JP2016090767A - 顕微鏡および顕微鏡画像取得方法 - Google Patents

Abstract

【課題】焦点深度を大きく確保できない場合にも、広範囲にわたる標本の鮮明な画像を取得する。
【解決手段】標本Ｓから発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系７と、該検出光学系７の光軸に交差する方向に沿って平面状の励起光を入射させるシート照明光学系３と、検出光学系７により取得された画像を処理する画像処理部２０とを備え、シート照明光学系３が、励起光の焦点位置をその入射方向に沿って移動させ、画像処理部２０が、シート照明光学系３により異なる焦点位置に励起光が入射される都度に検出光学系７により取得された複数の蛍光画像を合成して合成画像を生成する顕微鏡１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡および顕微鏡画像取得方法に関するものである。

従来、標本からの蛍光を検出する検出光学系の光軸に対して直交する平面に沿って励起光を標本に入射させるシート照明方式の顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。落射照明方式あるいは透過照明方式においては、共焦点光学系により１点または複数点に集光させた励起光を２次元的に走査することにより、光軸方向のボケ像の少ない２次元的な画像を取得するが、シート照明方式によれば、一度に広い範囲に照明でき、検出光学系の光軸方向には照明光の焦点があった部分のみが照明されるために、画像の取得に要する時間を短縮することができる。

特許第５２５９９１６号公報

しかしながら、特許文献１のシート照明方式の顕微鏡は、励起光を集光して擬似的に平面状に形成するため、焦点位置から離れるに従って、鮮明な画像取得が困難になる。すなわち、シート照明の焦点深度を大きく確保できない場合には、広範囲にわたる標本の鮮明な画像を得ることができないという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、焦点深度を大きく確保できない場合であっても、広範囲にわたる標本の鮮明な画像を取得することができる顕微鏡および顕微鏡画像取得方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、該検出光学系の光軸に交差する方向に沿って平面状の励起光を入射させるシート照明光学系と、前記検出光学系により取得された画像を処理する画像処理部とを備え、前記シート照明光学系が、前記励起光の焦点位置をその入射方向に沿って移動させ、前記画像処理部が、前記シート照明光学系により異なる焦点位置に前記励起光が入射される都度に前記検出光学系により取得された複数の前記蛍光画像を合成して合成画像を生成する顕微鏡を提供する。

本態様によれば、シート照明光学系によって標本に平面状の励起光が入射されると、入射された平面に沿って標本内の蛍光物質が励起され蛍光が発生する。発生した蛍光はシート照明光学系と交差する光軸を有する検出光学系によって検出される。励起光の入射位置を検出光学系の焦点面に一致させておけば、この焦点面より手前側に配置されている標本からは蛍光が発生しないので、焦点面からの蛍光のみを検出できて鮮明な画像を取得することができる。

この場合において、シート照明光学系によって生成される励起光は、その焦点位置近傍の焦点深度の範囲内においては薄い平面状に形成されているが、焦点位置から離れるに従って厚さが大きくなって平面状の形態を有しなくなる。したがって、観察したい範囲が焦点深度の範囲を超える場合には、取得される蛍光画像は鮮明度が低下する。本態様によれば、励起光の焦点位置を入射方向に沿って移動し、励起光の焦点深度の範囲を検出光学系の焦点面に沿って移動させながら、各位置で蛍光画像を取得することにより、異なる位置で焦点面からの蛍光のみを検出した鮮明な蛍光画像を取得することができる。

そして、このようにして取得された複数の蛍光画像を合成することにより、より広い範囲において高い鮮明度を有する合成画像を生成することができる。
すなわち、励起光自体の焦点深度を大きく確保できない場合であっても、鮮明な範囲の異なる複数の蛍光画像を合成することにより、広範囲にわたる標本の鮮明な合成画像を取得することができる。

上記態様においては、前記シート照明光学系が、前記励起光の焦点位置の移動開始位置、移動ステップ数および各移動ステップの移動量を設定可能であってもよい。
このようにすることで、設定された移動開始位置に励起光の焦点位置を移動し、設定された移動ステップ数だけ、設定された移動量の移動を繰り返しながら蛍光画像を取得することにより、所望の範囲の鮮明な蛍光画像を取得することができる。

また、上記態様においては、前記シート照明光学系が、励起光の波長を切り替え可能であり、前記移動開始位置および前記移動量を、使用する励起光の波長ごとに設定可能であってもよい。
このようにすることで、励起光の波長を切り替えて異なる蛍光観察を行う場合に、励起光の波長の切り替えによって焦点位置が変動しても、波長ごとに設定された移動開始位置および移動量を使用して、所望の範囲の鮮明な合成画像を取得することができる。

また、上記態様においては、前記シート照明光学系が、前記標本の外部の異なる２以上の方向から前記励起光を択一的に入射可能であってもよい。
このようにすることで、標本が散乱物質からなり励起光の進達度が低い場合においても標本に対し異なる方向から励起光を入射させることで、標本の深部まで励起光を進達させることができ、広範囲にわたる標本の鮮明な合成画像を取得することができる。

また、上記態様においては、前記シート照明光学系が、前記検出光学系の光軸を挟んで両側から、前記励起光を入射可能であってもよい。
このようにすることで、励起光は標本の半分の深さまで進達させれば済み、２方向からの励起光の入射によって、より効率的に、広範囲にわたる標本の鮮明な合成画像を取得することができる。

また、本発明の他の態様は、一方向に沿って延びる平面状の励起光を標本に入射させる照射ステップと、前記励起光の焦点位置をその入射方向に沿って移動させる移動ステップと、該移動ステップにより前記励起光の焦点位置が移動させられる都度に標本から発せられた蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出ステップと、該検出ステップにおいて取得された複数の蛍光画像を合成して合成画像を生成する合成ステップとを含む顕微鏡画像取得方法を提供する。

本発明によれば、焦点深度を大きく確保できない場合であっても、広範囲にわたる標本の鮮明な画像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡を示す全体構成図である。 図１の顕微鏡の光源装置を示す（ａ）側面図、（ｂ）平面図である。 （ａ）〜（ｄ）図２の光源装置による励起光の焦点位置を順次移動した際の標本に対する焦点深度の範囲をそれぞれ示す図である。 本発明の一実施形態に係る顕微鏡画像取得方法のフローチャートを示す図である。 図３（ａ）〜（ｄ）の焦点位置に置いて取得された蛍光画像を合成した合成画像を示す図である。 図２の光源装置の変形例であって、（ａ）標本に対して一方向から励起光を入射させた場合、（ｂ）標本に対して他方向から励起光を入射させた場合をそれぞれ示す側面図である。 （ａ）〜（ｈ）図６の光源装置による励起光の焦点位置を順次移動した際の標本に対する焦点深度の範囲、（ｉ）〜（ｋ）取得された複数の蛍光画像を合成した合成画像をそれぞれ示す図である。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、顕微鏡本体２と、該顕微鏡本体２に接続される光源装置（シート照明光学系）３と、該光源装置３および顕微鏡本体２を制御する制御部４とを備えている。制御部４にはモニタ５が接続され、顕微鏡本体２により取得された画像を表示するようになっている。

顕微鏡本体２は、標本Ｓを搭載するステージ６と、該ステージ６に搭載された標本Ｓから発せられる蛍光を検出する検出光学系７とを備えている。検出光学系７は、該ステージ６に搭載された標本Ｓの鉛直上方に対向して配置される対物レンズ８と、該対物レンズ８により集光された標本Ｓからの蛍光を結像させる結像レンズ９と、該結像レンズ９により結像された蛍光を撮影する撮像素子１０とを備えている。図中、符号１１は、蛍光に含まれる励起光を除去するバリアフィルタを備えるフィルタホイールである。

光源装置３は、図２（ａ），（ｂ）に示されるように、略平行光からなる励起光Ｌを射出する励起光源１２と、該励起光源１２からの略平行光からなる励起光Ｌをライン状に集光させるシリンドリカルレンズ（励起光形成光学系）１３と、該シリンドリカルレンズ１３をその入射光軸Ｐに沿って移動させる移動機構１４とを備えている。図中、符号Ａは検出光学系７の視野範囲である。
シリンドリカルレンズ１３は、光軸Ｐに直交する一方向にパワーを有し、略平行光からなる励起光Ｌをその光束径寸法と同じ所定の幅寸法を有するライン状に集光するようになっている。

シリンドリカルレンズ１３により集光される励起光Ｌの光軸Ｐは、検出光学系７の光軸に直交する方向に沿って延びるように配置されている。これにより、シリンドリカルレンズ１３により集光される励起光Ｌの開口数に応じた焦点深度の２倍の範囲内において、検出光学系７の焦点面に沿って略平面状の励起光（シート照明）Ｌが標本Ｓに照射され、焦点面の広い範囲にわたって一度に蛍光を発生させることができるようになっている。

移動機構１４は、図２（ａ）に示す例では、シリンドリカルレンズ１３を支持するスライダ１５と、該スライダ１５を励起光Ｌの入射光軸Ｐ方向に沿って移動可能に案内する直線ガイド１６と、スライダ１５を直線ガイド１６に沿って直線的に駆動する図示しないモータとを備えている。
制御部４は、モータを制御して、シリンドリカルレンズ１３の位置を移動させるようになっている。

具体的には、制御部４には入力部１７が接続されており、シリンドリカルレンズ１３の移動開始位置、移動ステップ数および各移動ステップの移動量を設定することができるようになっている。制御部４は、図１に示されるように、入力部１７から入力された移動開始位置等の情報に基づいて光源装置３を制御する光源制御部１８を備えている。

入力部１７から入力される各移動ステップの移動量としては、例えば、焦点深度Ｚの２倍の移動量２Ｚを設定するようになっている。
Ｚ＝λ／ＮＡ^２
ここで、λは励起光Ｌの波長、ＮＡは開口数である。

そして、光源制御部１８は、図３（ａ）に示されるように、設定された移動開始位置にシリンドリカルレンズ１３を移動させた後、図３（ｂ）〜（ｄ）に示されるように、設定された移動量２Ｚのシリンドリカルレンズ１３の移動を、設定された移動ステップ数（図３の場合には３回。）だけ繰り返しながら検出光学系７による検出を行わせるようになっている。

また、制御部４は図示しない操作部からの入力によってステージ６を作動させて標本Ｓを移動させ、対物レンズ８や結像レンズ９を交換あるいは倍率調節し、フィルタホイール１１を作動させてフィルタを交換する等の顕微鏡本体２の制御を行う顕微鏡制御部１９を備えている。
また、制御部４は、撮像素子１０により取得された画像信号を処理してモニタ５に表示する画像を生成する画像処理部２０を備えている。

画像処理部２０は、図５に示されるように、光源装置３によって、各移動ステップにおいて、入射光軸Ｐ方向に焦点位置を異ならせた励起光Ｌを入射させたときに検出光学系７により取得された蛍光画像を合成して合成画像を生成するようになっている。
具体的には、画像処理部２０は、取得された複数の蛍光画像を合成する際に、各蛍光画像において対応する画素の輝度値あるいはコントラスト値を比較し、最大輝度値あるいは最大コントラスト値を有する画素を選択するようになっている。

また、制御部４は、コンピュータにより構成され、画像処理部２０、顕微鏡制御部１９および光源制御部１８の動作（例えば、画像の生成、入力部１７や操作部からの指示入力の処理、各種電動部（例えば、ステージ６、レンズ切替器またはズーム機構、フィルタホイール１１、移動機構１４など）やモニタ５の表示の制御、各種パラメータの記憶など）がこのコンピュータの演算処理装置とメモリにより実行される。
また、顕微鏡制御部１９および光源制御部１８は、コンピュータからの制御信号に基づいて各種電動部を駆動する制御基板を備えている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡１を用いた顕微鏡画像取得方法について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法は、図４に示されるように、まず、カウンタｋが初期化され（ステップＳ１）、制御部４が、入力部１７により設定された移動開始位置にシリンドリカルレンズ１３を移動させるようにモータを駆動してスライダ１５を移動させる（ステップＳ２）。

次いで、制御部４が光源装置３から励起光Ｌを照射させる。励起光Ｌはシリンドリカルレンズ１３によって集光され、図３（ａ）に示されるように、標本Ｓの所定位置においてライン状の焦点を結ぶ（ステップＳ３）。この状態で制御部４が検出光学系７を作動させ、対物レンズ８および結像レンズ９を介して集光された標本Ｓからの蛍光を撮像素子１０により撮影することにより蛍光画像を取得する（ステップＳ４）。

次に、制御部４が、入力部１７により設定された移動量に従ってモータを駆動してシリンドリカルレンズ１３を移動させる（ステップＳ５）。これにより、シリンドリカルレンズ１３の焦点位置が移動量分だけ移動する。この後に、カウンタｋがインクリメントされ（ステップＳ６）、カウンタｋが設定された移動ステップ数Ｎではない場合には、ステップＳ３〜Ｓ５を、入力部１７により設定された移動ステップ数Ｎだけ繰り返すことにより、励起光Ｌの焦点位置を異ならせた複数の蛍光画像が取得される（ステップＳ７）。

そして、カウンタｋが設定された移動ステップ数Ｎとなった場合には、取得された複数の帯状の蛍光画像を合成することにより、１枚の合成画像が生成される（ステップＳ８）。
取得された蛍光画像は、焦点位置を中心とした焦点深度の２倍の範囲に相当する帯状の領域（図３にハッチングで示す領域Ｂ１〜Ｂ４。）においてコントラストが高く、他の領域においてはコントラストが低くなっている。したがって、ステップＳ８においては、例えば、取得された蛍光画像の対応する画素のコントラスト値を比較し、コントラスト値が最大となる画素の輝度値を選択することにより、図５に示されるように、視野範囲の全体にわたって焦点の合った鮮明な合成画像を得ることができる。

すなわち、本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法によれば、シート照明の焦点深度を大きく確保できない場合であっても、広範囲にわたる標本Ｓの鮮明な画像を簡易に取得することができるという利点がある。
なお、本実施形態においては、画像処理部２０による合成画像の生成が、対応する画素のコントラスト値が最大となる輝度値の選択により行われることとしたが、対応する画素の輝度値が最大となる輝度値の選択により行うことにしてもよい。

また、本実施形態においては、単一のシリンドリカルレンズ１３の移動により励起光Ｌの焦点位置を移動させることとしたが、これに代えて、図６（ａ），（ｂ）に示されるように、２つのシリンドリカルレンズ１３ａ，１３ｂを移動させることにしてもよい。
すなわち、２つのシリンドリカルレンズ１３ａ，１３ｂを移動可能に支持する直線ガイド１６ａ，１６ｂを標本Ｓを挟んで両側に平行に配置することにしてもよい。図中、符号２１は、励起光Ｌを分岐するハーフミラー、符号２２は分岐光路を形成するミラーである。また、符号２３は択一的に開閉されるシャッタである。

このように構成することで、各シリンドリカルレンズ１３ａ，１３ｂの移動による励起光Ｌの焦点位置の移動を標本Ｓの中央から半分ずつに設定することができる。すなわち、標本Ｓが散乱物質により構成されている場合には、標本Ｓへの励起光Ｌの入射深さが深くなるほど散乱されて、励起光Ｌが平面状の形態が乱れされてしまう。

この態様によれば、標本Ｓへの励起光Ｌの入射深さを標本Ｓの半分までに抑えることができ、散乱による励起光Ｌの乱れを抑制して鮮明な蛍光画像を取得することができる。
具体的には、図６（ａ）に示されるようにシャッタ２３を開閉して、標本Ｓに対して左側から励起光Ｌを入射させる光路に設定して蛍光画像の取得を行った後、図６（ｂ）に示されるようにシャッタ２３を開閉して、標本Ｓに対して右側から励起光Ｌを入射させる光路に切り替えて蛍光画像の取得を行うことを繰り返す。

これにより、図７（ａ）〜（ｈ）の順に、それぞれの光路を経由した励起光Ｌの焦点深度の範囲が標本Ｓの中央から両側までの半分の領域を網羅するようにシリンドリカルレンズ１３ａ，１３ｂを段階的に移動させつつ撮影する。これにより、図７（ｉ）、（ｊ）に示されるように、各光路を経由した励起光Ｌにより標本Ｓの半分を含む鮮明な蛍光画像が取得でき、取得された全ての蛍光画像を合成することにより、図７（ｋ）に示されるように、標本Ｓ全体の鮮明な合成画像を取得することができる。

この場合に、図７（ａ）に示されるように、標本Ｓの左側からの励起光Ｌの照射により最初の蛍光画像を取得するときには、図７（ｂ）に示されるように、標本Ｓの右側から励起光Ｌを照射する最初の位置にシリンドリカルレンズ１３ｂを移動し、図７（ｂ）のように、標本Ｓの右側から励起光Ｌを照射して蛍光画像を取得するときには、図７（ｃ）のように、標本Ｓの左側から励起光Ｌを照射する次の位置にシリンドリカルレンズ１３ａを移動しておいてもよい。そして、これを交互に繰り返すことにより、時間的な無駄を少なくして、複数の蛍光画像を取得することができる。

また、ハーフミラー２１に代えて、光路上に挿脱可能な全反射ミラーを設け、該全反射ミラーの挿脱切替によって励起光Ｌの方向を切り替えてもよい。この場合には、シャッタ２３は不要である。

また、本態様においては、標本Ｓを挟んだ両側から平行な２つの光路に沿って励起光Ｌを入射させることとしたが、これに限定されるものではなく、検出光学系７の焦点面に沿う３以上の光路に沿って略平面状の励起光Ｌを入射させることにしてもよい。

１ 顕微鏡
３ 光源装置（シート照明光学系）
７ 検出光学系
２０ 画像処理部
Ｓ 標本

Claims (6)

1. 標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、
   該検出光学系の光軸に交差する方向に沿って平面状の励起光を入射させるシート照明光学系と、
   前記検出光学系により取得された画像を処理する画像処理部とを備え、
   前記シート照明光学系が、前記励起光の焦点位置をその入射方向に沿って移動させ、
   前記画像処理部が、前記シート照明光学系により異なる焦点位置に前記励起光が入射される都度に前記検出光学系により取得された複数の前記蛍光画像を合成して合成画像を生成する顕微鏡。
2. 前記シート照明光学系が、前記励起光の焦点位置の移動開始位置、移動ステップ数および各移動ステップの移動量を設定可能である請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記シート照明光学系が、励起光の波長を切り替え可能であり、前記移動開始位置および前記移動量を、使用する励起光の波長ごとに設定可能である請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記シート照明光学系が、前記標本の外部の異なる２以上の方向から前記励起光を択一的に入射可能である請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡。
5. 前記シート照明光学系が、前記検出光学系の光軸を挟んで両側から、前記励起光を入射可能である請求項４に記載の顕微鏡。
6. 一方向に沿って延びる平面状の励起光を標本に入射させる照射ステップと、
   前記励起光の焦点位置をその入射方向に沿って移動させる移動ステップと、
   該移動ステップにより前記励起光の焦点位置が移動させられる都度に標本から発せられた蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出ステップと、
   該検出ステップにおいて取得された複数の蛍光画像を合成して合成画像を生成する合成ステップとを含む顕微鏡画像取得方法。
   

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