JP2013506152A - 顕微鏡 - Google Patents

Abstract

本発明は試料領域（Ｐ）を照明する光のシートを生成する照明装置（１９）を含む顕微鏡に関し、シートは照明ビーム経路（３５）の照明軸（Ｘ）方向及び照明軸に対し直角に位置する横軸（Ｙ）方向に略平面状に延在する。顕微鏡は試料領域からの放射光を検出ビーム経路の検出軸（Ｚ）に沿って検出する検出装置（１）を備え、照明軸と検出軸、並びに横軸と検出軸は互いに対しゼロでない角度にある。照明装置は、照明光を追加的な照明ビーム経路（３６）へ偏向させ追加的な光のシートを生成する手段と、照明ビーム経路間で照明光を切替える切替え手段とを含み、２つの光のシートは同じ照明軸上の同領域を逆方向から照明する。切替え手段は１０ｍｓ未満の切替え時間を有する素早く切替可能な切替え素子を含み、面検出器の所定の積分時間及び切替え素子の切替え時間は、試料領域が積分時間中に各方向から少なくとも一度照明軸上で照明されるよう同期されている。

Description

本発明は、光のシートを生成して試料領域を照明する照明装置を備える顕微鏡に関し、シートは、照明ビーム経路の照明軸Ｘの方向、およびその照明軸Ｘに交差して位置する横軸Ｙの方向に略平面状に延在している。顕微鏡は、試料領域から放射される光を検出ビーム経路の検出軸Ｚに沿って検出するために用いられる検出装置をさらに備え、照明軸Ｘと検出軸Ｚとは、ならびに横軸Ｙと検出軸Ｚとは、互いに対してゼロではない角度に向けられている。好ましくは、それぞれの軸は、互いに略直角に向けられている。照明装置は、照明光を別の照明ビーム経路内に偏向させ、照明軸の方向およびその横軸の方向に略平面状に延在する別の光のシートを生成するための手段をさらに含み、照明ビーム経路と、別の照明ビーム経路とは、本質的に同一の光学素子で構成され、かつ等しい光路長を有しており、光のシートと、別の光のシートとは、それらが、同じ照明軸上の逆方向からその試料領域を照らすように互いに位置合わせされており、照明装置は、一方の照明ビーム経路と他方の照明ビーム経路との間で、照明光を切替えるための切替え手段をさらに含み、検出装置は、その試料領域から放射された光を、光の位置依存検出のためのアレイ検出器に結像するための検出対物レンズを含む。

このような顕微鏡の設計は、ＳＰＩＭ顕微鏡（ＳＰＩＭ：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｌａｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（選択的平面照明顕微鏡法））として知られている部類に入る。３次元試料が、個々の平面内で異なる深さで逐一走査され、それによって得られた画像情報が、その後、その試料の３次元画像を形成するように編成される共焦点レーザ走査顕微鏡（ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＬＳＭ）とは対照的に、ＳＰＩＭ技術は、広視野顕微鏡法に基づいており、および試料の様々な面を通る光学的断面に基づいた試料の画像化を可能にする。

ＳＰＩＭ技術の利点は、とりわけ、画像情報が検出される速度がより速いこと、生体試料の退色に関する低減されたリスク、および試料への焦点の侵入深さがより大きいことにある。

ＳＰＩＭ技術の原理は、試料に元々含まれていたか、またはコントラストのために添加された蛍光色素分子がレーザ光で励起され、そのレーザ放射が、いわゆる光のシートに成型されるということである。その光のシートは、試料領域の試料の深部の選択された面を照明するために用いられ、結像レンズ系は、この試料面の画像を、光学的断面の形で得るために用いられる。

ＳＰＩＭ技術に対する最初の近代的なアプローチは、非特許文献１に記載されている。そこでは、近代的なＳＰＩＭ技術の原理が説明されており、試料を照明するためにコヒーレントな光源が用いられ、その光のシートは、円柱レンズを用いて生成される。その光のシートは有限厚を有するが、結像レンズ系およびカメラを具備する検出手段が、その光のシートの伝播方向に直角に配置されている。

近年に至って、その技術は、特に、蛍光顕微鏡法における用途に関してさらに進化した。例えば、特許文献１、およびそれに基づいて、特許文献２は、光シート状照明が、ライン状光照明野と、検査すべき試料との間の相対運動によって生じる方法について記載している。その光シート状照明は、その相対運動によって並んで整列するように、経時的に連続して繰り返される光照明野によって形成される。しかしこのようにすると、照明の方向に位置する試料の一部によって、影が、検査すべき試料面内に形成され、および影は、その照明光に対して透過的ではない。同様の構成は、非特許文献２、および非特許文献３に記載されている。

全く静的な光のシートの代わりに、円柱レンズ系が用いられるその生成の場合、回転対称光ビームで試料を迅速に走査することにより、準静的な光のシートを生成することが可能である。試料が撮像されるカメラの積分時間は、スキャンが、その積分時間内に完了するように選択される。このような構成は、非特許文献４、および非特許文献５に記載されている。

しかし、公知の全ての構成および方法は、多かれ少なかれ、重大な欠点を有しており、それらの欠点は、とりわけ、顕微鏡の高い操作性、および大量の試料を比較的短時間で検査しなければならない状態での概して高いスループットを実現することが重要な、商業分野におけるＳＰＩＭ技術の利用を制限する。本質的な欠点を以下で説明する。

これまでに実施されてきたＳＰＩＭ技術を用いた構成のほとんどにおいて、例えば、特許文献１および特許文献２による構成においては、検出のためのイメージフィールドサイズのちょっとした変化、例えば、試料の良好な概観を提供するイメージフィールドサイズから細部領域への切替えは、どちらかと言えば複雑で時間のかかることである。それは、検出対物レンズの変更によってのみ実施することができる。このことは、試料空間に悪い影響を及ぼし、水平方向の検出ビーム経路の場合に、特に良くない影響を与える可能性がある。最悪のケースでは、試料チャンバの取外しおよび排出も伴う。その後に、一般的には、再焦点調節が必要である。また、試料は、不必要に加熱または冷却される。

非特許文献６には、改良について記載されている。そこでは、検出ビーム経路が垂直方向に設けられており、その結果、イメージフィールドサイズの変更を、試料チャンバ容積との相当の相互作用を何ら伴うことなく実行することができる。その検出対物レンズは、その試料チャンバに入れた後、単純な方法で上方から取出すことができる。それにもかかわらず、試料チャンバとのわずかな相互作用、およびそれに伴う試料との間接的な相互作用は避けることができない。

イメージフィールドサイズの適応は、ズーム検出対物レンズを用いた場合には、より単純である。そのような構成は、非特許文献７に記載されている。そこでは、市販の顕微鏡、すなわち、ズーム対物レンズを有するＯｌｙｍｐｕｓ ＭＶＸ１０が、検出のために使用されている。これは、確かに、一般的に浸液で満たされている試料チャンバ内へ上方から挿入され、その結果、ここでもまた、その対物レンズのズーム機能が作用する場合、または、焦点が調節される場合に、その試料チャンバ内の液体に伝わる可能性のある変動を引き起こす可能性がある、レンズの電動移動のみによって、その試料チャンバとのわずかな相互作用が生じる。

検出のためのイメージフィールドサイズを変更する場合、照明側のイメージフィールドを適応させること、すなわち、横軸Ｙおよび検出軸Ｚに沿って、光のシートの広がりを適応させることも望ましいことである。従来技術においては、この適応は、これまで、例えば、非特許文献４、および非特許文献８に記載されているような交換可能なダイヤフラムおよびビーム拡大器のうちの少なくとも一方を用いることによって実施されてきた。ダイヤフラムの場合に生じるフレアが光損失を引き起こすのに対して、ビーム拡大器の使用は、その交換がどちらかと言えば面倒であるため、柔軟性を低下させる。

典型的な様式では、例えば、特許文献２に記載されているように、光のシートは、ビーム経路内に配置された円柱レンズを介して生成されるが、従来技術の最近の情勢は、例えば、上述の論文、すなわち、非特許文献４に記載されているように、静的な光のシートは生成されないが、単に準静的な光のシートが生成される構成を用いており、この場合、試料は、回転対称光ビームによって素早く走査される。「素早く」とは、一般的に用いられている空間分解アレイ検出器、例えば、ＣＣＤチップまたはＣＭＯＳチップを有するカメラの積分時間が、この積分時間内に、光ビームが、準静的な光のシートに対応する試料領域を走査するように選択されていることを意味する。例えば、カメラにおいては、シャッタ開放時間に相当する積分時間と、光ビームの走査周波数または走査時間とは、一般的に、互いに独立に設定することができ、そのため、走査時間は、一定の積分時間に適応させることができる。回転対称光ビームを用いて走査した場合も光のシートを生成するが、少なくとも実質的には、このアプローチもまた、光のシートの生成に包含されている。

どちらの種類の光のシートの生成も、利点と欠点を有している。例えば、円柱レンズを用いた場合、試料が照明される強度を、より低いレベルで選択することができるのにもかかわらず、走査する場合と同じビーム量が実現されるため、試料にかかる負荷はそれ程でもない。また、その速度は、照明ビーム経路内の可動要素によって制限されないため、円柱レンズの使用は、非常に短い時間内に、高速で連続した画像シーケンスを記録するのに良く適している。特に、ストロボスコープのような照明は、円柱レンズを用いて非常に良く実施することができる。走査する場合、使用される旋回走査ミラーは、一般的に、速度制限要素になりかねない。例えば、特許文献３に記載されているようなバンディングを低減するために、プレーン走査を、角度走査、すなわち、異なる角度からの照明と組み合わせた場合には、光シート角度走査および位置走査のためのスキャナ群がマッチしていないと、すなわち、同期されていないと、ビートアーチファクトが生じるというリスクがある。

走査による光シートの生成の利点は、とりわけ、光のシートの生成が、試料のより均質な照明を可能にし、その結果、定量的な画質評価も可能になり、そのことは、円柱レンズ系を用いて、概してダイヤフラムを介したフレアリングによってのみ実現することができ、このことは、光損失を引き起こす。また、スキャナの最大偏向の柔軟な選択は、画像のサイズを、高い柔軟性で適応させることを可能にするであろう。走査は、励起光の空間コヒーレンスを低下させ、そのことは、バンディングの低下にもつながる。そして、例えば、ＡＯＴＦによる光源の特別な変調により、格子状パターンを試料内に投影することが可能である。

従来技術において説明されている他の構成においては、試料は、照明軸Ｘに沿った反対方向から、両側から照明される。非特許文献７に記載されている構成においては、試料は、両側から同時に照明される。ミバエ（ショウジョウバエ）の胚等の様々な種類の試料に対して、このような構成は、散乱および非散乱画像部分が、このようにして好ましくない方法で結合されるため、有利ではない。非特許文献８および非特許文献６は、順次的に、すなわち、照明軸Ｘに沿って、２つの方向から交互に試料を照明する構成について記載しており、それは、上述した試料にとってより好ましい。２つの照明方向間で前後に切替えるために、振動生成シャッタまたは回転ミラーが用いられ、その結果、切替えに必要な時間が、比較的長くなる。

非特許文献４および非特許文献５は、照明および検出対物レンズのうちの少なくとも一方が、圧電モータに取付けられているＳＰＩＭ構成について記載しており、そのことは、焦点合わせを可能にする。そしてそこでは、焦点距離の設定は、対物レンズ全体の変位によって実現されている。具体的には、試料チャンバとの相互作用が可能なように、画像面からのフロントレンズの距離は維持されない。このことは、特に、浸漬検出対物レンズを備える水平方向の検出ビーム経路に当てはまり、すなわち、ここでは、その対物レンズの必要な動作は、窮屈さの問題を引き起こす。一方においては、ユーザが、試料チャンバに供給するための種々の手段のためにそこにスペースを必要とする場合、その試料スペース内の可動要素は、概して邪魔になっている。その対物レンズと試料との間の空間は、空気ではなく液体によって占められているため、その対物レンズの動作中に発生する振動は、不利に試料に伝わる可能性がある。

光のシートを生成するためにスキャナを用いる場合、照明対物レンズの瞳内へのそのスキャナの結像は、一般的に最適ではなく、そのため、プレーン位置走査は、角度走査の一部によって重ね合わせられる。

また、従来技術においては、検出ビーム経路が、２つの分岐ビーム経路に分けられている構成も知られており、これは、例えば、上述した２つの出版物、非特許文献４および非特許文献５に記載されている。ビームを分ける場合には、光の部分を一方の分岐ビーム経路に送り、光の他方の部分を他方の分岐ビーム経路へ反射させるビームスプリッタを用いる。この目的のために、２ｍｍ以下の比較的小さな厚みの一般的なダイクロイックフィルタを用い、それらのフィルタは、検出ビーム経路の分岐部分に配置される。このような配置の利点は、伝達の方向において、非点収差によって引き起こされる何らかのアーチファクトがほとんど生じないということである。しかし、反射光の方向においては、コーティングにより、または、不適切な取付けによって引き起こされる可能性のある、そのダイクロイックフィルタでの表面張力により、非点収差または焦点ぼけ等のイメージアーチファクトが生じてしまう。２つの分岐検出ビーム経路に分けるという別の方法は、非特許文献８に記載されている。そこでは、ダイクロイックフィルタは、（ビーム経路に対して）無限遠に配置されており、そのためここでもまた、伝達中に生じる問題は最小限になる。反射分岐ビーム経路が関わっている限り、従来のダイクロイックフィルタを使用した場合には、ここでも、表面張力という問題が生じる可能性がある。

独国特許出願公開第１０２ ５７ ４２３（Ａ１）号 国際公開第２００４／０５３５５８Ａ１号パンフレット 独国特許出願公開第１０ ２００７ ０１５ ０６３（Ａ１）号

エー・エイチ・ヴォイエ（Ａ．Ｈ．Ｖｏｉｅ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、第１７０巻、第３号、２２９〜２３６ページ（１９９３年） ステルツァー（Ｓｔｅｌｚｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０５巻、１００７〜１００９ページ（２００４年） レイノー（Ｒｅｙｎａｕｄ）ら、ＨＦＳＰ Ｊｏｕｒｎａｌ、第２巻、２６６ページ（２００８年） ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３２２巻、１７６５ページ以降（２００８年） ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１８巻、１〜９ページ（２００９年） ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、第１巻、第１号、３６〜４２ページ（２００８年） サンティ（Ｓａｎｔｉ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ、第４６巻、２８７〜２９４ページ（２００９年） ヒュースケン（Ｈｕｉｓｋｅｎ）ら、Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３２巻、第１７号、２６０８〜２６１０ページ（２００７年）

本発明の課題は、冒頭に記載した種類の装置を改良すること、従来技術における上述した欠点を少なくすること、およびこれまでに分かっている解決策よりも都合の良い機器およびこれらの欠点のうちの１つまたはいくつかを改善するための機能コンポーネントを、プロのユーザに提供することである。

冒頭に記載した種類の顕微鏡の場合、その試料を両側から照らす際の柔軟性の改善に関して、この課題は、その切替え手段が、１０ｍｓ未満の切替間隔を有する素早く切替可能な切替え素子を具備し、そのアレイ検出器の所定の積分時間と、その切替え素子の切替間隔は、その試料領域が、その積分時間中に、その照明軸上の各方向から少なくとも一度は照明されるように互いに整合させられているような方法で解決される。

アレイ検出器の場合の積分時間、すなわち、その時間内に、たとえば、カメラのシャッターが開いて、測定データが収集される時間は、信号対ノイズ比に悪影響が及ぶという別の理由から、長すぎてはならない。そのため、電動回転ミラー等は、除外しなければならない。従って、１０ｍｓ未満の切替間隔を有する検流計駆動ミラーを用いることが有利である。

切替えミラーの代わりに、音響光学または電気光学切替え素子等の他の切替え素子を用いてもよく、それらの切替え素子は、反射方式で、または同等に、透過方式で作動することができる。

重要なことは、（他の振動は、悪影響を与える可能性があるため、概して２０ｍｓを超えない）そのアレイ検出器の積分時間に比較して、その切替間隔は、その積分時間内に、いずれかの方向から少なくとも一度はその試料領域が照らされるように十分に短くあるべきであるということである。その切替間隔が十分に小さい、たとえば、５ｍｓ未満の場合には、それぞれの方向からのマルチスキャンも同様に実現可能である。

このようにして、試料の性質により、両側からの順次交互照明、および両側からの試料の準同時照明のために用いることのできる素早く切替可能な２ビーム照明を実現することができる。「準同時」という用語は、その照明方向が、カメラの積分時間中に変化するため、および回転対称光ビームによって試料が走査されている状態で、光のシートが走査方式で生成される場合には、その光ビームが、異なる方向から少なくとも二度、試料を走査するため用いている。上述した短い切替間隔によって、その試料は、概してその位置を変えず、その結果、その画像においては、その試料は、実質的には、両側から照明されたように見える。

アレイ検出器の積分時間中に、照明光が、一方の照明ビーム経路から他方へ少なくとも一度は切替えられるため、その試料領域Ｐ内の試料は、照明軸Ｘに沿って実質的に両方向から同時に照らされる。

好ましくは、その切替えミラーは、その照明瞳と共役な平面内に配置される。このことは、その切替えミラーの偏向によって、および走査対物レンズを用いることによって生じる位置オフセットが、切替えのために利用されるという利点を有する。角度オフセットが切替えのために直接的に使用される代替的な構成も同様に実現可能である。

その照明装置は、光のシートの生成のための手段も具備してもよく、その手段は、回転対称光ビームを生成するための手段と、その横軸に沿った試料領域の光シート状走査のための走査手段とを同様に具備し、その走査手段は、例えば、素早く切替可能な走査ミラーと、走査対物レンズとを具備する。必要に応じて、角度走査手段を設けてもよく、それを用いて、その光のシートと照明軸との間の角度が変えられる。これらの角度走査手段は、例えば、バンディングの低減のための素早く切替可能な角度走査ミラーを具備してもよい。

光のシートの生成のための高速走査ミラーに加えて、およびその近傍において、別の高速走査ミラーを、そのビーム経路内に配置してもよく、それを用いて、例えば、調節のために、光のシートを、その検出軸の方向にシフトさせることができる。このことは、その走査ミラーによって実行することもできる。

設定を適切に構成した状態で、他の高速走査ミラーまたは切替えミラーも、わずかなオフセットにより、その検出方向における光のシートを調整するために用いてもよい。
本願明細書においては、照明装置が、非点収差的に作用する光学素子、好ましくは、円柱光学素子を具備し、それが、一方の照明ビーム経路内、または、他方の照明ビーム経路内に配置され、その走査ミラー、切替えミラーまたは他の走査ミラーが瞳面に正しく結像するように機能することが有利である可能性がある。２つのミラーのうちの一方は、その瞳面に正しく結像されるが、そのような追加的な非点収差的に作用する素子を有していない別のミラーの結像は、正しくならない可能性があり、そのため、この素子は、両ミラーの正しい結像のための光学補正系である。

例えば、ＣＭＯＳ方式の最新のアレイ検出器の場合のように、そのアレイ検出器が、別々に読み出すことができ、およびそれらに対して、異なる積分時間を指定することができる画素の領域を有する場合には、興味深い用途が生じる。ここでは、その切替え素子の切替間隔をさらに、それらの異なる積分時間と同期させることができる。

前述した特徴および以下に説明されている特徴は、記載されている組合せだけではなく、本発明の範囲から逸脱することなく、他の組合せにも、あるいは、独立した特徴として適用可能であることを理解されたい。

以下、本発明を、とりわけ、本発明に関して本質的な特徴を示す添付図面を参照して、より詳細に例示的に説明する。

ＳＰＩＭ顕微鏡の場合の検出ビーム経路を示す図である。 ＳＰＩＭ顕微鏡の場合の照明ビーム経路の３つの異なる構成を示す図である。 図２に示す構成の場合の詳細を示す図である。 別の照明ビーム経路を示す図である。 両側からの照明のための照明ビーム経路を示す図である。 両側からの照明の、試料に対する影響を示す図である。 ２つのチャネルを有する検出ビーム経路の詳細を示す図である。 ２つのチャネルを有する別の検出ビーム経路の詳細を示す図である。

図１は、ＳＰＩＭ技術の原理によって動作する顕微鏡の検出ビーム経路を示す。図１には示されていないが、試料領域Ｐを照明するための光のシートが生成される顕微鏡の照明装置がそのビーム経路に付随している。その光のシートは、照明ビーム経路の照明軸Ｘの方向、および照明軸Ｘと交差する横軸Ｙの方向に、略平面状の形態を有する。その検出ビーム経路に沿って、試料領域Ｐにより検出軸Ｚに沿って放射される光を検出するために用いられる検出装置１の素子が図示されている。照明軸Ｘおよび検出軸Ｚは、横軸Ｙと検出軸Ｚの場合と同様に、互いに略直角になっている。

検出装置１は、その検出ビーム経路内に配置された検出対物レンズ２を具備する。検出ビーム経路１内の他の本質的な素子は、チューブレンズユニット３および空間分解アレイ検出器４であり、それらは、例えば、適当なカメラのＣＣＤチップまたはＣＭＯＳチップとして設計することができる。その光は、光学結像素子５を用いてこのアレイ検出器４上に結像される。

検出装置１の本質的な素子は、検出対物レンズ２のフロントレンズから離れるように配置されており、およびこのフロントレンズとは独立に調節することができる光学検出素子である。一方では、その光学検出素子を用いて、検出イメージフィールドのサイズは、連続的に可変であり、他方では、その検出素子は、試料領域Ｐ内の検出焦点面を連続的にシフトするために用いることができる。その検出素子は、２つのタスクの一方のみを、または両方のタスクを交互に処理するように、あるいは、両構成を同時に実行できるように、設計することができる。その検出素子は、例えば、互いに対して可動である２つ以上のレンズコンポーネントの形態で、検出対物レンズ２の一体部とすることができ、一方、そのフロントレンズは、それらのレンズコンポーネントの動作中は静止したままである。別法として、その検出素子は、検出対物レンズ２から一定距離に、そのビーム経路内の独立したコンポーネントとして配置することができる。その検出素子の調節中、すなわち、そのレンズコンポーネントのうちの１つまたはいくつかのそのビーム経路に沿った移動中、そのフロントレンズは、静止したままである。

独立したコンポーネントとしてのその光学検出素子は、例えば、図１に示すように、２つの可動レンズコンポーネント６．１および６．２と、それらの間にある固定レンズコンポーネント６．３とを有する検出ズーム素子６として設計することができる。検出ズーム素子６の使用は、概観画像と詳細画像の容易な切替え、または、関心のある試料詳細の有効な位置決めを可能にする。さらに、検出ズーム素子６を用いて、異なる試料角度で、検出方向Ｚに沿った画像スタックの記録、いわゆる多視点画像スタックが、容易な方法で可能である。検出ズーム素子６は、電動によって完全に調節することができる。制御素子位置のテーブルの自動編集の場合、その検出ビーム経路の中間像面に移動される、透過パターン等、例えば、透過格子パターン７等の中間像サンプルを用いることができる。図１において、この透過格子パターン７は、移動した状態で図示されているが、一旦、全てのパラメータが確認されたら、そのパターンは外すこともでき、また、検出には必要ない。別法として、検出対物レンズ２の代わりに、較正対物レンズ（図示せず）をそのビーム経路内で用いることができる。

また、位置設定のための異なるテーブルを、異なる放射波長に対して編集することができるという事実を利用することができるため、異なる光の波長で、いわゆるマルチトラック顕微鏡写真の記録を容易にすることも可能である。従って、検出ズーム素子６を調節することにより、検出装置１の長手方向の色収差を補正することができる。

この目的のためには、検出ズーム素子６を用いて、試料領域Ｐ内の焦点面を連続的にシフトすることが有利である。検出ズーム素子６は、検出対物レンズ２から離れて配置されており、検出対物レンズ２自体を移動させる必要はないため、移動すべき量は非常に小さい。その検出ビーム経路内の静止位置に配置されている検出ズーム素子６を用いることにより、その検出ビーム経路の内焦方式として知られていることを実施することができる。移動される量が小さいため、焦点調節を繰返し要する検出方向Ｚに沿った画像スタックは、より高精度および高速で記録することができる。

また、検出対物レンズ２、またはそのフロントレンズは、中に試料が置かれて、その試料領域Ｐが照明される試料チャンバに対して動かないため、その試料チャンバの水封が容易になる。従って、振動による試料との相互作用が回避され、追加的な力は試料に作用しない。さらに、その試料チャンバを満たす液体の温度に応じて、その検出焦点面を指定することが可能であり、その目的のために、この液体の温度が測定され、それに応じて焦点位置が調節される。その温度が変化すると、この変化が、評価ユニットおよび制御ユニットを介してその検出素子へ信号で伝えられ、それに伴って、その検出焦点面が調節される。このようにして、その試料チャンバを満たす液体の屈折率の変動を補正することができる。水は、高い頻度で、液体または浸漬媒体として使用される。屈折率データは、異なる液体のために保存することができ、すなわち、ユーザが、どの浸漬媒体を使用するかを指定すると、正確な調節を自動的に実行することができる。その検出焦点面のこの種の温度依存変動は、例えば、いわゆる熱衝撃実験に利用することができ、この場合、試料または浸液は、極短時間に、大きな温度変化にさらされる。

図示の実施例において、検出ズーム素子６は、２つの可動レンズコンポーネント６．１、６．２を有し、それらの間には、固定レンズコンポーネント６．３があるように設計されているが、より多くの可動レンズコンポーネントを有する、または、１つのみの可動レンズコンポーネントを有する他の設計も可能である。例えば、内焦方式、すなわち、検出焦点面の連続的シフトのために検出ズーム素子６を使わないように問題なく提供することができる。この場合、例えば、その試料領域内の検出焦点面をシフトするための、すなわち、内焦方式のためのチューブレンズユニット３のチューブレンズ８を用いることができる。このチューブレンズ８は、その場合、両矢印で象徴的に図示されているように、そのビーム経路に沿って可動であるように配置される。また、チューブレンズユニット３は、検出対物レンズ２から離れて、および同様に検出素子または検出ズーム素子６から離れて配置されている。

検出装置１は、いくつかの追加的な光学素子を備えており、そのうちのより本質的なものを以下に説明する。コンパクトな設計を実現するために、そのビーム経路は、偏向ミラー９、１０を介して試料領域Ｐから空間分解アレイ検出器４へ向けられている。ビーム結合器１１によって、追加的なビーム経路を必要に応じて結合することができ、そしてそれは、反射光照明に用いることができる。さらに、ダイクロイックビームスプリッタ１３を、そのビーム経路の近無限遠空間１２内の、すなわち、そのビームが、必ずしも完全ではないが、可能な限り平行になる範囲内で、ズーム素子６と、結像素子５との間のビーム経路内に配置することができ、前記ダイクロイックビームスプリッタ１３は、検出すべき光をそこに結像することができる空間分解アレイ検出器を、分岐ビーム経路１４および１５の各々に配置した状態で、その検出ビーム経路を２つの分岐ビーム経路１４および１５に分割するための分割手段として作用する。図１は、分岐ビーム経路１４のための光学素子のみを示しており、分岐ビーム経路１５は、同一の設計であってもよい。

そのダイクロイックビームスプリッタは、３ｍｍを超える厚さを有しており、そのため、従来技術において知られているような表面張力の発生による結像収差等の問題を回避することができる。２つの分岐ビーム経路１４および１５の各々には、検出すべき光のそれぞれのアレイ検出器への結像のための光学結像素子が配置されている。２つの分岐ビーム経路１４または１５のうちの少なくとも一方には、ウォッブルプレート１６および１７を必要に応じて配置することができ、それらを用いて、検出軸Ｚに直角な２つの直交方向内でオフセットを調節することができる。このようにして、２つのアレイ検出器から読み出した測定データの自動重ね合わせを実施することができる。このことは、例えば、２つの異なる放射波長の場合の画像を別々に記録した後、重ね合わせる場合に重要なことである。この目的のために、図１は、分岐ビーム経路１４内に任意の放射フィルタ１８も示してあり、それを用いて、波長選択を実行することができる。別の波長を選択する類似の放射フィルタ１８を、他方の分岐ビーム経路１５内に配置してもよい。また、画像重ね合わせの正確な調節のために、上述した透過格子パターン７が、その検出ビーム経路の中間像面で用いられ、または、検出対物レンズ２の代わりに、較正対物レンズ（図示せず）が用いられるような方法で、中間像サンプルを較正のために用いてもよい。

さらに、それぞれの分岐ビーム経路内の光学結像素子を、シフト可能に配置してもよく、その結果、それぞれのアレイ検出器に焦点合わせをすることが可能である。
図２は、照明装置１９を示し、それを用いて、試料領域Ｐを照明する光のシートが生成され、その光のシートは、照明ビーム経路の照明軸Ｘの方向、および照明軸Ｘと交差する横軸Ｙの方向において、略平面状の形態である。明確にするために、図１に実施例として図示されている検出装置１は、ここでは省略されているが、図１および図２に示す座標系に従って、相互の位置合わせがなされている状態で、どちらも容易に互いに組み合わせることができる。

図２に図示されている照明装置１９は、異なる３つの構成Ａ、ＢおよびＣで示されている。照明装置１９は、その照明ビーム経路内に、少なくとも１つの照明対物レンズ２０と、照明対物レンズ２０のフロントレンズから一定距離に配置され、およびこのフロントレンズとは独立に調節することができる照明素子とを具備し、その照明素子を用いて、検出軸Ｚの方向の光のシートの広がりが連続的に可変になり、および／またはそれを用いて試料領域Ｐ内の照明焦点面を連続的にシフトしてもよい。その照明素子は、例えば、互いに対して移動可能な２つ以上のレンズコンポーネントの形態で、照明対物レンズ２０の一体部とすることができ、一方、そのフロントレンズは、それらのレンズコンポーネントの動作中、静止したままである。別法として、その照明素子は、照明対物レンズ２０から一定距離に、そのビーム経路内に独立したコンポーネントとして配置することができる。その照明素子の調節中、すなわち、そのビーム経路に沿った、そのレンズコンポーネントのうちの１つまたはいくつかのシフトの間、そのフロントレンズは、静止したままである。

従って、その照明素子は、その光のシートを、そのイメージフィールドサイズに連続的に適応させるために、および焦点を設定するために用いることができる。このことは、例えば、その照明素子が、照明ズーム素子２１として設計されている場合、簡単な方法で可能である。そのため、このことは、特に、検出装置１にも検出ズーム素子６が設けられている場合に、照明の開口数と、検出イメージフィールドのサイズとを最適かつ連続的にマッチさせるために利用することができる。交換可能な望遠鏡等の他の解決策と比較して、照明ズーム素子２１を用いた開口数の適応は、連続的に行うことができる。ダイヤフラム等の他の解決策と比較すると、励起光は失われず、そのため、結局、必要な照明源、一般的にレーザは、より低い出力を有することができる。このようにして、試料に対する負荷が低減され、より高い出力密度を実現することができ、また、照明対物レンズ２０は、それほど頻繁に変化させる必要はない。その検出イメージフィールドのサイズと、その照明イメージフィールドのサイズとの比は、視野の中心の光のシートの厚さ１と、視野の端の光のシートの厚さ２との比を設定して、イメージフィールドサイズが変化したときに一定に保てるような方法で調節することができる。

また、その照明素子を用いて、試料領域Ｐ内の照明焦点面を連続的にシフトすることが可能な場合、すなわち、照明ズーム素子２１のうちの１つまたはいくつかのレンズ素子を互いに対してシフトさせた状態で、検出ズーム素子６の場合と同様の内焦方式によっても実現される調節が可能な場合、その光のシートのウェストも、照明軸Ｘの方向における視野にわたって連続的にシフトさせること、すなわち、ウェストスキャニングと呼ばれるプロセスも可能である。このプロセスにおいて、検出方向Ｚにおける最大分解能を、全ての視野にわたって実現することができる。

内焦方式は、照明軸Ｘに沿った両側からの照明と組み合わせると、その視野の約１／４および約３／４にそのウェストを位置決めすることを可能にする。このようにして、その光のシートの厚さの変動を、一方の側からのみの照明の場合よりも明らかにより小さく保つことができる。そして、検出ズーム素子６に関連して説明したように、温度依存性の焦点合わせと同様に、浸漬媒体の温度に応じて、または、試料を固定するために用いられるその媒体の異なる光学的厚さに応じて、光シートのウェストの位置の補正が可能である。

その照明側イメージフィールドサイズまたはその光のシートの広がりを、その検出イメージフィールドのサイズに適応させるためには、検出ズーム素子６によって与えられるその検出イメージフィールドのサイズに応じて、照明ズーム素子２１を設定するための制御回路を介して、照明ズーム素子２１と検出ズーム素子６を結合することが有利である。この場合、その検出イメージフィールドのサイズが、例えば、観察者によって手動で変更された場合、その照明側イメージフィールドサイズは、この変化に自動的に適応される。従って、観察者は、このことがその制御回路によって実施されるため、照明ズーム素子２１の照明側適応をしないで済み、その結果、照明のための開口数は常に最適に設定されている。

図２に示す照明ズーム素子２１には、少なくとも３つの独立にシフト可能なレンズコンポーネント２１．１、２１．２および２１．３と、固定レンズコンポーネント２１．４とが設けられている。ビーム経路Ａ、ＢおよびＣは、照明ズーム素子２１の３つの異なる位置を示している。３つのシフト可能な素子の使用は、この場合、正確な倍率だけではなく、瞳および中間像の正確な結像も確実にするために必要であり、その結果、３つの自由度を設定することができる。より少ない自由度が関連している場合には、より少ないシフト可能な素子で十分であろう。

照明ズーム素子２１の効果は、３つの異なる構成Ａ、ＢおよびＣの場合について図３に詳細に示されている。照明ズーム素子２１は、図３ａに示すように、照明軸Ｘと横軸Ｙに及ぶ面内と、図３ｂに示すように、照明軸Ｘと検出軸Ｚに及ぶ面内との両方でその効果を示す。図３ｂにおいては、照明開口の適応により、どのようにして、照明ズーム素子２１の位置Ａから位置Ｂ、位置Ｃへの光のシートの厚さが、次第に薄くなっていくことが図を見て分かる。図３ａにおいては、照明ズーム素子２１の設定からもたらされる適応が、Ｘ−Ｙ面に示されている。

照明開口の選択に関する柔軟性をさらに高めるために、照明装置１９は、望遠鏡チェンジャー２２を具備することもでき、その結果、実現可能な開口の範囲を広げる。代替としてまたは追加的に、照明対物レンズ２０は、同様の効果をもたらすように変更することができる。

図２に示す照明装置１９は、光のシートの生成のための第１の手段をさらに具備し、その手段は、回転対称光ビームを生成するための手段と、所定の時間間隔での横軸Ｙに沿ったその試料領域の光シート状走査のための走査手段とを同様に具備する。その回転対称光ビームを生成するための手段は図示されていないが、図２に示す構成の走査手段は、走査ミラー２３を具備し、それを用いて、回転対称光ビームは、いずれの場合も完全に、積分時間中に、すなわち、測定データが検出器から読み出される前に経過する時間内に、そのスキャナが試料を少なくとも一度、好ましくは数回、通過する速度で試料全域にガイドされ、換言すれば、積分時間は、その光ビームが試料を通過する間は、終了してはならない。積分時間、走査時間および走査動作は、互いに調整され、その結果、所定の時間間隔が、その積分時間に本質的に等しくなる。走査ミラー２３の効果は、図２および図３には図示されていない。

走査ミラー２３から出た照明光は、走査対物レンズ２４、チューブレンズ素子２５および照明対物レンズ２０を通って試料領域Ｐに結像される。その構成を可能な限りコンパクトにするために、様々なミラー２６がビーム偏向のために使用されている。

走査ミラー２３に加えて、照明装置１９には、光のシートの生成のための第２の手段が必要に応じて設けられており、その手段は、第１の非点収差的に作用する光学素子を具備し、図示の実施例において、これは、少なくとも１つの非点収差レンズ、ここでは円柱レンズを有する、静的な光のシートを生成するための第１の円柱光学素子２７である。また、選択手段（図示せず）も設けられており、それを用いて、光のシートの生成のために、第１または第２の手段のいずれか、または両方を選択することができる。このことは、走査ミラー２３または円柱光学素子２７のいずれか、あるいは両方が使用されることを意味する。円柱光学素子２７は、例えば、その光学素子を、そのビーム経路内に、または、ビーム経路から側方に移動させることができるように設計することができる。このようにして、それぞれ上述した、光のシートの生成のための両方の方法の利点を組み合わせることができる。また、円柱レンズの代わりに、第１の非点収差的に作用する光学素子は、パウエルレンズまたは他の非点収差的に作用するレンズを具備することもできる。

具体的には、試料領域Ｐ内のイメージフィールドの一般的なカバー範囲は、円柱光学素子２７に関連付けられ、その光学素子は、ここに図示されている構成においては、走査ミラー２３と同時に使用される。しかし、円柱光学素子２７は、照明ズーム素子２１の各位置のイメージフィールド全域をカバーすることはできない。

図２において、照明装置１９は、任意の角度走査手段をさらに具備する。図２に示す実施形態において、その角度走査手段は、素早く切替え可能な角度走査ミラー２８を具備する。角度走査ミラー２８により、その光のシートと照明軸Ｘとの間の角度が可変になっている。角度走査ミラー２８としては、例えば、微小電気機械タイプからなるものを含む共鳴またはポリゴンスキャナを使用することができる。第１の円柱光学素子２７を使用する場合、角度走査ミラー２８は、その照明焦点面と共役になるように配置される。角度走査ミラー２８を用いて、試料を異なる角度から照明することができ、そのことは、バンディングを低減するために利用することができる。図２において、角度走査ミラー２８の動作は、２つのビーム経路２９および３０による構成Ｃの場合について図示されている。ビーム経路２９では、その角度走査ミラーはゼロ位置にあり、すなわち、偏向されておらず、一方、ビーム経路３０は、ゼロとは異なる角度走査ミラー２８の偏向の場合に当てはまる。このことは、図３ａの全ての構成Ａ、Ｂ、Ｃの場合についても図示されている。角度走査ミラー２８は、一般的に、１０ｋＨｚの周波数で作動し、一方、光のシートを生成するための走査ミラー２３は、約１ｋＨｚ〜２ｋＨｚの周波数で動作する。

また、角度走査ミラー２８との同時使用の場合には、角度走査ミラー２８と、素早く切替え可能な走査ミラー２３の非同期起動によって起きる可能性のある何らかのビートアーチファクトが、そのビーム経路内に配置された円柱光学素子２７によって部分的に不明瞭になるため、円柱光学素子２７の使用は有利である。円柱光学素子２７の使用が光ビームを平行にするため、照明の強度は、素早く切替え可能な走査ミラー２３の単独使用と比較して低減され、そのことは、試料にとって害が少ない。

素早く切替え可能な走査ミラー２３と組み合わせた円柱光学素子２７の作用は、図４に改めて詳細に示されているが、そこでは、その照明装置の様々な要素は、いくつかの代表的なものによって単に概略的に図示されている。ここでは、円柱光学素子２７を単独で使用した場合、ここに描かれている照明ズーム素子２１の位置を前提とすれば、イメージフィールドの一部のみをカバーすることができることは明らかであり、そのため、高速走査ミラー２３は、完全なカバー範囲を実現するように使用しなければならない。光は、高速走査ミラー２３の偏向を伴わずに、ビームセグメント３１に沿って、試料領域Ｐ内に結像され、そのセグメントの輪郭は、ここに示される。その光は、ゼロとは異なる偏向を伴って、ビーム部３２に沿って試料領域Ｐ内に向けることができる。走査ミラー２３の追加的な走査動作によって、試料領域Ｐの均質な照明を実現することができる。走査ミラー２３の使用をやめた場合、選択した試料領域の非常に高速なストロボスコープ状の照明が可能になるが、それは、走査ミラー２３のより遅い動作によって妨げられるであろう。

図２の照明装置１９の照明ビーム経路内には、第２の非点収差的に作用する光学素子が追加的に配置されており、その光学素子は、ここでは、第２の円柱光学素子３３である。少なくとも１つの円柱レンズを有する円柱光学素子３３の代わりに、パウエルレンズを有する非点収差的に作用する素子を同様に用いることができる。この第２の円柱光学素子も任意のものである。そのことは、高速走査ミラー２３を瞳面に結像するために、および角度走査ミラー２８を照明焦点面に結像するために意図されている。この追加的な第２の円柱光学素子３３（補正素子）がない場合、光のシートの調節および／または両側からの照明のための照明光の第２の照明ビーム経路内への偏向のために意図された、その照明ビーム経路内の同じかまたは等価な位置に場合によっては配置される高速走査ミラー２３および切替えミラー３４は、照明光学系の瞳面にのみ概して配置されるであろう。この結論は、２つのミラー２３または３４によって生じる試料領域Ｐ内の位置の動きが、角度の動きの一定の共有によって重ね合わせられたということである。このことは、特に、（検出方向において光のシートを調節するためにも用いられる可能性がある）偏向ミラー３４にとって好ましくない影響がある可能性があり、その訳は、そのミラーの位置により、その検出面に対する光のシートの位置が斜めになる可能性があるためである。

しかし、光シート顕微鏡法における照明は、固有の非点収差特性を備えているため、それらの特性を、ミラー２３および３４の両方の正確な瞳結像を実現するために利用することができる。円柱光学素子３３は、１つの軸のみに作用し、すなわち、この軸にも作用する走査または偏向ミラーが、その瞳に結像されるような方法で設計および位置決めされている。さらに、そのビーム経路は、他の軸で作用し、および円柱光学素子３３の動作がそのミラーに影響を及ぼさないミラーも、正確に結像されるように設計される。その結果、試料領域Ｐ内での位置動作に関する角度共有の重ね合わせを避けることができる。さらに、円柱光学素子３３は、角度走査ミラー２８が、正確にその試料面に結像されるように設計される。従って、試料領域Ｐ内での位置動作と角度動作の重ね合わせが避けられる。２つのミラー２３および３４は、互いに非常に近接して配置されているため、円柱光学素子３３は、非常に長い焦点距離を有するように構成される。

図５は、例えば、図２に示すような照明装置１９と、例えば、図１に示すような検出装置１とを設けることができ、および照明装置１９が、照明光を他方の照明ビーム経路３６内に偏向させるため、および対応する特性を有する別の光のシート、すなわち、照明軸Ｘの方向および横軸Ｙの方向に、略平面状の広がりを有する光のシートを生成するための手段を追加的に具備する顕微鏡を示す。照明ビーム経路３５および他方の照明ビーム経路３６内には、本質的に同一の光学素子が配置されており、両ビーム経路は、同じ光学経路長を有しており、一方の光のシートと、他方の光のシートは、同じ照明軸Ｘ上の反対方向から試料領域Ｐを照明するような方法で、互いに位置合わせされている。

照明装置１９は、照明ビーム経路３５と他方の照明ビーム経路３６との間で照明光を切替えるための切替え手段をさらに具備する。その切替え手段は、１０ｍｓ未満の切替間隔を有する素早く切替え可能な切替え要素を具備し、アレイ検出器４の所定の積分時間と、その切替え要素の切替え間隔とは、試料領域Ｐが、その積分時間中に、照明軸Ｘ上の各方向から少なくとも一度は照明されるような方法で互いに調整されている。

ここでは、その切替え要素は、素早く切替え可能な切替えミラー３４として設計されている。例えば、切替えミラー３４は、検流計駆動とすることができる。切替えミラー３４は、その照明瞳面と共役な面内に配置される。このようにして、素早く切替え可能な２ビーム照明を実現することができる。切替えミラー３４の位置により、その光は、照明ビーム経路３５内、または、偏向ミラー３７を用いて他方の照明ビーム経路３６内に偏向される。従って、切替えミラー３４の位置により、その光は、照明対物レンズ２０または照明対物レンズ２０’のいずれかに到達する。両ビーム経路共に、同じ光学素子および同じ光学経路長を有するように設計される。

切替えミラー３４の代わりに、他の切替え素子、例えば、反射または透過方式で機能することのできる音響光学または電気光学切替え素子等を同様に用いてもよい。
重要なことは、そのアレイ検出器の積分時間と比較して短い切替え間隔であり、それは、他の振動が悪影響を及ぼす可能性があるため、一般に、２０ｍｓよりも長くなく、その切替え間隔は、その試料領域が、その積分時間内に少なくとも一度は各方向から照明されるような長さにしなければならない。その切替え間隔が十分に小さい、例えば、５ｍｓ未満の場合には、各方向からの複数回の走査も実行可能である。

この構成は、両側からの試料の同時照明を可能にするものではないが、切替えミラー３４が非常に短い切替え間隔を有するということが、準同時照明を、必要な場合には、実現することを可能にする。この目的のためには、カメラの積分時間内に、一方の照明ビーム経路から他方へその照明を切替えればよく、その結果、実際にはその照明は順次的であるが、両側から同時に照明されているように、その試料は画像内に現れる。

その結果、アレイ検出器４の積分時間内に、その照明光が、一方の照明ビーム経路から他方へ、少なくとも一度は切替えられるため、実際には、試料領域Ｐ内の試料は、照明軸Ｘに沿って、両側から同時に照明される。

図６は、順次的照明が必須ではない、実施例としての試料３８を示す。図６ａは、散乱アーチファクトを伴わない理想的な試料イメージを示す。図６ｂは、左（Ｉ）および右（ＩＩ）からの片側光シート照明によって得られた実際のイメージを示す。ここでは、試料３８は、かなり散乱しているため、片側照明で生成された２つのイメージは、共通の構造を何ら示しておらず、この場合、仮にそうなったとしても、共通イメージの有意な生成は、ほとんど不可能である。これは、本質的に不透明なある程度の遮光性環境が、その試料の中央に存在する場合の事例でもある。これは、少なくとも部分的には、例えば、ゼブラフィッシュ胚の事例であり、この場合、胚の卵黄嚢が光を遮断する。より高速な画像記録からもたらされる潜在的な速度ゲインおよび後の画像処理の省略のため、ここでは、両側からの同時照明が意味をなす可能性がある。上述した高速切替えミラー３４を用いることにより、正真正銘の同時照明は可能ではないが、準同時記録は可能であり、それは、実質的に同時照明に相当する。そのカメラの積分時間中に、高速の切替えが行われ、それは、最終的な画像において、ユーザにはほとんど感知できない。

しかし、一方では、試料の正真正銘の同時照明が可能ではないということは、他のいくつかの試料で生じる欠点を避けることになるであろう。そのような試料は、図６に試料３９として示されており、それは、例えば、細胞塊であってもよい。図６ａは、その試料領域全域にわたってはっきりとした構造を有する理想的な試料イメージを示す。図６ｃは、左（Ｉ）および右（ＩＩ）からの片側光シート照明で得られた実際のイメージを示す。ここでは、散乱が顕著であるため、片側照明によって、その試料の全ての部分が可視のままであるが、左から右へのまたは右から左への品質損失は明らかである。ここでは、可能であれば、品質損失を避けるべきであるので、同時２ビーム照明は適切ではない。ここでは、順次的照明が、より意味をなす。しかし、順次的照明は、非常に素早く実施しなければならないため、検出方向Ｚにおけるイメージのスタックを記録する場合、個々の平面を両側から照明する可能性がある。電動切替えミラーは、品質を損なうことになる、そのミラーに振動が潜在的に伝わる状態で、長すぎる切替え間隔を有しており、一方、必要な高速切替え間隔、すなわち、１０ｍｓ未満の間隔は、高速検流計駆動ミラーを用いて容易に実現することができる。

図５に示す構成は、切替えミラー３４が、瞳面内に配置されているため、切替えミラー３４および走査対物レンズ２４の偏向によって生じる位置オフセットが、切替えのために利用されるという利点をさらに有する。当然、切替えのために角度オフセットが直接的に利用される他の構成も実現可能である。図示されている構成の別の利点は、検出方向Ｚにおける光シート調節に対して同時にわずかなオフセットを利用して、切替えミラー３４を用いることの可能性である。

また、図５に示す照明装置は、図示されてはいないが、例えば、走査ミラー２３および走査対物レンズ２４を用いた、その横軸に沿ったその試料領域の光シート状走査に用いられる回転対称光ビームを生成するための光のシートの生成手段と、それを用いて光のシートと照明軸との間の角度を変えることのできる、例えば、角度走査ミラー２８の形態の、任意の角度走査手段とを具備してもよい。

本願明細書においては、その照明装置が、一方の照明ビーム経路内に、または、他方の照明ビーム経路内に配置され、およびその切替えミラーまたはその走査ミラーの瞳面への正確な結像を意図された、非点収差的に作用する光学素子、好ましくは、円柱光学素子を具備することが有利である可能性がある。それら２つのミラーのうちの一方は、その瞳面に正確に結像されるが、他方のミラーの結像は、そのような追加的な非点収差的に作用する素子なしで正確にならず、その結果、これは、両ミラーの正確な結像のための光学補正系である。

そのアレイ検出器が、別々に読み出すことができ、およびそれに対して、異なる積分時間を指定することのできる画素の領域を有する場合、例えば、ＣＭＯＳ方式の最新のアレイ検出器を備えている場合には、興味深い適用が可能であろう。ここでは、その切替え素子の切替え間隔を、異なる３つの積分時間にも追加的に同期させることができる。このことは、図４に示す実施形態と組み合わせることも可能である。

図７および図８は、検出すべき光がそこに結像される空間分解アレイ検出器４または４’が、それぞれ、分岐ビーム経路１４および１５の各々に配置されており、およびその分割手段が、それぞれ、少なくとも１つのダイクロイックビームスプリッタ１３または４０を具備している、その検出ビーム経路を２つの分岐ビーム経路１４および１５に分割するための分割手段を示す。どちらの構成も、例えば、図１に図示されており、および図２に示すように、照明装置１９と組み合わせることのできる検出装置１に組込むことができる。

その検出ビーム経路の２つの分岐ビーム経路１４および１５への分割の結果、および放射フィルタおよびバンドパスフィルタを用いた励起光の同時抑制によって、異なるスペクトル域を、分岐ビーム経路１４、１５を介して検出することができる。このことは、例えば、その試料が、異なる色の蛍光色素分子で標識化されている場合に、いくつかの色範囲を記録することを可能にする。２色以上を使用する場合、励起線、およびおそらく、そのダイクロイックビームスプリッタ、バンドパスフィルタまたは放射フィルタを変えることにより、いわゆるマルチトラックモードで、連続的な記録を実行できる。

空間分解アレイ検出器４および４’は、ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、ＣＭＯＳチップ等とすることができ、それらは、ユーザが使用するカメラと一体化されてもよい。そのようなカメラを取付けるためには、異なる種類およびモデルのカメラの取付けを可能にする標準的なＣマウントインタフェース（図示せず）を設けることが好都合である。横方向に０．２ｍｍというＣマウント公差および方向性、すなわち、そのカメラのイメージ回転は、例えば、調節ねじによって補正することができる。

図７に示す実施形態において、ダイクロイックビームスプリッタ１３は、空間分解アレイ検出器４および４’を基準にして、近無限遠空間１２内のビーム経路内に配置されている。ダイクロイックビームスプリッタ１３は、少なくとも３ｍｍ、好ましくは、少なくとも４ｍｍの厚さを有する。このようにして、イメージアーチファクト、特に、従来技術において知られており、およびそのビームスプリッタ上の表面張力によって引き起こされるピンぼけおよび非点収差をなくすことができる。検出すべき光を、それぞれのアレイ検出器４、４’に結像するための光学結像素子５および５’は、それぞれ、２つの分岐ビーム経路１４および１５の各々に配置されている。

必要に応じて、光学結像素子５および５’は、ここに図示されているように、それぞれの分岐ビーム経路１４および１５内でシフト可能であるように配置することができ、その結果、各アレイ検出器への焦点合わせが可能になる。このことは、例えば、その検出光学系の長手方向の色収差を補正しなければならない場合に有利になる可能性がある。検出されるものは、個々のスペクトルまたは波長のみであるため、検出すべき波長に対する非常に緻密な適応が可能である。加えて、焦点シフトのための他の手段、例えば、検出ズーム素子６等を設けた場合には、２つの分岐ビーム経路のうちの一方に、シフト可能な結像素子を配置することで十分であり、他方の分岐ビーム経路内の素子は、固定することができる。

２つの分岐ビーム経路１４および１５のうちの少なくとも一方には、検出軸Ｚに垂直な２つの直交方向に沿って、ビームオフセットを生成するための少なくとも１つのウォッブルプレートも配置されている。１つのみのウォッブルプレートを使用する場合には、両直交方向で調節されることが必要である。２つのウォッブルプレートを、同等の効果を伴って使用することができる。それらのうちの一方は、一方の方向におけるビームオフセットを調節するために用いられ、また、他方は、それに直角な方向のビームオフセットを調節するために用いられる。図７は、２つのビーム経路の一方、すなわち、透過ビーム経路１４の場合の、検出軸Ｚに垂直な２つの相互に直交する方向に沿ってビームオフセットを生成するための２つのウォッブルプレート１６および１７を示す。

ウォッブルプレート１６は、例えば、Ｘ方向のビームオフセットを生成するために使用することができ、また、ウォッブルプレート１７は、Ｙ方向のビームオフセットを生成するために使用することができる。他方の分岐ビーム経路１５、すなわち、反射ビーム経路においては、ウォッブルプレートは必要ない。このようにして、２つの検出チャネルの画像重ね合わせを実現することができ、そのことは、その検出ビーム経路の中間像面内に配置され、かつその面内で選択可能な較正対物レンズを用いる前、または、適切な透過パターン、例えば、透過格子パターン７を用いる前に、較正が既に行われていれば、自動的に実施することもできる。そのビームオフセットが一旦決まると、両アレイ検出器４、４’の画像は、容易に重ね合わせることができ、ユーザには、その重ね合わせたものだけが示される。

光学結像素子５、５’のシフトを用いるだけではなく、そのビーム経路内に突出し、およびそのビーム方向に直角にシフトすることのできる２つの光学くさびからなるくさびアセンブリ４１を配置することによっても、焦点調節を実施することができる。それらのくさびは、互いの方向にまたは互いに離れて移動することのできる単純なガラス製のくさびである。このようにして、可変の追加的なガラス経路は、そのビーム経路内に、またはその経路から外れて移動され、そのことが、光学結像素子５または５’それぞれの焦点面の対応するシフトを引き起こす。くさびアセンブリ４１は、そのビーム経路の分岐部のそれぞれの光学結像素子５、５’と、各アレイ検出器４または４’との間に配置されているが、そのことは、図７には図示されていない。

２チャネル検出のための別の実施形態を図８に示す。ここでは、任意の厚さのダイクロイックビームスプリッタ４０が、結像ビーム経路の分岐部に、すなわち、光学結像素子５とアレイ検出器４および４’との間に配置されている。２つの分岐ビーム経路のうちの一方、すなわち、そのビームスプリッタによって伝送される光のための分岐ビーム経路１４には、ガラスプレート４２とビームスプリッタ４０との間の約９０°の角度で、アレイ検出器４とビームスプリッタ４０との間に、そのガラスプレート４２が配置されている。このガラスプレート４２は、ビームスプリッタ４０と同じ厚さを有しており、このようにして、伝送方向におけるビームスプリッタ４０によって引き起こされる非点収差が補正される。

好適な実施形態において、ガラスプレート４２は、２つのカメラチャネル間のオフセットを調節するためのウォッブルプレートとして同時に用いることができる。ガラスプレート４２は、その伝送ビーム経路内にのみ、すなわち、分岐ビーム経路１４内にのみ必要であり、ビームスプリッタ４０によって伝送された光をアレイ検出器４に結像する。図８の反射分岐ビーム経路１５には、上述したくさびアセンブリ４１が配置されており、それを用いて、（両矢印で示すように）２つのガラスくさびを互いの方向に、または互いに離れてシフトさせることにより、光学結像素子５の焦点面をシフトさせることができる。このようなくさびアセンブリ４１は、その伝送ビーム経路内にも配置することができ、この場合、例えば、これがシフト可能である必要がないように、光学結像素子５のシフト量を小さくすることができる。しかし、原理的には、シフト可能な光学結像素子５を有すること、および２つのビーム経路の一方にくさびアセンブリ４１を導入することで十分である。その結果、例えば、図８に示す実施例と同様に、伝送分岐ビーム経路のための焦点面は、光学結像素子５によってのみ変化し、一方、反射ビーム経路のための焦点面は、くさびアセンブリ４１によってさらに調節することができる。

前述した特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、上述した組合せだけではなく、他の組合せでも、あるいは、独立した特徴として適用可能であることを理解されたい。上述した個々の要素は、全て互いに組み合わせることができる。図示されている他の要素を用いることなく、個々の要素を用いることも可能であり、例えば、２つの分岐検出ビーム経路が同時に用いられている場合には、ズーム素子を用いることなく実施することができる。２つの方向からの照明の組合せは、２つのチャネルにおける検出と組み合わせることができ、また、これは、その照明および検出ズーム素子および同時内焦方式と組み合わせることができる。結局、上述した構成は、従来技術において知られている構成に優る実質的な改良を呈している。

１ 検出装置
２ 検出対物レンズ
３ チューブレンズユニット
４、４’ アレイ検出器
５、５’ 結像素子
６ 検出ズーム素子
７ 透過格子パターン
８ チューブレンズ
９、１０ 偏向ミラー
１１ ビーム結合器
１２ 近無限遠空間
１３ ビームスプリッタ
１４、１５ 分岐ビーム経路
１６、１７ ウォッブルプレート
１８ 放射フィルタ
１９ 照明装置
２０ 照明対物レンズ
２１ 照明ズーム素子
２２ 望遠鏡チェンジャー
２３ 走査ミラー
２４ 走査対物レンズ
２５ チューブレンズ素子
２６ ミラー
２７ 円柱光学素子
２８ 角度走査ミラー
２９、３０ ビーム経路
３１、３２ ビームセグメント
３３ 円柱光学素子
３４ 切替えミラー
３５ 照明ビーム経路
３６ 別の照明ビーム経路
３７ 偏向ミラー
３８、３９ 試料
４０ ビームスプリッタ
４１ くさびアセンブリ
４２ ガラスプレート

Claims (6)

1. 顕微鏡であって、
   照明装置（１９）であって、該照明装置を用いて、試料領域（Ｐ）を照明するための光のシートが生成され、該光のシートが、照明ビーム経路（３５）の照明軸（Ｘ）の方向、および前記照明軸（Ｘ）に交差して位置する横軸（Ｙ）の方向において、略平面状に延在している、前記照明装置（１９）と、
   検出ビーム経路の検出軸（Ｚ）に沿って、前記試料領域（Ｐ）から放射される光を検出するために用いられる検出装置（１）であって、照明軸（Ｘ）と検出軸（Ｚ）との間の角度、および横軸（Ｙ）と検出軸（Ｚ）との間の角度がゼロではない、前記検出装置（１）とを備え、
   前記照明装置（１９）が、照明光を別の照明ビーム経路（３６）内に偏向させ、前記照明軸（Ｘ）の方向および前記横軸（Ｙ）の方向において、略平面状に延在する別の光のシートを生成するための手段を含み、前記照明ビーム経路（３５）と、前記別の照明ビーム経路（３６）とが、本質的に同一の光学素子で構成され、かつ等しい光学波長を有し、前記光のシートと、前記別の光のシートとは、それらが、同じ照明軸（Ｘ）上の逆方向から前記試料領域（Ｐ）を照らすように互いに対して位置合わせされており、
   前記照明装置（１９）は、前記照明ビーム経路（３５）と前記別の照明ビーム経路（３６）との間で、前記照明光を切替えるための切替え手段をさらに含み、
   前記検出装置（１）は、前記試料領域（Ｐ）から放射される光を、光の位置依存検出のための空間分解アレイ検出器（４）に結像するための検出対物レンズ（２）を含む、顕微鏡において、
   前記切替え手段は、１０ｍｓ未満の切替間隔を有する素早く切替可能な切替え素子を含み、前記アレイ検出器（４）の所定の積分時間と、前記切替え素子の切替間隔とは、前記試料領域（Ｐ）が、前記積分時間中に、前記照明軸（Ｘ）上の各方向から少なくとも一度は照明されるように互いに調整されていることを特徴とする顕微鏡。
2. 前記切替え素子は、好ましくは検流計駆動部を有する切替えミラー（３４）として設計されることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡。
3. 切替えミラー（３４）が、照明瞳の平面と共役である平面内に配置されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記照明装置（１９）が、光のシートの生成のための手段を含み、該生成のための手段が、回転対称光ビームを生成するための手段と、前記横軸（Ｙ）に沿った前記試料領域（Ｐ）の光シート状走査のための走査手段と、角度走査手段であって、該角度走査手段を用いて前記光のシートと前記照明軸（Ｘ）との間の角度を変えることができる、前記角度走査手段とを含む、顕微鏡において、前記走査手段が、素早く切替可能な走査ミラー（２３）と走査対物レンズ（２４）とを含み、前記角度走査手段が、素早く切替可能な角度走査ミラー（２８）を含むことを特徴とする、請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
5. 前記照明装置（１９）は、非点収差的に作用する光学素子、好ましくは円柱光学素子（３３）を含み、前記非点収差的に作用する光学素子は、前記照明ビーム経路内および前記別の照明ビーム経路内のうちの少なくとも一方に配置され、前記非点収差的に作用する光学素子は、瞳面への切替えミラー（３４）または走査ミラー（２３）の正確な結像のためのものであることを特徴とする、請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
6. 前記試料領域（Ｐ）は、前記アレイ検出器（４）の積分時間中に、前記照明光が一方の照明ビーム経路から別の照明ビーム経路へ少なくとも一度は切替えられるように、前記照明軸（Ｘ）に沿って反対方向から実質的に同時に照明されることを特徴とする、請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載の顕微鏡を用いた画像の記録のための方法。

Images