JP2007304339A

JP2007304339A - レーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法

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Publication number: JP2007304339A
Application number: JP2006132674A
Authority: JP
Inventors: Nobuhiro Takamizawa; 伸拡高見澤; Tatsuo Nakada; 竜男中田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2006-05-11
Filing date: 2006-05-11
Publication date: 2007-11-22
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Also published as: JP4912737B2; US7483131B2; US20070263282A1; EP1855141A1

Abstract

【課題】標本内の同じ位置に操作用レーザ光を合焦させた状態を維持しながら観察用レーザ光の合焦位置のみを移動させることのできるレーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法を提供することを目的とする。
【解決手段】標本を観察するための観察用レーザ光と標本を操作するための操作用レーザ光とを合波し、合波後の光を対物レンズを介してステージ上に載せられた標本に照射し、標本内から観察光軸方向に発せられる蛍光を検出する。この場合において、準備モードにおいては、合焦機構による対物レンズまたはステージの移動にかかわらず、観察用レーザ光の合焦位置と操作用レーザ光の合焦位置とが一致するように、合焦位置調節装置を制御し、観察モードにおいては、対物レンズまたはステージの移動に伴う操作用レーザ光の合焦位置のずれ量を相殺するように、合焦位置調節装置を制御する。
【選択図】図１

Description

本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関し、特に、観察用レーザ光と操作用レーザ光とを合波して同一の対物レンズにより標本に照射するレーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法に関するものである。

従来、観察用レーザ光源と操作用レーザ光源とを備え、観察用レーザ光および操作用レーザ光を別個の走査手段により標本上で２次元的に走査するレーザ走査型顕微鏡が知られている。
例えば、特許文献１には、操作用レーザ光の合焦位置を変更する摺動可能な合焦手段を備え、操作用レーザ光の合焦位置を独立して変更可能としたレーザ走査型顕微鏡が開示されている。更に、この特許文献１には、操作用レーザ光を光ピンセットとして利用することが開示されている。具体的には、特許文献１には、対物レンズの焦平面に平行な面内において、種々異なる操作部位に操作用レーザ光を照射することで、該操作部位を光ピンセットで捉えることが開示されている。
特開２００２−８２２８７号公報（第５図）

ところで、上述したようなレーザ走査型顕微鏡においては、標本の複数の箇所を光ピンセットで捉え、この状態を維持したまま、つまり、光ピンセットの把持位置を維持したまま、観察用レーザ光を３次元的に操作させることにより、標本の３次元的な蛍光画像を取得することが望まれる。しかしながら、観察用レーザ光と操作用レーザ光とを同一の対物レンズを介して標本に照射する場合、観察用レーザ光の合焦位置を変化させるために、対物レンズあるいは標本が載置されているステージを移動させると、この移動に伴い、操作用レーザ光の合焦位置も移動してしまうという不都合が生ずる。このため、標本における常に同じ位置を光ピンセットによって把持しながら、観察用レーザ光のみを３次元的に走査させるとういことができないという問題が生ずる。上記特許文献１には、このような問題に対する具体的な開示がなく、上記問題の解決には至っていない。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、同一の対物レンズを介して観察用レーザ光と操作用レーザ光とを標本に照射する場合において、標本内の同じ位置に操作用レーザ光を合焦させた状態を維持しながら観察用レーザ光の合焦位置のみを移動させることのできるレーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、標本を操作するための操作用レーザ光を発する操作用レーザ光源と、観察用レーザ光を２次元的に走査する走査手段と、操作用レーザ光の照射位置を２次元的に調節するレーザ光位置調節手段と、前記操作用レーザ光の合焦位置を光軸方向に移動させる合焦位置調節手段と、前記走査手段により走査された観察用レーザ光と、前記レーザ光位置調節手段および前記合焦位置調節手段により調節された操作用レーザ光とを合波する合波手段と、前記合波手段により合波された観察用レーザ光および操作用レーザ光を集光して標本に照射する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、前記対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器と、前記対物レンズまたは前記標本が載せられたステージを光軸方向に移動させるＺ軸駆動手段と、前記対物レンズまたは前記ステージの移動量と前記合焦位置調節手段とを制御する制御手段と、前記Ｚ軸駆動手段による前記対物レンズまたは前記ステージの移動にかかわらず、前記観察用レーザ光の合焦位置と操作用レーザ光の合焦位置とが一致するように、前記制御手段が前記合焦位置調節手段を制御する準備モードと、前記対物レンズまたは前記ステージの移動に伴う前記操作用レーザ光の合焦位置のずれ量を相殺するように、前記制御手段が前記合焦位置調節手段を制御する観察モードとを切り替えるモード切替手段とを具備するレーザ走査型顕微鏡を提供する。

上記レーザ走査型顕微鏡によれば、観察用レーザ光源から発せられた観察用レーザ光が、走査手段により２次元的に走査され、対物レンズによって標本上に集光される。一方、操作用レーザ光源から発せられた操作用レーザ光は、レーザ光位置調節手段の作動により２次元的な配置を調節され、また、合焦位置調節手段の作動により合焦位置が調整された後、合波手段の作動により観察用レーザ光と合波され、対物レンズにより標本上に集光される。

観察用レーザ光は、標本に集光されることにより、標本内の蛍光物質を励起して蛍光を発生させる。発生した蛍光は、対物レンズ、合波手段、走査手段を介して戻り、光検出器により検出される。走査手段による標本上の操作位置情報および光検出器により検出された蛍光の光量情報に基づいて、蛍光画像が構築される。また、Ｚ軸駆動手段の作動により対物レンズまたはステージが光軸方向に沿って移動させられることで、標本内における観察用レーザ光の焦点位置が光軸方向に移動し、標本の任意の深さにおける蛍光画像が構築される。

一方、操作用レーザ光は、対物レンズにより標本に集光されることにより、標本に対し、光刺激、レーザトラップ（光ピンセット）等の操作を行う。このとき、操作用レーザ光源から複数の操作用レーザ光を発する構成とすれば、複数の操作用レーザ光が標本に入射されることとなるので、標本に対し、複数箇所の光刺激やレーザトラップを行うことができる。

この場合において、本発明によれば、準備モードと観察モードとを切り替える切り替え手段を備えているので、例えば、準備モードにおいては、対物レンズまたはステージの移動にかかわらず、観察用レーザ光の合焦位置と操作用レーザ光の合焦位置とが一致するように、合焦位置調節手段が制御されることとなる。これにより、操作用レーザ光の合焦位置を観察用レーザ光の合焦位置に一致させた状態を保持することが可能となるので、観察モードに切り替えられた場合には、観察用レーザ光および操作用レーザ光の合焦位置が合致している状態とすることができ、観察を円滑に開始させることができる。
また、観察モードにおいては、対物レンズまたはステージの移動に伴う操作用レーザ光の合焦位置のずれ量を相殺するように、合焦位置調節手段が制御されることとなる。これにより、対物レンズまたはステージの移動に伴って観察用レーザ光の合焦位置が連続的に移動した場合でも、操作用レーザ光の合焦位置を所望の位置に固定させることができる。この結果、光刺激を標本の同じ位置に対して行いながら、或いは、光ピンセットの把持位置を常に同じ位置に固定させた状態で、観察用レーザ光の合焦位置のみを標本の深さ方向に移動させることができる。

本発明は、標本を観察するための観察用レーザ光と標本を操作するための操作用レーザ光とを合波し、合波後の光を対物レンズを介してステージ上に載せられた前記標本に照射し、前記標本内から前記観察光軸方向に発せられる蛍光を検出する顕微鏡観察方法であって、前記標本に対する前記操作用レーザ光の照射を停止した状態で、前記対物レンズまたは前記ステージの移動にかかわらず、前記観察用レーザ光の合焦位置と前記操作用レーザ光の合焦位置とが一致するように前記操作用レーザ光の合焦位置を調節する準備モードを実施し、前記操作用レーザ光の合焦位置が所望の位置に達した場合に、前記標本に対する前記操作用レーザ光の照射を開始するとともに、前記対物レンズまたは前記ステージの移動に伴う前記操作用レーザ光の合焦位置のずれ量を相殺するように、前記操作用レーザ光の合焦位置を調節する観察モードに切り替える顕微鏡観察方法を提供する。

上記顕微鏡観察方法によれば、まずは、準備モードが実施されることにより、操作用レーザ光の照射が停止された状態で、前対物レンズまたはステージの移動にかかわらず観察用レーザ光の合焦位置と操作用レーザ光の合焦位置とが一致するように、操作用レーザ光の合焦位置が調節される。そして、この準備モードにおいて、操作用レーザ光の合焦位置が所望の位置に達すると、準備モードから観察モードに切り替えられることにより、標本に対する操作用レーザ光の照射が開始されるとともに、対物レンズまたはステージの移動に伴う操作用レーザ光の合焦位置のずれ量を相殺するように、操作用レーザ光の合焦位置が調節されることとなる。

これにより、準備モードにおいては、対物レンズまたはステージが光軸方向に移動することに伴い、操作用レーザ光の合焦位置がずれたとしても、操作用レーザ光の合焦位置と観察用レーザ光の合焦位置とが一致するように、操作用レーザ光の合焦位置が調整されるので、観察用レーザ光と操作用レーザ光とを同一位置で合焦させた状態を保持することができる。この結果、観察モードに切り替えられた場合には、観察を円滑に開始させることができる。
また、観察モードにおいては、対物レンズまたはステージが光軸方向に移動することに伴い、操作用レーザ光の合焦位置がずれたとしても、このずれを相殺するように操作用レーザ光の合焦位置が調節されるので、標本に対する操作用レーザ光の合焦位置を固定させることが可能となる。この結果、光刺激を標本の同じ位置に対して行いながら、或いは、光ピンセットの把持位置を常に同じ位置に固定させた状態で、観察用レーザ光の合焦位置のみを標本の深さ方向に移動させることができる。

上記顕微鏡観察方法において、前記操作用レーザ光の合焦位置の調節を前記標本の蛍光検出に同期して行うことが好ましい。

このような方法によれば、対物レンズまたはステージの動きに同期して、操作用レーザ光の合焦位置が調節されるので、効率的に観察を行うことができる。

本発明によれば、標本内の同じ位置に操作用レーザ光を合焦させた状態を維持しながら観察用レーザ光の合焦位置のみを移動させることができるという効果を奏する。

以下、本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１について、図１から図７を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、レーザ走査型共焦点顕微鏡である。図１中、各種レンズおよびピンホール等の光学部品は、説明の簡略化のために省略している。

本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、観察用レーザ光Ｌ１を発生する観察用レーザ光発生部２と、操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を発生する操作用レーザ光発生部３と、観察用レーザ光Ｌ１および操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を合波するダイクロイックミラー（合波手段）４と、合波された観察用レーザ光Ｌ１および操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を集光して標本Ｐに照射する一方、観察用レーザ光Ｌ１を標本Ｐに照射することにより、標本Ｐ内の蛍光物質が励起されて発生した蛍光Ｆを集光する対物レンズ５と、該対物レンズ５により集光された蛍光Ｆを検出する光検出器６とを備えている。

観察用レーザ光発生部２は、観察用レーザ光Ｌ１を出射する観察用レーザ光源７と、観察用レーザ光源７から発せられた観察用レーザ光Ｌ１を光軸に交差する方向に２次元的に走査する第１のスキャナ（走査手段）８とを備えている。符号９はミラーである。
また、観察用レーザ光発生部２の観察用レーザ光源７と第１のスキャナ８との間には、標本Ｐにおいて発生し、対物レンズ５により集光され、ダイクロイックミラー４、ミラー９および第１のスキャナ８を経由して戻る蛍光Ｆを観察用レーザ光Ｌ１から分岐して光検出器６に向かわせるダイクロイックミラー１０が備えられている。

操作用レーザ光発生部３は、操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を出射する操作用レーザ光源１１と、該操作用レーザ光源１１から発せられた操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を分岐するハーフミラー１２と、分岐された２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３をそれぞれ光軸に交差する方向に２次元的に位置調節する第２のスキャナ（レーザ光位置調節手段）１３，１４と、第２のスキャナ１３，１４によりそれぞれ位置調節された２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を合波する偏光ビームスプリッタ１５とを備えている。符号１６はミラーである。

また、操作用レーザ光発生部３には、ハーフミラー１２により分岐された一方の操作用レーザ光Ｌ３の偏光方向を９０°回転させるλ／２板１７と、標本Ｐ上における操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置を調節する合焦位置調節装置（合焦位置調整手段）１８，１９とが備えられている。合焦位置調節装置１８，１９は、波面変換素子あるいは少なくとも一部が光軸方向に移動可能に支持された複数のレンズ群（図示略）により構成されている。

また、ハーフミラー１２により分岐された２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の光路には、それぞれ、後述する制御装置２０により開閉制御されるシャッタ２１，２２が設けられている。シャッタ２１，２２に代えて、ＡＯＴＦやＡＯＭのような音響光学素子を用いても良い。
操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３は、標本Ｐに結合されたアクチンまたはミオシンの位置に合焦されることにより、標本Ｐを保持する光ピンセットとして利用されるようになっている。

また、前記対物レンズ５は、該対物レンズ５を光軸方向に沿って移動させる合焦機構（Ｚ軸駆動手段）２３により支持されている。
合焦機構２３および合焦位置調節装置１８，１９は、制御装置２０に接続されている。制御装置２０は、合焦機構２３による対物レンズ５の移動量と合焦位置調節装置１８，１９による２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置の移動量との関係を記憶している。

制御装置２０は、観察用レーザ光Ｌ１および操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３をいずれも照射している観察モードにおいては、合焦機構２３と合焦位置調節装置１８，１９を連動して作動させ、対物レンズ５の移動に伴う操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置のずれ量を相殺するように、操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置を移動させるようになっている。制御装置２０は、例えば、対物レンズ５の移動方向とは逆方向に同じ距離だけ２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置を移動させるようになっている。

また、制御装置２０は、観察用レーザ光Ｌ１のみを照射し、操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を停止している準備モードにおいては、観察用レーザ光Ｌ１の合焦位置と、停止されている操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置（操作用レーザ光が出射されたならば達成される合焦位置）とを一致させた状態で、合焦機構２３と合焦位置調節装置１８，１９との連動を停止するようになっている。
これにより、準備モードにおいては、合焦機構２３を作動させて対物レンズ５を光軸方向に移動させると、観察用レーザ光Ｌ１のみならず停止されている操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置が対物レンズ５とともに光軸方向に移動させられるようになっている。

このように機能する制御装置２０は、例えば、コンピュータ装置を内蔵している。コンピュータ装置は、例えば、ＣＰＵ（中央演算装置）、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random
Access Memory）等から構成されている。上述の各種機能を実現するための一連の処理の過程は、プログラムの形式でＲＯＭ等に記録されており、このプログラムをＣＰＵがＲＡＭ等に読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、各種機能が実現される。

上記制御装置２０には、前記光検出器６、第１、第２のスキャナ８，１３、モニタ２４およびマウス２５が接続されている。
制御装置２０は、第１のスキャナ８による観察用レーザ光Ｌ１の標本Ｐ上における走査位置情報と、光検出器６により検出された蛍光Ｆの光強度情報とに基づいて、２次元的な蛍光画像を構築し、モニタ２４に表示するようになっている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１を用いて、標本Ｐ、例えば、シャーレ２６内に貯留された培地２７内に浮遊する細胞を観察する場合には、図２に示されるように、標本Ｐの端点Ａ，Ｂにアクチンまたはミオシンを結合しておき（図８のステップＳ１）、制御装置２０を準備モードに切り替える（図８のステップＳ２：モード切替手段）。

これにより、図２に示されるように、観察用レーザ光発生部２からの観察用レーザ光Ｌ１のみが標本Ｐに照射され、２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３は停止される。操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の停止は、操作用レーザ光源１１のオフまたはシャッタ２１，２２の閉鎖あるいは、音響光学素子のオフにより行う。ここでは、シャッタ２１，２２の閉鎖により行うこととして説明する。

操作者は、合焦機構２３を作動させて、例えば、標本Ｐの最上位近傍に観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰが配置されるように対物レンズ５を移動し、第１のスキャナ８を作動させる。これにより、観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰにおける標本Ｐの蛍光画像が取得される（図８のステップＳ３）。図２に示す例では、標本Ｐの端点Ａが最上位位置であるため、端点Ａを含む最上位位置の断面の蛍光画像が取得される。

操作者は、取得された蛍光画像をモニタ２４上で確認しながら、このモニタ２４上の蛍光画像に対して端点Ａをマウス２５等の入力手段により指示する（図８のステップＳ４）。これにより、一方の操作用レーザ光Ｌ２による光ピンセットの把持位置が指定されるので、制御装置２０は、第２のスキャナ１３を作動させて、一方の操作用レーザ光Ｌ２の照射位置を指定された端点Ａに一致するように２次元的に位置調整した後（図８のステップＳ５）、当該一方の操作用レーザ光Ｌ２の光路上のシャッタ２１を開放し、操作用レーザ光Ｌ２を標本Ｐに照射する。

準備モードにおいては、停止されていた操作用レーザ光Ｌ２の合焦位置が観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰと一致した状態に維持されているので、シャッタ２１の開放により照射された操作用レーザ光Ｌ２は、図３に示されるように、端点Ａに合焦され、標本Ｐを端点Ａにおいて保持することができる。
同時に、制御装置２０は、シャッタ２１を開放した当該一方の操作用レーザ光Ｌ２については準備モードを解除し、観察モードに切り替える（図８のステップＳ６：モード切替手段）。

次いで、操作者は、合焦機構２３を作動させて、図４に示されるように、観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰを下降させていく。このとき、シャッタ２２が閉鎖されている操作用レーザ光Ｌ３については準備モードに維持されているため、その合焦位置は、観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰに一致した状態で合焦機構２３の動作に従って下降させられる。

一方、準備モードが解除されて観察モードに切り替えられた操作用レーザ光Ｌ２については、制御装置２０の作動により、合焦機構２３と合焦位置調節手段１８とが連動させられる。これにより、操作用レーザ光Ｌ２は、合焦機構２３により観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰとともに移動させられる一方で、その移動量と同一の移動量で逆方向に操作用レーザ光Ｌ２の合焦位置が移動するように合焦位置調節手段１８が作動させられる。その結果、操作用レーザ光Ｌ２は、図４に示されるように、標本Ｐの端点Ａを保持した合焦位置を移動させることなく静止した状態に維持される。

そして、操作者は、合焦機構２３を作動させて、例えば、図５に示されるように、標本Ｐの最下位近傍に観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰが配置されるように対物レンズ５を移動し、第１のスキャナ８を作動させる。図５に示す例では、標本Ｐの端点Ｂが最下位位置であるため、端点Ｂを含む最下位位置の断面の蛍光画像が取得される（図８のステップＳ７）。

操作者は、取得された蛍光画像をモニタ２４上で確認しながら、端点Ｂをマウス２５等の入力手段により指示する（図８のステップＳ８）。これにより、他方の操作用レーザ光Ｌ３による光ピンセットの把持位置が指定されるので、制御装置２０は、第２のスキャナ１４を作動させて、他方の操作用レーザ光Ｌ３の照射位置を指定された端点Ｂに一致するように２次元的に位置調整した後（図８のステップＳ９）、当該他方の操作用レーザ光Ｌ３の光路上のシャッタ２２を開放し、図６に示されるように、操作用レーザ光Ｌ３を標本Ｐに照射する。

シャッタ２２の開放により照射された当該他方の操作用レーザ光Ｌ３が端点Ｂに合焦され、標本Ｐを端点Ｂにおいて保持することができる。
同時に、制御装置２０は、シャッタ２２を開放した当該他方の操作用レーザ光Ｌ３についても準備モードを解除し、観察モードに切り替える（図８のステップＳ１０：モード切替手段）。これにより、図７に示されるように、合焦機構２３を作動させて対物レンズ５を光軸方向に移動させても、他方の操作用レーザ光Ｌ３も、標本Ｐの端点Ｂを保持した合焦位置を移動させることなく静止した状態に維持される。

その後の観察モードにおいては、合焦機構２３を作動させることにより対物レンズ５を移動させ、観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰを移動させても、端点Ａ，Ｂを保持している２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置が静止状態に維持される。したがって、操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を用いた光ピンセットにより標本Ｐを端点Ａ，Ｂの２カ所で静止した状態に維持しつつ、観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰを順次移動させて、蛍光画像の取得位置を対物レンズ５の光軸方向に変位させることができる。そして、対物レンズ５の光軸方向にずれた複数の蛍光画像を取得することにより、これらの蛍光画像を用いて、標本Ｐの３次元的な蛍光分布を取得することが可能となる（図８のステップＳ１１）。

以上説明したように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、合焦機構２３の作動により、対物レンズ５が移動された場合には、この移動量に応じて合焦位置調節装置１８，１９が制御装置２０によって調節されるので、対物レンズ５の移動に伴う操作用レーザ光の合焦位置のずれ量を考慮した合焦位置調整を行うことが可能となる。これにより、観察用レーザ光の合焦位置を連続的に移動させた場合でも、操作用レーザ光を所望の位置に合焦させることができる。

また、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、標本に操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を照射している観察モードにおいては、対物レンズ５が移動すると、その移動に伴う操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置のずれ量を相殺するように、制御装置２０が合焦位置調節装置１８，１９を制御するので、標本Ｐに対する操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置を固定させることができる。これにより、光刺激やレーザトラップを標本の同じ位置に対して行いながら、観察用レーザ光Ｌ１の合焦位置のみを標本の深さ方向に移動させることができる。
つまり、観察モードにおいては、合焦機構２３と合焦位置調節装置１８，１９とを連動させることにより、単一の対物レンズ５を介して標本Ｐに照射されている観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰのみを対物レンズ５の移動に従って移動させ、操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置を固定させておくことができる。この結果、標本Ｐを静止させたままの状態で、観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰを対物レンズ５の光軸方向に移動させることができ、標本Ｐの状態を変化させることなく、また、標本Ｐに外力を付与することなく、３次元的な蛍光分布を観察することができる。

更に、標本に対する操作用レーザ光の照射を停止している準備モードにおいては、観察用レーザ光Ｌ１の合焦位置と操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置とが一致するように、制御装置２０が合焦位置調節装置１８，１９を制御するので、操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置を観察用レーザ光Ｌ１の合焦位置に一致させた状態を保持することが可能となる。これにより、観察モードに切り替えられた場合には、観察用レーザ光Ｌ１および操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置が合致している状態とすることができ、観察を円滑に開始させることができる。

また、上記レーザ走査型顕微鏡１によれば、２つに分岐された操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３の合焦位置が、それぞれ、合焦位置調節手段１８，１９により対物レンズ５の光軸方向に調節され、第２のスキャナ１３，１４により対物レンズ５の光軸に交差する２次元方向に調節される。そして、合焦位置を調節された２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３が、偏光ビームスプリッタ１５によって合波された後に、ダイクロイックミラー４により観察用レーザ光Ｌ１に合波されるので、対物レンズ５により集光された蛍光Ｆが偏光ビームスプリッタ１５を通過せずに済む。その結果、２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を照射する場合においても、操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３と観察用レーザ光Ｌ１との合波位置における蛍光Ｆのロスが増大することがなく、明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。

また、λ／２板１７と偏光ビームスプリッタ１５とにより、２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を合波することとしているので、操作用レーザ光源１１が１つで済み、装置の小型化を図ることができる。また、操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３のロスを低減することにより無駄をなくし、消費電力を低減することができる。

なお、本実施形態においては、単一の操作用レーザ光源１１から発せられた操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３をハーフミラー１２によって分岐することとしたが、これに代えて、各操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３毎に、操作用レーザ光源１１を配置してもよい。この場合には、操作用レーザ光源１１の設置角度を９０°異ならせることにより、偏光方向が相互に直交する２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を利用することができる。

また、２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を用いる場合について説明したが、これに代えて、３以上の操作用レーザ光を用いることにしてもよい。この場合には、２つの操作用レーザ光を上記と同様にして合波した後に合波された操作用レーザ光をさらに他の操作用レーザ光と合波させることとすればよい。

また、操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を光ピンセットとして使用する場合について説明したが、光刺激用に使用することとしてもよい。このようにすることで、２カ所以上の定まった位置に光刺激を付与しながら標本Ｐの３次元的な蛍光分布を取得することができる。
また、合焦機構２３として、対物レンズ５を光軸方向に移動させるものを例示したが、これに代えて、対物レンズ５は固定したままで、標本Ｐを支持するステージ２８を光軸方向に移動させることにしてもよい。

また、本実施形態においては、２つの操作用レーザ光Ｌ２，Ｌ３を光ピンセットとして使用し、標本Ｐの異なる端点Ａ，Ｂを静止した状態に保持したままで、合焦機構２３の作動により対物レンズ５を光軸方向に移動させて、観察用レーザ光Ｌ１の焦点面ＦＰを光軸方向に移動させたが、これに代えて、光ピンセットにより端点Ａ，Ｂを把持した後は、合焦位置調節装置１８，１９の作動により標本Ｐを対物レンズ５の光軸方向に移動させることとしてもよい。

このようにすることで、合焦機構２３により対物レンズ５やステージ２８を移動させることなく、標本Ｐの３次元的な蛍光分布を取得することができる。その結果、対物レンズ５やステージ２８を移動させるような大きな駆動力を発生するモータが不要となり、装置の小型化を図ることができる。

本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。図１のレーザ走査型顕微鏡から観察用レーザ光のみを標本に照射した準備モードを示す説明図である。図１のレーザ走査型顕微鏡からの観察用レーザ光の焦点面が、標本の最上位位置に一致した原点位置において、一方の操作用レーザ光を標本に照射した状態を示す説明図である。図３の原点位置から観察用レーザ光の焦点面を下降させた状態を示す説明図である。図１のレーザ走査型顕微鏡からの観察用レーザ光の焦点面が、標本の最下位位置に一致した状態を示す説明図である。図５の状態で他方の観察用レーザ光を標本に照射した状態を示す説明図である。図５の状態において２つの操作用レーザ光を固定し、観察用レーザ光のみを移動させる観察モードを説明する説明図である。図１のレーザ走査型顕微鏡を用いた標本の観察手順を示すフローチャートである。

符号の説明

Ｆ蛍光
Ｌ１観察用レーザ光
Ｌ２，Ｌ３操作用レーザ光
Ｐ標本
１レーザ走査型顕微鏡
４ダイクロイックミラー（合波手段）
５対物レンズ
６光検出器
７観察用レーザ光源
８第１のスキャナ（走査手段）
１１操作用レーザ光源
１２ハーフミラー
１３，１４第２のスキャナ（レーザ光位置調節手段）
１５偏光ビームスプリッタ
１７ λ／２板
１８，１９合焦位置調節装置（合焦位置調節手段）
２３合焦機構（Ｚ軸駆動手段）

Claims

観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、
標本を操作するための操作用レーザ光を発する操作用レーザ光源と、
観察用レーザ光を２次元的に走査する走査手段と、
操作用レーザ光の照射位置を２次元的に調節するレーザ光位置調節手段と、
前記操作用レーザ光の合焦位置を光軸方向に移動させる合焦位置調節手段と、
前記走査手段により走査された観察用レーザ光と、前記レーザ光位置調節手段および前記合焦位置調節手段により調節された操作用レーザ光とを合波する合波手段と、
前記合波手段により合波された観察用レーザ光および操作用レーザ光を集光して標本に照射する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
前記対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器と、
前記対物レンズまたは前記標本が載せられたステージを光軸方向に移動させるＺ軸駆動手段と、
前記対物レンズまたは前記ステージの移動量と前記合焦位置調節手段とを制御する制御手段と、
前記Ｚ軸駆動手段による前記対物レンズまたは前記ステージの移動にかかわらず、前記観察用レーザ光の合焦位置と操作用レーザ光の合焦位置とが一致するように、前記制御手段が前記合焦位置調節手段を制御する準備モードと、前記対物レンズまたは前記ステージの移動に伴う前記操作用レーザ光の合焦位置のずれ量を相殺するように、前記制御手段が前記合焦位置調節手段を制御する観察モードとを切り替えるモード切替手段と
を具備するレーザ走査型顕微鏡。
標本を観察するための観察用レーザ光と標本を操作するための操作用レーザ光とを合波し、合波後の光を対物レンズを介してステージ上に載せられた前記標本に照射し、前記標本内から前記観察光軸方向に発せられる蛍光を検出する顕微鏡観察方法であって、
前記標本に対する前記操作用レーザ光の照射を停止した状態で、前記対物レンズまたは前記ステージの移動にかかわらず、前記観察用レーザ光の合焦位置と前記操作用レーザ光の合焦位置とが一致するように前記操作用レーザ光の合焦位置を調節する準備モードを実施し、前記操作用レーザ光の合焦位置が所望の位置に達した場合に、前記標本に対する前記操作用レーザ光の照射を開始するとともに、前記対物レンズまたは前記ステージの移動に伴う前記操作用レーザ光の合焦位置のずれ量を相殺するように、前記操作用レーザ光の合焦位置を調節する観察モードに切り替える顕微鏡観察方法。
前記操作用レーザ光の合焦位置の調節を前記標本の蛍光検出に同期して行う請求項２に記載の顕微鏡観察方法。