキャナ
１８ａ 第３のガルバノミラー
１８ｂ 第４のガルバノミラー
２５ 制御装置
２６ ディスプレイ

Claims (6)

1. 刺激用レーザ光を出射する刺激用レーザ光源と、
   前記刺激用レーザ光のビーム径を調節するビーム径調節手段と、
   ビーム径が調節された後の前記刺激用レーザ光をライン状の刺激用レーザ光に変換する変換手段と
   を備え、
   前記ライン状の刺激用レーザ光を標本に照射することにより光刺激を行うレーザ走査型顕微鏡。
2. 前記変換手段がシリンドリカルレンズである請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
3. 前記ビーム径調節手段が、レーザ光の光路上に配置された複数のレンズを備え、更に、前記レンズ間の距離が調節可能とされている請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
4. 光刺激を与える光刺激領域の範囲に応じて、前記ビーム径調節手段のレンズ間の距離を調節する制御手段を備える請求項３に記載のレーザ走査型顕微鏡。
5. 前記変換手段が前記刺激用レーザ光の光路に対して着脱可能とされている請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
6. 前記ビーム径調節手段が前記刺激用レーザ光の光路に対して着脱可能とされている請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡。

Images