JP2006106346A - 顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】 エバネッセント照明による蛍光画像と走査型レーザ顕微鏡照明による共焦点画像の位置関係を正確に一致させることができる顕微鏡システムを提供する。
【解決手段】 アルゴンレーザ２のレーザ光を走査ユニット１０と対物レンズ２４を介し試料２５上に２次元走査可能に集光させ、グリーンヘリウムネオンレーザ３のレーザ光により試料２５上にエバネッセント照明を発生させ、このエバネッセント照明により試料２５より発する蛍光を２次元走査しながら、共焦点ピンホール１８を介して光検出器２０ａ（２０ｂ）により検出し、エバネッセント照明による蛍光画像を取得する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、走査型レーザ顕微鏡による蛍光観察とエバネッセント照明による蛍光観察に対応可能な顕微鏡システムに関するものである。

最近、生体細胞の機能解析が盛んに行われるようになっているが、このような生体細胞の機能解析において、特に、厚みのある生物細胞のある部分に蛍光蛋白等の蛍光物質を局在化させ、その蛍光を観察することで３次元構造を解明するためのものとして走査型レーザ顕微鏡が用いられている。

特許文献１は、走査型レーザ顕微鏡を開示したもので、レーザ光源からのレーザ光を対物レンズで試料上に集光し、その集光点を光学的に２次元走査し、試料から発する光（特に蛍光）を再び対物レンズを通し、共焦点ピンホールを介して光検出器で検出し、２次元の情報を得るようにしている。つまり、このような走査型レーザ顕微鏡は、共焦点ピンホールを用いることで、焦点位置以外からの光をカットできるため、光軸方向の分解能があることが知られており、この特性を利用して細胞などの試料に蛍光物質を局在化させ、その蛍光を、試料と対物レンズの光軸方向の相対的な位置関係を変化させながら複数の２次元スライス画像を取得し、さらにこれらの２次元画像を３次元に構築し試料の３次元像を取得することで、試料の３次元構造を解明する研究などに使用されるようになっている。

一方、近年、生物学の研究においては、全反射を利用した照明（エバネッセント照明）が蛍光物質の励起方法に用いられることが多くなっている。そして、このようなエバネッセント照明を利用した蛍光顕微鏡として、特許文献２に開示されたものが知られている。ここでのエバネッセント照明は、試料全体に水銀灯などの励起光を照射する従来の同軸落射照明による蛍光顕微鏡観察に比べて、試料に対する照射範囲が試料の深さ方向に対して極めて浅いため、試料の表面付近の情報が高感度で得られるという特徴を有している。

このようにして、生物細胞の蛍光観察には、走査型レーザ顕微鏡とエバネッセント照明を利用した蛍光顕微鏡が用いられるが、最近になって、これら顕微鏡のそれぞれの機能を同時に備え、それぞれの観察法方で、同一の試料を観察する要求が増えている。例えばエバネッセント照明により発する蛍光により試料細胞の表面を観察し、走査型レーザ顕微鏡により試料細胞の内部を共焦点観察するような場合である。

このため、１台の顕微鏡で両方の観察方法を実現することが必要であり、従来、特許文献３に開示されたものがある。

ここでは、１台の顕微鏡に走査型レーザ顕微鏡観察のための照明光路及び検出光路と、エバネッセント照明による蛍光観察のための照明光路及び検出光路が、それぞれ別々に備えられている。
特開２００１−３５６２７２号公報 特開２００１−２７２６０６号公報 特開２００３−２７０５３８号公報 特開平１１-１０１９４２号公報 特開２００１-１６６２１３公報

ところで、最近になって、これら異なる観察方法で同一の試料を観察する場合、例えば、走査型レーザ顕微鏡観察による試料内部の共焦点蛍光画像とエバネッセント照明による試料の表面付近の蛍光画像を重ね合わせて表示したり、エバネッセント照明による蛍光画像で指定した位置に走査型レーザ顕微鏡観察用の照明光により試料上にスポット照明を行い光刺激を与えるようなことが行われている。

この場合、走査型レーザ顕微鏡照明による画像は、レーザ光を試料上にスポット照明し、ガルバノミラーなどの光走査手段でスポットを試料上で２次元に走査して共焦点蛍光画像を構築し、これに対して、エバネッセント照明による蛍光画像は、走査型レーザ顕微鏡の検出光路とは異なる検出光路に配置されたＣＣＤカメラなどの２次元撮像素子で撮像される。

このため、これら走査型レーザ顕微鏡照明による共焦点蛍光画像とエバネッセント照明による蛍光画像を重ね合わせようとすると、光走査手段の走査位置、走査振幅を、エバネッセント照明による蛍光観察の観察光路に配置されたＣＣＤなどの撮像素子の位置、倍率に画素単位で合わせなければならい。

しかしながら、このような調整を装置自身で行うには、それぞれ異なる画像取得経路の誤差を完全に無くす必要があり、極めて難しく現実的ではない。

そこで、これらの画像を取得した後、画像処理などの後処理により重ねる方法が考えられるが、この方法によっても、画像の位置関係だけでなく、走査歪みや光学系の焦点距離誤差に起因する倍率誤差、ＣＣＤカメラの水平、垂直方向取付け誤差や２次元走査ミラーであるガルバノミラーの回転軸方向の装置に対する角度誤差に起因する回転誤差なども考慮する必要があり、このため非常に手間がかかる作業となり、正確に両画像を重ね合わせるのは困難であった。

一方、エバネッセント照明により取得した射蛍光画像で指定した位置に走査型レーザ顕微鏡観察用の照明光により試料上にスポット照明を行い光刺激を与えるような場合も、エバネッセント照明による蛍光画像の観察光学系と光走査手段の走査位置の関係が合っていないことから、正確な位置に光刺激を与えることは困難であった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、エバネッセント照明による蛍光画像と走査型レーザ顕微鏡照明による共焦点画像の位置関係を一致させることができる顕微鏡システムを提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、レーザ光を発生する第１の光源と、前記第１の光源からのレーザ光を試料上に集光させる対物レンズと、前記第１の光源からのレーザ光を前記試料上で２次元走査する光走査手段と、前記試料上で２次元走査されるレーザ光により前記試料上より発する光を共焦点検出する共焦点検出手段と、前記試料にエバネッセント照明を行うための光を発生する第２の光源と、を具備し、前記第２の光源のレーザ光によるエバネッセント照明により前記試料より発する蛍光を前記光走査手段を走査しながら前記共焦点検出手段により検出し、前記エバネッセント照明による蛍光画像を取得するようにしたことを特徴としている。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記試料上で２次元走査される前記第１の光源のレーザ光により前記試料上より発する光を前記共焦点検出手段を介して検出することで取得される走査型レーザ顕微鏡画像と、前記第２の光源のレーザ光によるエバネッセント照明により前記試料より発する蛍光を前記共焦点検出手段を介して検出することで取得される蛍光画像とを重ねて表示可能としたことを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記試料上で２次元走査される前記第１の光源のレーザ光により取得される前記走査型レーザ顕微鏡画像の観察面と、前記エバネッセント照明により取得した蛍光画像の観察面が、前記試料内の光軸方向で異なっていることを特徴としている。

請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記試料上で２次元走査される前記第１の光源のレーザ光を用いた前記走査型レーザ顕微鏡画像の取得と前記第２の光源によるエバネッセント照明を用いた蛍光画像の取得を、前記第１および第２の光源からのレーザ光を順次切り替えることにより時分割で行うようにしたことを特徴としている。

請求項５記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載の発明において、前記第１および第２の光源は、それぞれ発生されるレーザ光の波長が異なることを特徴としている。

請求項６記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載の発明において、前記レーザ光源ユニットは、前記第１および第２の光源よりそれぞれ発生されるレーザ光の波長を同一にしたことを特徴としている。

請求項７記載の発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載の発明において、前記エバネッセント照明は、前記試料を挟んで前記対物レンズの対向側に配置されるコンデンサレンズを介して行なうことを特徴としている。

請求項８記載の発明は、請求項１乃至７のいずれかに記載の発明において、前記共焦点検出手段は、共焦点ピンホールと、該共焦点ピンホールを通過する光を検出する光検出器を有することを特徴としている。

請求項９記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記エバネッセント照明により取得した蛍光画像上で指定した位置又は領域に対し、前記第１の光源からのレーザ光を、前記２次元走査手段を介してスポット状に照射又は指定領域を２次元走査により照射することで試料に光刺激を与えるようにしたことを特徴としている。

請求項１０記載の発明は、請求項９記載の発明において、さらに前記エバネッセント照明により発生する蛍光を撮像する撮像手段を有し、前記光刺激後の前記エバネッセント照明による蛍光画像の経時変化を前記撮像手段により撮像可能としたことを特徴としている。

請求項１１記載の発明は、請求項１乃至８のいずれかに記載の発明において、さらに前記エバネッセント照明により発生する蛍光を撮像する撮像手段を備えたことを特徴としている。

本発明によれば、エバネッセント照明による蛍光画像と走査型レーザ顕微鏡照明による共焦点画像の位置関係を正確に一致させることができる顕微鏡システムを提供できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は本発明の第１の実施の形態が適用される顕微鏡システムの概略構成を示している。

この場合、本実施の形態では、走査型レーザ顕微鏡照明として光走査手段を介して試料にレーザ光を照射する第１のレーザ光源とエバネッセント照明を行なう第２のレーザ光源を有するレーザ光源ユニットを備え、このレーザ光源ユニットから２本のシングルモードファイバにより、顕微鏡の２つの異なる光路、具体的にはエバネッセント照明を行なうための落射投光管と、光走査手段および共焦点検出手段を備えた走査ユニットとにそれぞれレーザ光を供給する構成としている。

図において、１はレーザ光源ユニットで、このレーザ光源ユニット１は、４８８ｎｍのレーザ光を発振するアルゴンレーザ２と、５４３ｎｍのレーザ光を発振するグリーンヘリウムネオンレーザ３を有している。

グリーンヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４が配置されている。また、アルゴンレーザ２からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー５が配置されている。ダイクロイックミラー５は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、アルゴンレーザ２からのレーザ光を透過し、反射ミラー４で反射されるレーザ光を反射するようになっている。つまり、ここでのダイクロイックミラー５は、５４３ｎｍのレーザ光を反射し、４８８ｎｍのレーザ光を透過するような特性を有している。

ダイクロイックミラー５により合成されたレーザ光の光路上には、ビームスプリッタ７が配置されている。ビームスプリッタ７は、ダイクロイックミラー５により合成された光路を走査型レーザ顕微鏡照明用の光路６ａとエバネツセント照明用の光路６ｂの２つに分割するようにしている。ここでのビームスプリッタ７は、４８８ｎｍ、５４３ｎｍの両方の波長域で、走査型レーザ顕微鏡照明用の光路６ａに対して３０％反射し、エバネッセント照明用の光路６ｂに対して７０％透過するような特性を有している。

ビームスプリッタ７により分離された光路６ａ、６ｂ上には、波長選択用の音響光学素子(ＡＯＴＦ)８ａ、８ｂが各別に配置されている。

走査型レーザ顕微鏡照明用の光路６ａには、第１の光ファイバとしてのシングルモードファイバ９ａの入射端が配置され、シングルモードファイバ９ａを介して走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光を走査ユニット１０に導くようになっている。

一方、エバネッセント照明用の光路６ｂには、第２の光ファイバとしてのシングルモードファイバ９ｂの入射端が配置され、シングルモードファイバ９ｂを介してエバネッセント照明用のレーザ光を落射投光管１１に導くようになっている。

走査ユニット１０には、シングルモードファイバ９ａから出射されるレーザ光を導入するレーザ光導入ポート１０ａが設けられている。また、可視レーザ光導入ポート１０ａより出射されるレーザ光の光路上には、コリメートレンズ１２、励起ダイクロイックミラー１３が配置されている。

コリメートレンズ１２は、レーザ光導入ポート１０ａより出射されるレーザ光をコリメート光に変換するものである。励起ダイクロイックミラー１３は、レーザ光の波長(４８８ｎｍ、５４３ｎｍ)を反射し、後述する試料２５から発する蛍光の波長領域(５００〜５３０ｎｍ及び５６０〜６５０ｎｍ)を透過するような特性を有している。

励起ダイクロイックミラー１３の反射光路上には、集光位置制御手段としての波面変換素子１４と光走査手段としてのガルバノミラーユニット１５が配置されている。波面変換素子１４は、例えば、特許文献４や特許文献５に開示されるようにレーザ光の波面を変換可能にしたものである。つまり、素子自体に電圧を印加することで反射面を微小に変化させることのできるもので、この反射面を変化させ光学的なパワーを可変させることにより、後述するように試料２５内の光軸方向のビーム集光位置の移動を、対物レンズ２４と試料２５の機械的な位置関係を移動させることなく可能にしたものである。また、その際に生じる収差を相殺することも可能にしている。

波面変換素子１４の反射光路には、ガルバノミラーユニット１５が配置されている。ガルバノミラーユニット１５は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のガルバノミラー１５ａ、１５ｂを有し、これらのガルバノミラー１５ａ、１５ｂによりレーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

一方、上述した励起ダイクロイックミラー１３の透過光路上には、共焦点検出手段を構成する共焦点レンズ１６、反射ミラー１７、共焦点ピンホール１８が配置されている。共焦点ピンホール１８は、図示しない電動機構により開口径を可変可能な構成となっている。

共焦点ピンホール１８の透過光路上には、分光ダイクロイックミラー１９ａが配置されている。分光ダイクロイックミラー１９ａは、波長毎に光路を分岐するもので、ここでは、５００〜５４０ｎｍの波長を反射し、５６０〜７００ｎｍ以上の波長を透過させる特性を有したものが用いられている。

分光ダイクロイックミラー１９ａの反射光路上には、５００〜５３０ｎｍの波長域を透過し、その他の波長域を遮断するバリアフィルタ１９ｂと光検出器２０ｂが配置されている。また、分光ダイクロイックミラー１９ａの透過光路上には、５６０〜６５０ｎｍの波長域を透過し、その他の波長域を遮断するバリアフィルタ１９ｃと光検出器２０ｃが配置されている。

走査ユニット１０には、瞳投影レンズユニット２１を介して顕微鏡本体、ここでは倒立顕微鏡本体２２が接続されている。倒立顕微鏡本体２２は、テーブル５０上に形成した穴部５０ａに底面ポート２２ａを有しており、この底面ポート２２ａに瞳投影レンズユニット２１を介して走査ユニット１０が接続されるようになっている。そして、走査ユニット１０のガルバノミラーユニット１５より出射されるレーザ光の光路上には、瞳投影レンズユニット２１内の瞳投影レンズ２１ａ、倒立顕微鏡本体２２内の結像レンズ２３、対物レンズ２４が配置されている。

対物レンズ２４の先端レンズ２４ｂの集光位置には、蛍光標識された試料２５が配置されている。試料２５は、図２に示すようにステージ２６上に配置されたシャーレ２７に貼り付けられたカバーガラス２８に固定されている。この場合、シャーレ２７内には試料２５を保護するための液体、例えば水が満たされている。また、対物レンズ２４の先端レンズ２４ｂとカバーガラス２８の間には、エバネッセント照明を行うために全反射角度を大きくして高いＮＡでエバネッセント照明による蛍光観察を行なうとともに、走査型レーザ顕微鏡照明による蛍光観察を行なうためにイマージョンオイルＯＬが充填されている。

一方、上述した落射投光管１１には、シングルモードファイバ９ｂから出射されるレーザ光を導入するレーザ光導入ポート１１ａが設けられている。また、レーザ光導入ポート１１ａより出射されるレーザ光の光路上には、コリメートレンズ３１、集光レンズ３２が置されている。

コリメートレンズ３１は、レーザ光導入ポート１１ａより出射されるレーザ光をコリメート光に変換するものである。集光レンズ３２は、コリメートレンズ３１からのコリメート光を対物レンズ２４の瞳位置２４ａに集光するものである。

集光レンズ３２と対物レンズ２４の間（結像レンズ２３と対物レンズ２４との間）の光路には、エバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３aが配置されている。このエバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３ａは、シングルモードファイバ９ｂからのエバネッセント照明用レーザ光（本実施の形態ではアルゴンレーザ２の発振波長である４８８ｎｍ）を反射し、エバネッセント照明により試料２５より発する蛍光波長（本実施の形態では５００〜５３０ｎｍ）、走査ユニット１０からの走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光の波長（本実施の形態ではグリーンヘリウムネオンレーザの発振波長である５４３ｎｍ）および走査ユニット１０からの走査型レーザ顕微鏡照明用レーザ光により試料２５から発する蛍光波長（本実施の形態では５６０〜６５０ｎｍ）の波長域を透過する特性を有している。また、このエバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３ａは、走査型レーザ顕微鏡用の照明光路とエバネッセント照明用光路を同軸に導く光路合成の役割も果たしている。さらに、エバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３ａは、エバネッセント照明及び走査型レーザ顕微鏡照明で使用する励起波長、あるいは試料２５から発する蛍光波長に応じて複数用意され、これらはターレット３３内に装着され、図示しない電動切替機構により選択的に光路上に切り換え可能になっている。

なお、３４は制御ユニットで、この制御ユニット３４は、ターレット３３に対するエバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３ａの電動切り換え制御を始め、走査ユニット１０内のガルバノミラーユニット１５、波面変換素子１４、共焦点ピンホール１８の開口径、検出器２０ｂ、２０ｃの制御、さらにレーザ光源ユニット１内で走査型レーザ顕微鏡照明、エバネッセント照明の各照明用レーザ波長の選択を行なうＡＯＴＦ８ａ、８ｂの制御を行なうようにしている。

次に、このように構成した第１の実施の形態の作用を説明する。

この実施の形態では、アルゴンレーザ２から発振する４８８ｎｍのレーザ光でエバネッセント照明を行い、グリーンヘリウムネオンレーザ３から発振する５４３ｎｍのレーザ光で走査型レーザ顕微鏡照明を行ない、このうちのエバネッセント照明では試料２５の表面であるカバーガラス２８の界面を蛍光観察し、走査型レーザ顕微鏡照明では、試料２５内部の断面を共焦点蛍光観察するものとする。このため、レーザ光源ユニット１内のＡＯＴＦ８ａ、８ｂの制御により４８８、５４３ｎｍの各波長を、走査ユニット１０及び落射投光管１１に対し、時分割で順次供給し、走査型レーザ顕微鏡照明による共焦点蛍光観察とエバネッセント照明による蛍光観察を時分割で取得する（以下シーケンシャル画像取得と記す）ようにしている。

まず、ユーザーが図示しないコンピュータを操作してシーケンシャル画像取得による観察開始のコマンドを入力すると、最初に制御ユニット３４によりエバネッセント照明による蛍光観察を行なう設定にシステムが制御される。

この場合、アルゴンレーザ２により４８８ｎｍのレーザ光が発振すると、このレーザ光は、ＡＯＴＦ８ｂにより、波長選択され、エバネッセント照明用としてシングルモードファイバ９ｂにより落射投光管１１に導かれる。この時、走査ユニット１０にレーザ光が供給されないように、ＡＯＴＦ８ａは、４８８、５４３ｎｍの波長を共に遮断するように制御される。

落射投光管１１に導かれたエバネッセント照明用のレーザ光（４８８ｎｍ）は、コリメートレンズ３１によりコリメートされ、集光レンズ３２により対物レンズ２４の瞳位置２４ａの端に集光する。この時、カバーガラス２８の試料側界面２８ａに近接した試料領域に対物レンズ２４のピントが合わせられている。これにより、対物レンズ２４の部分を拡大した図２に示すように、対物レンズの瞳２４ａの端に集光したレーザ光２４ｃ（斜線部）は先端レンズ２４ｂにより平行光となり、所定の角度で斜め方向からカバーガラス２８の試料側界面２８ａを照射される。この角度はレーザ光２４ｃが、試料側界面２８ａで全反射を起こす角度に設定されており、全反射したレーザ光２４ｃは２４ｃ’方向に抜ける。この時、レーザ光のごく一部がカバーガラス２８の試料側界面２８ａから試料２５側へにじみ出す。この境界からにじみ出た光がエバネッセント光で、試料２５の深さ方向へにじみ出す量は光源の波長程度（５００ｎｍ程度）となる。

従って、このようなエバネッセント照明により試料２５より発する蛍光の範囲は、深さ方向に波長幅程度となり、検出される蛍光画像は、バックグラウンドの少なくＳ／Ｎの良い観察が可能となる。このところの詳しい説明は、例えば特許文献２に記載されている。

また、４８８ｎｍのエバネッセント照明により試料２５から発した蛍光２４ｄ（５００〜５３０ｎｍ）は、対物レンズ２４の中心を通り、エバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３ａを透過する。そして、瞳投影レンズ２１ａ、ガルバノミラーユニット１５、波面変換素子１４を介して励起ダイクロイックミラー１３を透過する。この時、ガルバノミラーユニット１５は、制御ユニット３４により走査型レーザ顕微鏡で２次元走査画像を取得する時と同様に２次元走査を行うように制御され、波面変換素子１４は、制御ユニット３４により光学的なパワーがまったくない状態（反射面が平面）に制御される。

さらに、励起ダイクロイックミラー１３を透過した蛍光２４ｄ（５００〜５３０ｎｍ）は、共焦点レンズ１６、反射ミラー１７、共焦点ピンホール１８を通過して、分光ダイクロイックミラー１９ａで反射され、バリアフィルタ１９ｂを介して光検出器２０ｂで検出される。この場合、共焦点ピンホール１８の径の大きさは、蛍光波長５００〜５３０ｎｍの中心波長である５１５ｎｍに合わせて設定されている。

光検出器２０ｂは、制御ユニット３４によりガルバノミラーユニット１５の走査に同期して各走査位置から発する蛍光を検出するように制御されており、エバネッセント照明による蛍光画像が取得される。

このようにした４８８ｎｍのエバネッセント照明による蛍光画像の取得が完了すると、次に、制御ユニット３４により５４３ｎｍを用いた走査型レーザ顕微鏡照明による共焦点蛍光観察を行うための設定にシステムが自動的に切換えられる。

この場合、ＡＯＴＦ８ｂを介して落射投光管１１に供給されていた４８８ｎｍの波長のレーザ光は遮断され、ＡＯＴＦ８ａによりグリーンヘリウムネオンレーザ３により発振した５４３ｎｍのレーザ光がシングルモードファイバ９ａにより走査ユニット１０に導かれる。

走査ユニット１０に導かれた５４３ｎｍのレーザ光はコリメートレンズ１２によりコリメートされ、励起ダイクロイックミラー１３により反射される。励起ダイクロイックミラー１３で反射されたレーザ光は、波面変換素子１４により反射され、ガルバノミラーユニット１５に入射する。そして、瞳投影レンズ２１ａ、結像レンズ２３を通り、エバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３ａを透過し、対物レンズ２４に入射し、試料２５の内部に結像する。この時、波面変換素子１４は、電圧をかけることにより光学的なパワーを持つように変形制御されており、反射光は平行光ではなくわずかに発散光となっている。この発散光は、図２に示すように対物レンズ２４に対して、平行光ではなく点線２４ｆのようにわずかに発散して入射する。そして、先端レンズ２４ｂにより集光され、試料２５の内部２５ｆに結像する。

このように試料２５に走査型レーザ顕微鏡照明のレーザ波長５４３ｎｍを照射すると、試料２５より蛍光（５６０〜６５０ｎｍ）が発生する。この蛍光は、上述の照明光の経路を逆方向に進み、走査ユニット１０内の波面変換素子１４を反射することで平行光に変換され、励起ダイクロイックミラー１３を透過する。そして、共焦点レンズ１６、反射ミラー１７を介して、共焦点ピンホール１８上に集光する。この時、共焦点ピンホール１８の径の大きさは蛍光波長５６０〜６５０ｎｍの中心波長である６０５ｎｍに合わせて設定される。共焦点ピンホール１８を透過した蛍光（５６０〜６５０ｎｍ）は分光ダイクロイックミラー１９ａ、バリアフィルタ１９ｃを透過し、光検出器２０ｃにより検出される。

このようにして４８８ｎｍのレーザ光を用いたエバネッセント照明による蛍光画像の取得と、５４３ｎｍのレーザ光を用いた走査型レーザ顕微鏡照明による共焦点蛍光画像のシーケンシャル画像取得が終了すると、次に、これらの２つの画像を図示しないモニターに重ねて表示する。この場合、それぞれ取得された２つの画像は共に走査ユニット１０内のガルバノミラーユニット１５、共焦点レンズ１６、共焦点ピンホール１８を介して検出しているので、２つの画像間の位置ずれ、倍率ズレ、回転ずれは、原理的にまったく生じることがなく、エバネッセント照明による蛍光画像と走査型レーザ顕微鏡による共焦点画像の位置関係を正確に一致させることができ、これにより、これら画像の正確な重ね合わせが可能となる。

また、従来技術のようにエバネッセント照明による蛍光画像を取得するための高感度のＣＣＤカメラや、ＣＣＤカメラヘの光学系が不要となるので安価なシステムとなる。また、エバネッセント照明を行う厚みが波長幅程度で、蛍光が発生する領域の厚みも同程度となるので、共焦点ピンホール１８を介して検出する蛍光画像の面内解像の向上も期待できる。また、波面変換素子１４により、走査型レーザ顕微鏡による共焦点蛍光画像観察の面をエバネッセント照明による蛍光観察面に対して切換えるとともに、エバネッセント照明によるレーザ波長と走査型レーザ顕微鏡照明によるレーザ波長をＡＯＴＦ８ａ、８ｂを用いて切換えることにより、２種類の観察方法の切換えを高速（数ｍｓｅｃ以下）で行うことができる。

上述した第１の実施の形態では、エバネッセント照明による蛍光観察時の共焦点ピンホール１８の径は蛍光波長５００〜５３０ｎｍに合わせて設定しているが、仮に、画像の明るさが暗い場合は、共焦点ピンホール１８の径を広げて、解像を犠牲にして明るさを稼いだ方が結果的に良い画像が得られる場合があるので、試料２５の状態に応じてエバネッセント照明による蛍光画像を取得する時の共焦点ピンホール径を適宜設定するようにしても良い。

また、上述した第１の実施の形態では、走査型レーザ顕微鏡照明の光軸方向の集光位置を可変する手段として波面変換素子１４を用いたが、２種類の観察の切換え時間を要求しない場合は、対物レンズ２４とステージ２６の機械的な位置関係を図示しないモータ及び伝達機構により動かしても良い。

さらに、上述した第１の実施の形態では、走査型レーザ顕微鏡照明による蛍光共焦点画像は、試料２５内部の１つのスライス断面についてのみ取得しているが、波面変換素子１４の光学的なパワーを徐々に変形させて複数のスライス断面を取得しても良い。この場合は例えば蛍光共焦点画像のエクステンド画像とエバネッセント照明による蛍光画像を正確に重ねることが可能となる。

さらに、上述した第１の実施の形態では、走査ユニット１０からの走査型レーザ顕微鏡照明のレーザ光とエバネッセント照明用のレーザを同一のレーザ光源ユニット１内の同一のレーザ光源を、ビームスプリッタ７により光路を分けて２本のファイバに導入し、それぞれの照明光路に導いているが、別々の光源を設けるようにしても良い。この場合は、ビームスプリッタによる光量減が生じない。

（変形例１）
上述した第１の実施の形態では、エバネッセント照明の波長と、走査型レーザ顕微鏡照明の波長が異なる場合について記載したが、本変形例１では、エバネッセント照明及び走査型レーザ顕微鏡照明として同一の４８８ｎｍの波長を使用する。この場合、ターレット３３を図示しない電動切換え機構により駆動してエバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３ａを光路に対し挿脱するようにする。また、エバネッセント照明による蛍光及び走査型レーザ顕微鏡照明による蛍光（共に波長域は５００〜５３０ｎｍ）は、共にバリアフィルタ１９ｂを介して光検出器２０ｂで検出するようにする。

このような構成において、ユーザーが図示しないコンピュータを操作してシーケンシャル画像取得による観察開始のコマンドを入力すると、まず、最初に制御ユニット３４によりエバネッセント照明による観察を行なう設定にシステムが制御される。この時、アルゴンレーザ２より発振した４８８ｎｍの波長であるレーザ光は、ＡＯＴＦ８ｂによりシングルモードファイバ９ｂに供給され、光路に挿入されたエバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３ａで反射し、試料２５の表面にエバネッセント照明する。そして、試料２５より発した蛍光はエバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３ａを透過して走査ユニット１０内に入り、ガルバノミラーユニット１５、共焦点ピンホール１８、５００〜５３０ｎｍの蛍光波長域を透過するバリアフィルタ１９ｂを介して、光検出器２０ｂで検出される。

４８８ｎｍのレーザ光を用いたエバネッセント照明による蛍光画像取得が完了すると、次に、４８８ｎｍのレーザ光を用いた走査型レーザ顕微鏡照明による観察を行うための設定に制御ユニット３４によりシステムが自動的に切換えられる。すると、ＡＯＴＦ８ｂにより落射投光管１１に供給されていた４８８ｎｍのレーザ光は遮断され、アルゴンレーザ２により発振したレーザ波長である４８８ｎｍのレーザ光がＡＯＴＦ８ａによりシングルモードファイバ９ａに供給され走査ユニット１０に導かれる。また、倒立顕微鏡内のエバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３ａは、ターレット３３を図示しない電動切換え機構により駆動することで光路からはずされる。また、波面変換素子１４は反射光がわずかに発散光になるように制御される。そして、走査ユニット１０を介して対物レンズ２４により試料２５の内部に光スポットを結ぶ。試料２５に光スポットとして照射された４８８ｎｍのレーザ光により試料２５から発した蛍光は、走査ユニット内の波面変換素子１４を反射することで平行光となり、ガルバノミラーユニット１５、共焦点ピンホール１８、５００〜５３０ｎｍの蛍光波長域を透過するバリアフィルタ１９ｂを介して、光検出器２０ｂで検出される。

以上のようにして取得された２つの画像は、共に走査ユニット１０内のガルバノミラーユニット１５、共焦点レンズ１６、共焦点ピンホール１８を介して検出しているので、画像問の位置ずれ、倍率ズレ、回転ずれは、原理的にまったく生じることがなく、エバネッセント照明による蛍光画像と走査型レーザ顕微鏡による共焦点蛍光画像の正確な重ねあわせが可能となる。

（変形例２）
本変形例２では、走査型レーザ顕微鏡照明を蛍光画像取得のためではなく、光刺激に利用するものである。この場合、第１の実施の形態と同様にガルバノミラーユニット１５を走査することにより取得した４８８ｎｍのレーザ光を用いたエバネッセント照明による蛍光画像を図示しないモニタ上に表示する。

次に、このモニタの画像上で光刺激を行なう位置又は領域を指定し、これら位置又は領域に対しガルバノミラーユニット１５を制御しながら走査型レーザ顕微鏡照明用レーザ光をスポット状に照射又は指定領域を２次元走査により照射することにより試料２５に光刺激を与える。

そして、この光刺激を与えた直後にエバネッセント照明による蛍光画像観察に切換え、ガルバノミラーユニット１５の走査により得られるエバネッセント照明による光刺激後の蛍光画像の経時変化を観察する。

このようにすれば、エバネッセント照明による蛍光画像上において、光刺激を行う位置又は領域を指定することにより、正確な位置又は領域にガルバノミラーユニット１５を用いた光刺激を行うことが可能となる。

（変形例３）
本変形例３では、正確な位置又は領域に光刺激を行うことができるとともに、さらに光刺激による試料２５の速い変化を観察可能にしたものである。

この場合、図１において、結像レンズ２３とエバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー３３ａとの間の光路には、分離ダイクロイックミラー５１が配置されている。この分離ダイクロイックミラー５１は、エバネッセント照明により発する試料２５からの蛍光波長（本変形例では５００〜５３０ｎｍ）を反射し、光刺激として使用する走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光の波長（本変形例では４８８ｎｍ）を透過するような特性を有している。

分離ダイクロイックミラー５１は、図示しない電動移動機構により光路上から退避可能となっている。

分離ダイクロイックミラー５１の反射光路には、結像レンズ５２、フィルタ手段としてのバリアフィルタ５３および撮像手段としてのＣＣＤカメラ５４が配置されている。結像レンズ５２は、分離ダイクロイックミラー５１で反射するエバネッセント照明により発する試料２５からの蛍光をＣＣＤカメラ５４の撮像面に結像させるものである。バリアフィルタ５３は、エバネッセント照明および走査型レーザ顕微鏡照明のそれぞれの波長（本変形例では、ともに４８８ｎｍ）をカットし、エバネッセント照明により試料２５より発する蛍光の波長域（本変形例では５００〜５３０ｎｍ）を透過するような特性を有している。ＣＣＤカメラ５４は、撮像面に結像された蛍光を撮像するものである。

このような構成において、まず、分離ダイクロイックミラー５１を光路から退避させる。

次に、変形例２と同様にして４８８ｎｍのレーザ光を用いたエバネッセント照明による蛍光画像を図示しないモニタ上に表示する。そして、このモニタの画像上で光刺激を行なう位置又は領域を指定する。

次に、分離ダイクロイックミラー５１を光路に挿入する。そして、モニタの画像上で指定した位置又は領域に対しガルバノミラーユニット１５を制御しながら走査型レーザ顕微鏡照明用レーザ光をスポット状に照射又は指定領域を２次元走査により照射して光刺激を与える。同時に、４８８ｎｍのエバネッセント照明により試料２５より発する蛍光を分離ダイクロイックミラー５１で反射し、バリアフィルタ５３を介してＣＣＤカメラ５４で撮像することで、エバネッセント照明による光刺激後の蛍光画像の経時変化が観察される。

なお、分離ダイクロイックミラー５１の平行度精度が１０’’と高く、且つ平行光束中での挿脱なので、分離ダイクロイックミラー５１の有無によるガルバノミラーユニット１５の走査位置の違いは無視できる。

このようにすれば、ガルバノミラーユニット１５を用いて光刺激を行う位置又は領域をエバネッセント照明による蛍光画像上において正確に指定することが可能となり、さらに、光刺激後のエバネッセント照明による蛍光画像の経時変化をＣＣＤカメラ５４で撮像することができるので、光刺激による試料２５の速い変化にも対応することができる。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

図３は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。

第１の実施の形態では倒立顕微鏡を用いて、エバネッセント照明は落射投光管経由で対物レンズを介して行っていたが、第２の実施の形態では、正立顕微鏡を用いて、エバネッセント照明は試料を挟んで対物レンズの対向側にあるコンデンサユニット経由で行っている点が異なるところである。

図において、４１は正立顕微鏡用のステージで、このステージ４１の上方には、対物レンズ２４が配置されている。この対物レンズ２４はカバーガラスを介さずに水を満たして使用する水浸対物レンズが用いられる。対物レンズ２４の上側の顕微鏡光路４３には、走査ユニット１０が接続され、この走査ユニット１０には、レーザ光源ユニット１に接続されたシングルモードファイバ９ａの出射端が接続されている。

ステージ４１上には、シャーレ２７が配置されている。そして、シャーレ２７に貼り付けられたカバーガラス２８には、試料２５が固定されている。この場合、シャーレ２７内には試料２５を保護するための液体、例えば水が満たされている。

対物レンズ２４と光軸上で対向する位置には、コンデンサレンズ４２ｄが配置されている。コンデンサレンズ４２ｄは、エバネッセント照明用のコンデンサユニット４２内に設けられている。コンデンサユニット４２は、コンデンサレンズ４２ｄの他に、コリメートレンズ４２ａ、集光レンズ４２ｂ、ミラー４２ｃが配置されており、コンデンサレンズ４２ｄとカバーガラス２８の間は、高屈折率のイマージョンオイルで満たされている。

コンデンサユニット４２には、レーザ光源ユニット１に接続されたシングルモードファイバ９ｂの出射端が接続されている。

その他は、図１と同様である。

次に、このように構成した第３の実施の形態の作用について説明する。

まず、エバネッセント照明による蛍光画像を取得する場合は、レーザ光源ユニット１から発するレーザ光をシングルモードファイバ９ｂによりコンデンサユニット４２に導く。コンデンサユニット４２に導入されたレーザ光は、コリメートレンズ４２ａによりコリメートされ、集光レンズ４２ｂよりミラー４２ｃを介してコンデンサレンズ４２ｄの後側焦点位置である開口絞り４２ｅの端に集光する。開口絞り４２ｅの端に集光したレーザ光は、コンデンサレンズ４２ｄにより平行のレーザ光４２ｆとなり、所定の角度で斜め方向から試料２５が固定されたカバーガラス２８の試料側界面２８ａを照射する。この角度はレーザ光４２ｆが試料側界面２８ａで全反射を起こす角度に設定されており、全反射したレーザ光４２ｆは４２ｆ’に抜ける。この時、レーザ光のごく一部がカバーガラス２８から試料２５側へにじみだす。この試料側界面２８ａからにじみ出た光がエバネッセント光で試料２５の深さ方向へにじみ出す量は照射光の波長程度となる。そして、このエバネッセント照明により生ずる蛍光を対物レンズ２４、走査ユニット１０内のガルバノミラーユニット１５、共焦点ピンホール１８を介して、光検出器２０ｂで検出する。

この場合、ガルバノミラーユニット１５は、制御ユニット３４により走査型レーザ顕微鏡で２次元走査画像を取得する時と同様に２次元走査を行うように制御され、また、光検出器２０ｂも、ガルバノミラーユニット１５の走査に同期して、制御ユニット３４により各走査位置から発する蛍光を検出するように制御される。これにより、エバネッセント照明による蛍光画像が取得される。

また、走査型レーザ顕微鏡照明による共焦点蛍光画像を取得する時は、レーザ光源ユニット１から発するレーザ光をシングルモードファイバ９ａにより走査ユニット１０に導く。そして、波面変換素子１４では、第１の実施形態とは異なる方向に光学的なパワーを持つように制御されており、その反射光はわずかに収束光となる。そして、ガルバノミラーユニット１５を介して、図中の点線２４ｇのようにわずかに収束光で対物レンズ２４に入射し、試料２５の内部に光スポットを結ぶ。この光スポットにより試料２５から発する蛍光は、対物レンズ２４、ガルバノミラーユニット１５を介し、波面変換素子１４で平行光に変換され、共焦点ピンホール１８を介して光検出器２０ｃで検出される。

このようにしてエバネッセント照明による蛍光画像と走査型レーザ顕微鏡照明による共焦点蛍光画像は、シーケンシャル画像取得により時分割で取得される。そして、これら２つの画像は、図示しないモニタに重ねて表示される。

この場合も、第１の実施の形態で述べたと同様に、２つの画像は共に走査ユニット１０内のガルバノミラーユニット１５、共焦点レンズ１６、共焦点ピンホール１８を介して検出しているので、画像間の位置ずれ、倍率ズレ、回転ずれは、原理的にまったく生じることがなく、エバネッセント照明による蛍光画像と走査型レーザ顕微鏡による共焦点画像の正確な重ねあわせが可能となる。また、従来技術のようにエバネッセント照明による蛍光画像を取得するための高感度のＣＣＤカメラや、ＣＣＤカメラヘの光学系が不要となるので安価なシステムとなる。

また、第２の実施の形態では、エバネッセント照明を対物レンズ側から行うのではなく、コンデンサレンズ側から行っているので、対物レンズの制約（エバネッセント照明を発生させるための高ＮＡ、油浸対物）がなくなり観察の自由度が広がることになる。

さらに、第２の実施の形態では、エバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー（第１の実施の形態の符号３３ａ）が、走査型レーザ顕微鏡の照明光路及び観察光路、エバネッセント照明による蛍光観察の光路に存在しなくなるので明るい観察が可能となる。

さらに、第１の実施形態の変形例１に示したような、エバネッセント照明に用いる波長と走査型レーザ顕微鏡照明に用いる波長が同一でも、エバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー（第１の実施の形態の符号３３ａ）を挿脱する必要がなく、切換えを短時間で行うことが可能である。また、変形例２においては、エバネッセント照明の波長と光刺激の波長が４８８ｎｍと同一の場合は、エバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー（第１の実施の形態の符号３３ａ）の４８８ｎｍの特性を、反射５０％、透過５０％のようにするか、あるいは、走査型レーザ顕微鏡照明による光刺激を行う時にエバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー（第１の実施の形態の符号３３ａ）を図示しない電動切換え機構により光路から外す必要がある。このことは、反射５０％、透過５０％のダイクロイックミラーを用いると、切換え時間は早くなるが、レーザパワーは、ロスしていた。また、電動切換え機構により光路よりダイクロイックミラーを外すようにすると、光刺激観察に移るときに時間を要し、刺激後の早い反応を観察するときに制約が生じていた。いずれにしても、レーザパワー又は切換え時間のどちらかに制約が生じていた。しかし、第２の実施の形態ではエバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー（第１の実施の形態の符号３３ａ）が存在しないので、上記制約が一切生じない。このことは、生細胞等の試料に強い光刺激を与えて蛍光を退色させ、その後の蛋白質の拡散による蛍光の退色過程を観察するＦＲＡＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ａｆｔｅｒ Ｐｈｏｔｏ−ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）等、光刺激の時に用いる波長と蛍光観察の時に用いる波長が同一のアプリケーションに特に有効となる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施の形態が適用される顕微鏡システムの概略構成を示す図。 第１の実施の形態の要部を拡大した概略構成を示す図。 本発明の第２の実施の形態が適用される顕微鏡システムの概略構成を示す図。

符号の説明

１…レーザ光源ユニット、２…アルゴンレーザ
３…グリーンヘリウムネオンレーザ、４…反射ミラー
５…ダイクロイックミラー、６ａ．６ｂ…光路
７…ビームスプリッタ、８ａ．８ｂ…ＡＯＴＦ
９ａ、９ｂ…シングルモードファイバ、１０…走査ユニット
１０ａ…可視レーザ光導入ポート、１１…落射投光管
１１ａ…レーザ光導入ポート、１２…コリメートレンズ
１３…励起ダイクロイックミラー、１４…波面変換素子
１５…ガルバノミラーユニット、１５ａ．１５ｂ…ガルバノミラー
１６…共焦点レンズ、１７…反射ミラー
１８…共焦点ピンホール、１９ａ…分光ダイクロイックミラー
１９ｂ、１９ｃ…バリアフィルタ、２０ｂ．２０ｃ…検出器
２１…瞳投影レンズユニット、２１ａ…瞳投影レンズ
２２…倒立顕微鏡本体、２２ａ…底面ポート
２３…結像レンズ、２４…対物レンズ、２４ａ…瞳位置
２４ｂ…先端レンズ、２４ｃ…レーザ光、２４ｄ…蛍光
２４ｆ、２４ｇ…点線、２５…試料、２５ｆ…内部、
２６…ステージ、２７…シャーレ、２８…カバーガラス
２８ａ…試料側界面、ＯＬ…イマージョンオイル
３１…コリメートレンズ、３２…集光レンズ
３３ａ…エバネッセント照明用励起ダイクロイックミラー
３３…ターレット、３４…制御ユニット
４１…ステージ、４２…コンデンサユニット
４２ａ…コリメートレンズ、４２ｂ…集光レンズ
４２ｃ…ミラー、４２ｄ…コンデンサレンズ
４２ｅ…開口絞り、４２ｆ…レーザ光、４３…顕微鏡光路
５０…テーブル、５０ａ…穴部、５１…分離ダイクロイックミラー
５２…結像レンズ、５３…バリアフィルタ
５４…ＣＣＤカメラ

Claims (11)

1. レーザ光を発生する第１の光源と、
   前記第１の光源からのレーザ光を試料上に集光させる対物レンズと、
   前記第１の光源からのレーザ光を前記試料上で２次元走査する光走査手段と、
   前記試料上で２次元走査されるレーザ光により前記試料上より発する光を共焦点検出する共焦点検出手段と、
   前記試料にエバネッセント照明を行うための光を発生する第２の光源と、を具備し、
   前記第２の光源のレーザ光によるエバネッセント照明により前記試料より発する蛍光を前記光走査手段を走査しながら前記共焦点検出手段により検出し、前記エバネッセント照明による蛍光画像を取得するようにしたことを特徴とする顕微鏡システム。
2. 前記試料上で２次元走査される前記第１の光源のレーザ光により前記試料上より発する光を前記共焦点検出手段を介して検出することで取得される走査型レーザ顕微鏡画像と、前記第２の光源のレーザ光によるエバネッセント照明により前記試料より発する蛍光を前記共焦点検出手段を介して検出することで取得される蛍光画像とを重ねて表示可能としたことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡システム。
3. 前記試料上で２次元走査される前記第１の光源のレーザ光により取得される前記走査型レーザ顕微鏡画像の観察面と、前記エバネッセント照明により取得した蛍光画像の観察面が、前記試料内の光軸方向で異なっていることを特徴とする請求項２記載の顕微饒システム。
4. 前記試料上で２次元走査される前記第１の光源のレーザ光を用いた前記走査型レーザ顕微鏡画像の取得と前記第２の光源によるエバネッセント照明を用いた蛍光画像の取得を、前記第１および第２の光源からのレーザ光を順次切り替えることにより時分割で行うようにしたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の顕微鏡システム
5. 前記第１および第２の光源は、それぞれ発生されるレーザ光の波長が異なることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
6. 前記レーザ光源ユニットは、前記第１および第２の光源よりそれぞれ発生されるレーザ光の波長を同一にしたことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
7. 前記エバネッセント照明は、前記試料を挟んで前記対物レンズの対向側に配置されるコンデンサレンズを介して行なうことを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の顕微鏡システム。
8. 前記共焦点検出手段は、共焦点ピンホールと、該共焦点ピンホールを通過する光を検出する光検出器を有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の顕微鏡システム。
9. 前記エバネッセント照明により取得した蛍光画像上で指定した位置又は領域に対し、前記第１の光源からのレーザ光を、前記２次元走査手段を介してスポット状に照射又は指定領域を２次元走査により照射することで試料に光刺激を与えるようにしたことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡システム。
10. さらに前記エバネッセント照明により発生する蛍光を撮像する撮像手段を有し、前記光刺激後の前記エバネッセント照明による蛍光画像の経時変化を前記撮像手段により撮像可能としたことを特徴とする請求項９記載の顕微鏡システム。
11. さらに前記エバネッセント照明により発生する蛍光を撮像する撮像手段を備えたことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の顕微鏡システム。

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