JP7101561B2 - 二光子顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、二光子顕微鏡に関する。

非特許文献１は、顕微鏡システムを開示する。顕微鏡システムは、レーザを走査する光学装置と、制御装置と、を備えている。光学装置は、励起光としてのレーザを観察試料に照射する。そして、顕微鏡システムは、当該レーザに起因して発生する蛍光を検出する。

"光計測スキャンブロック"、[online]、平成２９年１１月、浜松ホトニクス株式会社、［平成３０年７月２日検索］、インターネット<URL:https://www.hamamatsu.com/resources/pdf/etd/C10516_TPMO1057J.pdf>

従来、再生医療分野などでは、平面培養によって得られたいわゆる二次元細胞が用いられていた。近年は、オルガノイド（ミニ組織）およびスフェロイド（細胞塊）が注目されている。これらの組織及び細胞塊は、二次元細胞と生体組織との中間的な性質を有する。そして、各種の細胞を基に、マイクロメートルオーダーのミニ組織及び細胞塊が作出されている。これらのミニ組織及び細胞塊は、より臨床検体に近い試料として、創薬分野及び医療分野への利用が期待されている。

細胞塊を利用する場合には、細胞塊の深部に位置する細胞の状態を観察することもある。細胞の観察には、例えば、非特許文献１が開示するような顕微鏡システムが用いられる。顕微鏡システムは、励起光の照射に起因する蛍光を利用して、蛍光像を得る。つまり、細胞を観察する際には、細胞塊の表面だけでなく、細胞塊の内部にまで励起光の照射が行われる。

しかし、例えば、細胞塊の内部では、光散乱あるいは光吸収が生じるので、励起に要するエネルギを持った光を細胞塊の深部に届けることは難しい。また、励起光のエネルギを高めると、細胞を損傷させてしまうおそれも生じる。つまり、細胞塊が大きくなるにしたがって、細胞塊の深部まで良好に観察することが難しくなる。

そこで、本発明は、細胞塊に与える影響を抑制しつつ、良好な観察結果を得ることが可能な二光子顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の一形態に係る二光子顕微鏡は、パルスレーザを出射する光源と、パルスレーザを受け入れて、試料に対するパルスレーザの照射位置が二次元平面内において移動するように、パルスレーザの進行方向を変化させる走査部と、走査部から受け入れたパルスレーザを分岐して、第１分岐レーザ及び第２分岐レーザを形成する分岐部と、軸線上において互いに離間して配置された第１及び第２対物レンズを有する照射部であって、第１対物レンズは、軸線上に配置された試料と交差する第１走査平面に第１分岐レーザを集光し、第２対物レンズは、試料と交差すると共に第１走査平面に対して平行に離間する第２走査平面に第２分岐レーザを集光する、照射部と、第１分岐レーザに起因して試料から出射された第１被計測光を検出する第１検出部と、第２分岐レーザに起因して試料から出射された第２被計測光を検出する第２検出部と、走査部から第１及び第２対物レンズに至る光路上に設けられた焦点調整部と、を備え、分岐部から第１対物レンズに至る光路長は、分岐部から第２対物レンズに至る光路長と等しく、軸線の方向から見た場合に、第１走査平面における第１分岐レーザの照射位置は、第２走査平面における第２分岐レーザの照射位置と重複する。

光源から出射されたパルスレーザは、走査部において進行方向が変化させられた後に、分岐部において分岐される。この構成によれば、第１分岐レーザによる走査と、第２分岐レーザによる走査と、を精度よく同期させることができる。そして、分岐部から第１及び第２対物レンズまでの光路長が互いに等しい。そうすると、第１及び第２分岐レーザは、分岐されてから照射されるまでの条件が一致する。つまり、試料に入射する直前までの第１及び第２分岐レーザの状態を揃えることができる。また、第１及び第２対物レンズは、互いに離間するとともに試料を挟むように配置されている。この配置によれば、第１及び第２分岐レーザは、互いに異なる方向から試料に照射される。その結果、試料の表面から焦点に至る長さを短縮することができる。試料表面から焦点に至る長さが短くなることにより、第１及び第２分岐レーザの散乱等の発生が低減される。つまり、試料に入射してから焦点に至るまでの第１及び第２分岐レーザの状態を揃えることができる。さらに、第１被計測光は、第１照射部を介して第１検出部に入射する。同様に、第２被計測光は、第２照射部を介して第２検出部に入射する。つまり、第１及び第２被計測光は、互いに干渉し合うことなく、それぞれ独立の光路を経て、第１及び第２検出部に入射する。従って、第１及び第２被計測光は、発生してから第１及び第２検出部に入射するまでの条件が一致する。その結果、試料に入射する直前までの状態と、試料に入射してから焦点に至るまでの状態と、が第１及び第２分岐レーザの間で揃うので、被計測光を発生させる励起条件に差異が生じない。さらに、被計測光は、第１及び第２検出部に入射するまでの条件が整った光路を経て第１及び第２検出部に入射する。従って、被計測光の強度に差異が生じることを抑制できるので、良好な観察結果を得ることができる。

一形態において、焦点調整部は、分岐部から第１対物レンズに至る光路上に設けられた第１焦点可変レンズと、分岐部から第２対物レンズに至る光路上に設けられた第２焦点可変レンズと、を含んでもよい。この構成によれば、第１及び第２分岐レーザのそれぞれに焦点調整のためのレンズが配置される。従って、第１及び第２分岐レーザの焦点位置を、それぞれ独立に調整することができる。

一形態において、焦点調整部は、走査部から分岐部に至る光路上に設けられた第３焦点可変レンズを含んでもよい。この構成によれば、分岐前のパルスレーザに対して焦点調整のためのレンズが配置される。従って、一つのレンズによって、第１及び第２分岐レーザの両方について焦点位置を調整することができる。

一形態において、光源は、波長可変型パルスレーザであるレーザを出射してもよい。この構成によれば、良好な励起光を提供することができる。

一形態において、光源は、第１波長を有する第１レーザを生成する第１光出射部と、第１波長とは異なる第２波長を有する第２レーザを生成する第２光出射部と、第１光出射部から第１レーザを受け入れると共に第２光出射部から第２レーザを受け入れて、第１レーザと第２レーザが合波された第３レーザを出射する第３光出射部と、を含んでもよい。この構成によれば、異なる波長を有する合波レーザを試料に照射することができる。

一形態において、第１検出部は、第１被計測光を受ける第１受光部と、試料から第１受光部へ至る光路上に配置された第１フィルタと、を有し、第２検出部は、第２被計測光を受ける第２受光部と、試料から第２受光部へ至る光路上に配置された第２フィルタと、を有してもよい。この構成によれば、互いに異なる波長を有する第１及び第２被計測光を好適に受光することができる。

本発明によれば、細胞塊に与える影響を抑制しつつ、良好な観察結果を得ることが可能な二光子顕微鏡が提供される。

図１は、第１実施形態に係る二光子顕微鏡の構成を示す図である。 図２は、細胞塊へ分岐レーザを照射する様子を示す斜視図である。 図３の（ａ）部、（ｂ）部、（ｃ）部及び（ｄ）部は、第１実施形態に係る二光子顕微鏡の動作を示す図である。 図４は、三次元画像を形成する動作を示す図である。 図５は、第２実施形態に係る二光子顕微鏡の構成を示す図である。 図６の（ａ）部、（ｂ）部及び（ｃ）部は、第２実施形態に係る二光子顕微鏡の動作を示す図である。 図７は、変形例１に係る二光子顕微鏡の構成を示す図である。 図８は、変形例２に係る二光子顕微鏡の構成を示す図である。 図９は、変形例３に係る二光子顕微鏡の構成を示す図である。

以下、添付図面を参照しながら本発明を実施するための形態を詳細に説明する。図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

図１に示すように、二光子顕微鏡１は、励起光を細胞塊１００（試料）に照射する。細胞塊１００には、蛍光プローブを用いた染色処理が施されている。その結果、励起光を照射すると、蛍光プローブを取り込んだ細胞塊１００が蛍光を発する。当該蛍光を検出することにより、細胞塊１００の画像が得られる。

二光子顕微鏡１は、光学系として、光源２と、レーザ走査部３（走査部）と、レーザ分岐部４（分岐部）と、レーザ照射部６（照射部）と、蛍光検出部７と、を有する。また、二光子顕微鏡１は、制御系としてコントローラ８を有する。さらに、二光子顕微鏡１は、処理系としてコンピュータ９を有する。

以下の説明において、入力、出力、入出力との用語を用いることがある。入力は、レーザを受け入れる仮想的な点を意味し、出力は、レーザを出射する仮想的な点を意味し、入出力はレーザを受け入れ及び出射する仮想的な点を意味する。入力、出力、入出力は、説明の便宜上用いる用語であり、実際の装置において、物理的な存在を要することはない。要するに、入力、出力、入出力との用語は、各構成要素においてレーザの出射及び受け入れを単に説明するものである。

光源２は、励起光としてのレーザＬを発生させる。光源２は、レーザ装置２ｓを含む。レーザ装置２ｓが出射するレーザＬは、パルスレーザであり、より詳細には、フェムト秒レーザである。なお、レーザＬは、励起の態様に応じて、適宜所望の特性を有するものを利用してよい。例えば、パルス幅は、所望の値に設定してよい。光源２が出射したレーザＬは、レーザ走査部３に入射する。つまり、光源２の出力２ａは、レーザ走査部３の入力３ａに対して光学的に接続されている。なお、光源２の出力２ａからレーザ走査部３の入力３ａに至る光路Ｐ１には、必要に応じて補助光学部１１を配置してもよい。補助光学部１１としては、例えば、一対のコリメータレンズ１２があげられる。

スキャンブロックであるレーザ走査部３は、ミラー１３Ａ、１３Ｂと、レンズ１５と、を含む。レーザ走査部３は、入力３ａからレーザＬを受け入れる。次に、レーザ走査部３は、細胞塊１００に対するレーザＬの照射位置が二次元平面内において移動するように、レーザＬの進行方向を変化させる。そして、レーザ走査部３は、レンズ１５を介して出力３ｂからレーザＬを出射する。レンズ１５は、例えばｆθレンズ（ｆθlens）である。ｆθレンズは、複数枚の凸レンズと凹レンズとの組み合わせにより構成される。従って、レーザＬは、入力３ａ、ミラー１３Ａ、１３Ｂ、レンズ１５及び出力３ｂの順に通過する。レーザ走査部３は、いわゆるスキャナである。レーザＬの進行方向を変化させる構成は、特に制限はない。例えば、当該構成は、一対のミラー１３Ａ、１３Ｂとしてもよい。入力３ａから受け入れたレーザＬに対するミラー１３Ａ、１３Ｂの角度を適宜制御することにより、出力３ｂから出射されるレーザＬの進行方向が所望の方向に設定される。ミラー１３Ａ、１３Ｂの動作は、コントローラ８から提供される制御信号φ１によって制御される。レーザ走査部３は、一対のミラー１３Ａ、１３Ｂを有するので、照射位置を二次元状に移動させることができる。

レーザ走査部３が出射したレーザＬは、レーザ分岐部４に入射する。つまり、レーザ走査部３の出力３ｂは、レーザ分岐部４の入力４ａに対して光学的に接続されている。なお、レーザ走査部３の出力３ｂからレーザ分岐部４の入力に至る光路Ｐ２にも、補助光学部１４が配置されている。補助光学部１４は、結像レンズ１６を有する。

レーザ分岐部４は、レーザ走査部３から受け入れたレーザＬを分岐する。例えば、レーザ分岐部４は、ハーフミラー１７を有する。ハーフミラー１７は、入力４ａから受け入れたレーザＬの一部を反射するとともに別の一部を透過する。反射したレーザは、分岐レーザＬ１（第１分岐レーザ）である。透過したレーザは、分岐レーザＬ２（第２分岐レーザ）である。分岐レーザＬ１は、出力４ｂから出射され、分岐レーザＬ２は、出力４ｃから出射される。

レーザ分岐部４が出射した分岐レーザＬ１、Ｌ２は、光学系１８、１９を介してレーザ照射部６に入射する。具体的には、レーザ分岐部４の出力４ｂは、光学系１８によってレーザ照射部６に対して光学的に接続されている。同様に、レーザ分岐部４の出力４ｃは、光学系１９によってレーザ照射部６に対して光学的に接続されている。例えば、一方の光学系１８は、ミラー２１を有する。出力４ｂから出射された分岐レーザＬ１は、光学系１８の入力１８ａに受け入れられる。受け入れられた分岐レーザＬ１は、ミラー２１によって反射される。そして、反射された分岐レーザＬ１は、出力１８ｂからレーザ照射部６の入力２４ａに導かれる。また、他方の光学系１９は、ミラー２２、２３を有する。レーザ分岐部４の出力４ｃから出射された分岐レーザＬ２は、光学系１９の入力１９ａに受け入れられる。受け入れられた分岐レーザＬ２は、ミラー２２、２３によって反射される。反射された分岐レーザＬ２は、出力１９ｂからレーザ照射部６の入力２６ａに導かれる。

ここで、光路Ｐ３、Ｐ４を規定する。光路Ｐ３は、光学系１８によって形成される。より厳密には、光路Ｐ３は、ハーフミラー１７から入力２４ａまでの経路である。光路Ｐ４は、光学系１９によって形成される。より厳密には、光路Ｐ４は、ハーフミラー１７から入力２６ａまでの経路である。そして、光路Ｐ３の光路長は、光路Ｐ４の光路長と等しい。実施形態に例示される構成では、光路Ｐ３の光路長は固定されている。一方、光路Ｐ４の光路長は、調整が可能である。例えば、光学系１９のミラー２２、２３のいずれか一方の位置および角度を制御することにより、光路Ｐ４の光路長を調整できる。

レーザ照射部６は、分岐レーザＬ１、Ｌ２を細胞塊１００に照射する。レーザ照射部６は、一対の照射ユニット２４、２６を有する。照射ユニット２４、２６は、互いに同様の構成を有する。一方の照射ユニット２４は、一方の分岐レーザＬ１のためのものであり、他方の照射ユニット２６は、他方の分岐レーザＬ２のためのものである。一方の照射ユニット２４は、他方の照射ユニット２６に対して向き合うように配置されている。そして、一方の照射ユニット２４が分岐レーザＬ１を照射する方向は、他方の照射ユニット２６が分岐レーザＬ２を照射する方向と逆方向である。この「逆方向」とは、例えば、同一の仮想線上において、正の方向と負の方向との関係のような厳密な関係に限定されない。また、一対の照射ユニット２４、２６が向き合う方向は、特に限定されない。例えば、照射ユニット２４、２６を上下方向に配置してもよい。つまり、照射ユニット２４を上側、照射ユニット２６を下側に配置してもよい。また、例えば、照射ユニット２４、２６を左右方向に配置してもよい。さらに、照射ユニット２４、２６を配置する方向は、鉛直方向または水平方向に対して斜めでもよい。

なお、本実施形態では、分岐レーザＬ１、Ｌ２の両方を励起光として利用する。例えば、一方の分岐レーザＬ１を励起光として利用し、他方の分岐レーザＬ２を別の目的に利用してもよい。例えば、分岐レーザＬ２を刺激光として用いてもよい。

照射ユニット２４は、ダイクロイックミラー２７と、対物レンズ２８（第１対物レンズ）と、を有する。レーザ照射部６の入力２４ａから入出力２４ｂに至る光路Ｐ５において、入力２４ａ側から順にダイクロイックミラー２７、後述する焦点調整部２９、対物レンズ２８の順に配置されている。つまり、入力２４ａから受け入れられた分岐レーザＬ１は、まず、ダイクロイックミラー２７に入射し、次に、焦点調整部２９を通過し、次に、対物レンズ２８を通過して、最後に入出力２４ｂから出射される。同様に、照射ユニット２６も、ダイクロイックミラー３１と、対物レンズ３２（第２対物レンズ）と、を有する。レーザ照射部６の入力２６ａから入出力２６ｂに至る光路Ｐ６において、入力２６ａの側から順にダイクロイックミラー３１、焦点調整部３３及び対物レンズ３２の順に配置されている。

ダイクロイックミラー２７、３１は、分岐レーザＬ１、Ｌ２を全反射するとともに、後述する蛍光Ｆ１、Ｆ２を全透過する。ダイクロイックミラー２７、３１は、分岐レーザＬ１、Ｌ２の進行方向が対物レンズ２８、３２の光軸にそれぞれ沿うように、設けられている。

ここで、照射ユニット２４、２６は、互いに向き合っていること、および、分岐レーザＬ１、Ｌ２の出射方向が互いに逆向きであることはすでに述べた。これらの点は、例えば、対物レンズ２８、３２の位置関係を用いて説明してもよい。

図２に示すように、まず、基準となる軸線Ｓ１を定義する。観察時において細胞塊１００は、軸線Ｓ１上に配置される。そして、対物レンズ２８、３２もそれぞれ軸線Ｓ１上に配置される。より詳細には、対物レンズ２８、３２は、軸線Ｓ１上において互いに離間して配置される。さらに、対物レンズ２８の光軸は軸線Ｓ１と重複する。同様に、対物レンズ３２の光軸も軸線Ｓ１と重複する。細胞塊１００は、対物レンズ２８、３２の間に配置される。

一方の対物レンズ２８は、照射位置Ｔ１に分岐レーザＬ１を集光する。照射位置Ｔ１は、走査平面Ｃ１（第１走査平面）に含まれる。走査平面Ｃ１は、軸線Ｓ１上に配置された細胞塊１００と交差する。他方の対物レンズ３２は、照射位置Ｔ２に分岐レーザＬ２を集光する。照射位置Ｔ２は、別の走査平面Ｃ２（第２走査平面）に含まれる。別の走査平面Ｃ２は、細胞塊１００と交差すると共に走査平面Ｃ１に対して平行に離間する。

再び図１を参照する。照射ユニット２４、２６は、蛍光Ｆ１、Ｆ２を検出ユニット３６（第１検出部）、検出ユニット３７（第２検出部）に導く光路である。具体的には、細胞塊１００において生じた蛍光Ｆ１は、入出力２４ｂから照射ユニット２４へ入射する。次に、蛍光Ｆ１は、対物レンズ２８、焦点調整部２９及びダイクロイックミラー２７を介して出力２４ｃから出射される。そして、出射された蛍光Ｆ１は、蛍光検出部７の入力３６ａに入射する。また、蛍光Ｆ２も同様の経路を経て、蛍光検出部７の入力３７ａに入射する。

焦点調整部２９、３３は、細胞塊１００に対する焦点位置を制御する。焦点調整部２９は、レーザ走査部３から対物レンズ２８に至る光路Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５上に設けられていればよい。同様に、焦点調整部３３は、レーザ走査部３から対物レンズ２８に至る光路Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６上に設けられていればよい。本実施形態において、焦点調整部２９、３３は、レーザ照射部６に設けられている。より詳細には、焦点調整部２９は、照射ユニット２４において、ダイクロイックミラー２７と対物レンズ２８との間に配置されている。焦点調整部３３は、照射ユニット２６において、ダイクロイックミラー３１と対物レンズ３２との間に配置されている。

焦点調整部２９、３３は、例えば、液体レンズである焦点可変レンズ３４（第１焦点可変レンズ、第２焦点可変レンズ）を含む。焦点調整部２９、３３は、例えば、外部から提供される制御信号φ２、φ３に応じて焦点可変レンズ３４の屈折率を変化させる。この動作によって、焦点位置を変更することができる。ここでいう焦点位置とは、入出力２４ｂから出射される分岐レーザＬ１の方向に沿った位置である。また、焦点位置とは、入出力２６ｂから出射される分岐レーザＬ２の方向に沿った位置であるとも言える。換言すると、焦点位置とは、細胞塊１００の表面からの深さ位置であると言ってもよい。つまり、焦点調整部２９、３３は、軸線Ｓ１に沿った走査平面Ｃ１、Ｃ２の位置を制御する。なお、走査平面Ｃ１、Ｃ２の面内における照射位置の制御は、レーザ走査部３によりなされる。

蛍光検出部７は、分岐レーザＬ１、Ｌ２に起因して細胞塊１００から出射された蛍光Ｆ１（第１被計測光）及び蛍光Ｆ２（第２被計測光）を検出する。具体的には、蛍光検出部７は、一対の検出ユニット３６、３７を有する。検出ユニット３６は、一方の蛍光Ｆ１を検出する。検出ユニット３７は、他方の蛍光Ｆ２を検出する。

検出ユニット３６は、一方の照射ユニット２４に対応する。具体的には、検出ユニット３６は、照射ユニット２４の出力２４ｃに対して光学的に接続される。つまり、照射ユニット２４の出力２４ｃから出射された蛍光Ｆ１は、検出ユニット３６の入力３６ａに入射する。検出ユニット３６は、フィルタ３８（第１フィルタ）、レンズ３９と、センサ４１（第１受光部）と、を有する。入力３６ａから受け入れられた蛍光Ｆ１は、フィルタ３８、レンズ３９の順に通過し、最後にセンサ４１に入射する。フィルタ３８は、ノイズとなり得るレーザＬの入射を抑制する。レンズ３９は、センサ４１の受光部に蛍光Ｆ１を集光する。センサ４１は、受け入れた蛍光Ｆ１の強度に応じた電気信号を生成する。当該電気信号は、出力３６ｂを介して、コンピュータ９に送信される。

他方の検出ユニット３７は、他方の照射ユニット２６に対応する。具体的には、検出ユニット３７の入力３７ａは、照射ユニット２６の出力２６ｃに対して光学的に接続される。検出ユニット３７は、フィルタ３８Ａ（第２フィルタ）、レンズ３９Ａと、センサ４１Ａ（第２受光部）と、を有する。なお、他方の検出ユニット３７の構成部品は、検出ユニット３６と同様であるので、重複する説明は省略する。

なお、二光子励起の場合、例えば１０５０ナノメートルである近赤外波長のレーザを用いて、その半分の波長によって蛍光粒子を励起する。光電子増倍管は、当該励起波長に感度を有しない。従って、レーザＬはノイズとはならない。一方、アバランシェフォトダイオード（avalanche photodiode：APD）又はマルチピクセルフォトンカウンター（Multi-Pixel Photon Counter：MPPC）といった半導体光検出器を用いる場合には、レーザカットフィルタによりノイズとなり得るレーザを遮断する。

コントローラ８は、上述したようにレーザ走査部３に対して制御信号φ１を提供する。レーザ走査部３への制御信号φ１の提供によって、走査平面Ｃ１、Ｃ２上における照射位置の移動が行われる。さらに、コントローラ８は、一方の焦点調整部２９に対して制御信号φ２を提供すると共に、他方の焦点調整部３３に対して制御信号φ３を提供する。焦点調整部２９、３３への制御信号φ２、φ３の提供によって、細胞塊１００に対する走査平面Ｃ１、Ｃ２の深さ位置が変更される。つまり、コントローラ８は、走査平面Ｃ１、Ｃ２の位置と走査平面Ｃ１、Ｃ２上における照射位置と、を制御することにより、三次元的な走査を実現する。なお、レーザ走査部３のためのコントローラは、焦点調整部２９、３３のためのコントローラとは別の装置であってもよい。つまり、二光子顕微鏡１は、レーザ走査部３のための第１コントローラと、焦点調整部２９、３３のための第１コントローラとは別の第２コントローラを有してもよい。

コンピュータ９は、センサ４１、４１Ａから受け入れた電気信号を利用して、蛍光像を得る。この蛍光像は、細胞塊１００の二次元像または三次元像である。コンピュータ９の具体的な動作は、後述する。

以下、二光子顕微鏡１の動作について説明する。具体的には、コントローラ８による走査と、コンピュータ９による画像合成動作と、について説明する。

図３の（ａ）部に示すように、軸線Ｓ１には、基準点ＴＣが設定されている。基準点ＴＣは、対物レンズ２８の焦点と、対物レンズ３２の焦点と、が一致する点である。対物レンズ２８の同焦点距離Ｍ１と対物レンズ３２の同焦点距離Ｍ２とが互いに等しいならば、基準点ＴＣは、対物レンズ２８、３２の軸線Ｓ１上における中点である。細胞塊１００は、軸線Ｓ１上において基準点ＴＣを含むように配置されている。

まず、コントローラ８は、走査平面Ｃ１、Ｃ２の初期位置を設定する。コントローラ８は、焦点調整部２９に制御信号φ２を提供するとともに、焦点調整部３３に制御信号φ３を提供する。これら制御信号φ２、φ３によって、軸線Ｓ１方向における走査平面Ｃ１、Ｃ２の位置が設定される。細胞塊１００の一方側（ここでは上側）に配置された走査平面Ｃ１は、基準点ＴＣから距離Ｄ１ａだけ離間した位置に設定される。細胞塊１００の他方側（ここでは下側）に配置された走査平面Ｃ２も同様に、基準点ＴＣから距離Ｄ２ａだけ離間した位置に設定される。なお、距離Ｄ１ａは、距離Ｄ２ａと等しい（Ｄ１＝Ｄ２）。

次に、コントローラ８は、初期位置に設定された走査平面Ｃ１、Ｃ２における走査を行う。具体的には、コントローラ８は、レーザ走査部３に対して制御信号φ１を提供し、走査平面Ｃ１、Ｃ２における走査を開始する。ここで、レーザ走査部３は、レーザ分岐部４よりも上流側に配置されている。換言すると、走査状態において、レーザ分岐部４に入射するレーザＬの進行方向は、連続的に変化している。そして、進行方向が変化しているレーザＬが、レーザ分岐部４によって分岐される。その結果、分岐レーザＬ１、Ｌ２の動きは、互いに同期している。従って、図２に示すように、軸線Ｓ１の方向から走査平面Ｃ１、Ｃ２を見た場合に、走査平面Ｃ１における分岐レーザＬ１の照射位置Ｔ１は、走査平面Ｃ２における分岐レーザＬ２の照射位置Ｔ２と常に重複する。走査平面Ｃ１、Ｃ２における走査が完了した後、次に、コントローラ８は、レーザ走査部３に対して制御信号φ１を提供し、走査を停止する。

次に、コントローラ８は、走査平面Ｃ１に関する再設定動作を行う。再設定動作とは、基準点ＴＣから軸線Ｓ１に沿った走査平面Ｃ１の位置を変更する動作をいう。より詳細には、分岐レーザＬ１の軸線Ｓ１に沿った集光位置を変更する動作をいう。

ここで、本実施形態の二光子顕微鏡１は、照射ユニット２４、２６のそれぞれについて焦点調整部２９、３３を設けた。換言すると、一方の分岐レーザＬ１に焦点可変レンズ３４が設けられ、他方の分岐レーザＬ２にも焦点可変レンズ３４が設けられた。そして、焦点調整部２９、３３の動作は、互いに独立している。つまり、分岐レーザＬ１、Ｌ２は、深さ方向における焦点位置を互いに独立して制御可能である。ここでいう深さ方向とは、図３の（ａ）部において、基準点ＴＣを原点とした軸線Ｓ１に沿った距離（距離Ｄ１ａ、Ｄ２ａ）である。換言すると、分岐レーザＬ１の走査平面Ｃ１の位置と、分岐レーザＬ２の走査平面Ｃ２の位置と、は、互いに独立に制御することができる。例えば、走査平面Ｃ１、Ｃ２のいずれか一方のみを移動させてもよい。なお、走査平面Ｃ１、Ｃ２の両方を移動させてもよい。

図３の（ｂ）部に示すように、コントローラ８は、一方の焦点調整部２９に制御信号φ２を提供する。その結果、分岐レーザＬ１の集光位置は、変化する。具体的には、集光位置は、基準点ＴＣから距離Ｄ１ａだけ離間した位置から、基準点ＴＣから距離Ｄ１ｂだけ離れた位置に変化する。なお、距離Ｄ１ｂは、距離Ｄ１ａより短い。集光位置は、軸線Ｓ１における走査平面Ｃ１の一部である。従って、分岐レーザＬ１が基準点ＴＣから距離Ｄ１ｂだけ離れた位置に集光されるということは、換言すると、分岐レーザＬ１の走査平面Ｃ１が基準点ＴＣから距離Ｄ１ｂだけ離れた位置に設定されたことになる。なお、他方の焦点調整部３３は、走査平面Ｃ２の位置を維持する。

次に、コントローラ８は、走査平面Ｃ１における走査を行う。具体的には、コントローラ８は、レーザ走査部３に制御信号φ１を提供して、走査を行う。

以下、走査平面Ｃ１に関する再設定動作と、走査と、を繰り返す。このとき、コントローラ８は、再設定動作を繰り返すごとに、走査平面Ｃ１から基準点ＴＣまでの距離が小さくなるように走査平面Ｃ１を設定する。換言すると、再設定ごとに、走査平面Ｃ１は、基準点ＴＣに近づいていく。そして、図３の（ｃ）部に示すように、走査平面Ｃ１から基準点ＴＣまでの距離がゼロとなったとき、走査平面Ｃ１に関する再設定動作と、走査と、を終了する。

次に、コントローラ８は、走査平面Ｃ２に関する再設定動作と、走査と、を行う。これらの動作も、上述した走査平面Ｃ１に関する再設定動作及び走査と同様である。そして、そして、図３の（ｄ）部に示すように、走査平面Ｃ２から基準点ＴＣまでの距離がゼロとなったとき、走査平面Ｃ２に関する再設定動作と、走査と、を終了する。

＜画像合成動作＞
画像合成動作は、処理装置であるコンピュータ９によって行われる。上述した走査によれば、複数枚のスライス画像が得られる。例えば、図４におけるスライス画像ＧＮ（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）は、走査平面Ｃ１（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）に関する走査によって得られた画像の例示である。スライス画像ＧＭ（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）は、走査平面Ｃ２（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）に関する走査によって得られた画像の例示である。ここで、走査平面Ｃ１（６）及び走査平面Ｃ２（６）は、それぞれ基準点ＴＣ（図３参照）を含む。つまり、走査平面Ｃ１（６）及び走査平面Ｃ２（６）は、実質的には、同一である。

コンピュータ９は、スライス画像ＧＮ（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）を用いて細胞塊１００の三次元画像ＴＤ１を再構築する。再構築には、所望の画像処理プログラムを用いてよい。三次元画像ＴＤ１は、基準点ＴＣを含む基準平面と照射ユニット２４との間に存在する細胞塊１００の領域を示す。例えば、三次元画像ＴＤ１が示す部分は、細胞塊１００の上側半分であるともいえる。同様に、コンピュータ９は、スライス画像ＧＭ（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）を用いて細胞塊１００の三次元画像ＴＤ２を再構築する。三次元画像ＴＤ２は、基準点ＴＣを含む基準平面と照射ユニット２６との間に存在する細胞塊１００の領域を示す。例えば、三次元画像ＴＤ２が示す部分は、細胞塊１００の下側半分であるともいえる。つまり、三次元画像ＴＤ２が示す細胞塊１００の領域は、三次元画像ＴＤ１と異なる。そこで、三次元画像ＴＤ１、ＴＤ２を合成して一つの三次元画像ＴＤ３を生成する。

ところで、図２等を用いて説明したように、分岐レーザＬ１、Ｌ２の照射位置Ｔ１、Ｔ２は、軸線Ｓ２の方向から見て互いに重複している。二光子顕微鏡１では、レーザ走査部３を経たレーザＬをレーザ分岐部４で分岐しているので、この重複は、走査状態においても成り立つ。そうすると、検出ユニット３６によって得られるスライス画像ＧＮ（ａ）におけるＸＹ座標は、検出ユニット３７によって得られるスライス画像ＧＭ（ａ）のＸＹ座標と一致する。従って、スライス画像ＧＮ（ａ）及びスライス画像ＧＭ（ａ）の対応関係が明確であるので、スライス画像ＧＮ（ａ）による三次元画像ＴＤ１と、スライス画像ＧＭ（ａ）による三次元画像ＴＤ２と、を精度よく且つ容易に合成することができる。

＜作用効果＞
光源２から出射されたレーザＬは、レーザ走査部３において進行方向が変化させられた後に、レーザ分岐部４において分岐される。この構成によれば、分岐レーザＬ１による走査と、分岐レーザＬ２による走査と、を精度よく同期させることができる。そして、レーザ分岐部４から対物レンズ２８、３２における瞳までの光路長が互いに等しい。そうすると、分岐レーザＬ１、Ｌ２は、分岐されてから照射されるまでの条件が一致する。つまり、細胞塊１００に入射する直前までの分岐レーザＬ１、Ｌ２の状態を揃えることができる。

また、対物レンズ２８、３２は、互いに離間するとともに細胞塊１００を挟むように配置されている。この配置によれば、分岐レーザＬ１、Ｌ２は、互いに異なる方向から細胞塊１００に照射される。その結果、細胞塊１００の表面から焦点に至る長さを短縮することができる。細胞塊１００の表面から焦点に至る長さが短くなることにより、分岐レーザＬ１、Ｌ２の散乱等の発生が低減される。つまり、細胞塊１００に入射してから焦点に至るまでの分岐レーザＬ１、Ｌ２の状態を揃えることができる。

さらに、蛍光Ｆ１は、照射ユニット２４を介して検出ユニット３６に入射する。同様に、蛍光Ｆ２は、照射ユニット２６を介して検出ユニット３７に入射する。つまり、蛍光Ｆ１、Ｆ２は、互いに干渉し合うことなく、それぞれ独立の光路を経て、検出ユニット３６、３７に入射する。従って、蛍光Ｆ１、Ｆ２は、発生してから検出ユニット３６、３７に入射するまでの条件が一致する。

その結果、細胞塊１００に入射する直前までの状態と、細胞塊１００に入射してから焦点に至るまでの状態と、が分岐レーザＬ１、Ｌ２の間で揃うので、蛍光Ｆ１、Ｆ２を発生させる励起条件に差異が生じない。さらに、蛍光Ｆ１、Ｆ２は、検出ユニット３６、３７に入射するまでの条件が整った光路を経て検出ユニット３６、３７に入射する。従って、蛍光Ｆ１、Ｆ２の強度に差異が生じることを抑制できるので、良好な観察結果を得ることができる。

要するに、実施形態の二光子顕微鏡１は、互いに異なる少なくとも２方向から励起光として分岐レーザＬ１、Ｌ２を細胞塊１００に照射する。この照射形態によれば、細胞塊１００に与えるダメージを抑制し、励起光を細胞塊１００の深部まで到達させることが可能である。さらに、二方向から照射された励起光に応じて発生する蛍光Ｆ１、Ｆ２は、それぞれに対応する検出ユニット３６、３７により検出する。ここで、細胞塊１００から検出ユニット３６、３７に至るまでに通過する光路は、蛍光Ｆ１、Ｆ２においてそれぞれ別である。そして、二方向からの励起光の各々において、軸線Ｓ１から見て同じレーザ照射位置で、レーザの走査位置ごとに発生した蛍光Ｆ１、Ｆ２を検出し、当該蛍光Ｆ１、Ｆ２をマッピングすることにより、走査平面Ｃ１、Ｃ２ごとのスライス画像を得ることができる。

焦点調整部２９は、レーザ分岐部４から対物レンズ２８に至る光路上に設けられた焦点可変レンズ３４を有する。さらに、焦点調整部２９は、レーザ分岐部４から対物レンズ３２に至る光路上に設けられた焦点可変レンズ３４を有する。この構成によれば、分岐レーザＬ１、Ｌ２のそれぞれに焦点可変レンズ３４が配置される。従って、分岐レーザＬ１、Ｌ２の焦点位置を、それぞれ独立に調整することができる。

光源２は、波長可変型パルスレーザであるレーザを出射する。この構成によれば、良好な励起光を提供することができる。

〔第２実施形態〕
第１実施形態の二光子顕微鏡１は、２個の焦点調整部２９、３３を備えていた。焦点調整部２９、３３は、照射ユニット２４、２６にそれぞれ配置されていた。焦点調整部が設けられる位置は、レーザ走査部３から対物レンズ２８、３２に至る光路上であればよい。例えば、図５に示すように、焦点調整部２９Ａは、補助光学部１４Ａに設けられてもよい。つまり、第２実施形態の二光子顕微鏡１Ａは、補助光学部１４Ａを有する。そして、補助光学部１４Ａは、結像レンズ１６に代えて、焦点可変レンズ３４（第３焦点可変レンズ）を有する。

別の視点から説明すると、第１実施形態の二光子顕微鏡１では、レーザ分岐部４の後に焦点調整部２９、３３が配置されていた。一方、第２実施形態の二光子顕微鏡１Ａでは、レーザ分岐部４の前に焦点調整部２９Ａが配置されている。換言すると、焦点調整部２９Ａには、分岐前のレーザＬが通過する。この構成によれば、焦点調整部２９Ａの焦点調整動作によって、分岐レーザＬ１、Ｌ２の両方の焦点位置が調整される。つまり、１個の焦点調整部２９Ａによって、２つの分岐レーザＬ１、Ｌ２の焦点位置が調整される。さらに、レーザＬが焦点調整部２９Ａを通過した後に、レーザ分岐部４に導かれる。この構成によれば、レーザ走査部３とレーザ分岐部４とにより分岐レーザＬ１、Ｌ２の走査が同期することと同様に、分岐レーザＬ１、Ｌ２の焦点位置の移動も同期する。

具体的には、図６の（ａ）部、（ｂ）部および（ｃ）部に示されるように、細胞塊１００を観察する初期状態（図６の（ａ）部参照）では、第１実施形態と同様に、基準点ＴＣから距離Ｄ１ａだけ離間した位置に走査平面Ｃ１が設定され、基準点ＴＣから逆方向に距離Ｄ２ａだけ離間した位置に走査平面Ｃ２が設定される。距離Ｄ１ａ、Ｄ２ａは互いに等しい。そして、次の再設定動作において、焦点調整部２９Ａに制御信号φ２Ａが提供される。その結果、走査平面Ｃ１は、基準点ＴＣから距離Ｄ１ｂだけ離間した位置に設定される（図６の（ｂ）部参照）。同様に、走査平面Ｃ２は、基準点ＴＣから距離Ｄ２ｂだけ離間した位置に設定される。距離Ｄ１ｂ、Ｄ２ｂは互いに等しい。換言すると、走査平面Ｃ１、Ｃ２は、同じ距離だけ基準点ＴＣに近づく。つまり、分岐レーザＬ１、Ｌ２の焦点位置の移動が同期するとは、焦点調整部２９Ａの動作によって分岐レーザＬ１、Ｌ２の焦点位置が同じ距離だけ基準点ＴＣに近づく又は遠ざかることを意味する。

二光子顕微鏡１Ａにおいても、再設定動作と走査とを繰り返し実施して、複数のスライス画像ＧＮ（ａ）、ＧＭ（ａ）を得る。これらの動作は、走査平面Ｃ１、Ｃ２が基準点ＴＣを含む位置まで移動するまで繰り返される（図６の（ｃ）部参照）。

〔作用効果〕
二光子顕微鏡１Ａにおいて、焦点調整部２９Ａは、レーザ走査部３からレーザ分岐部４に至る光路Ｐ２に設けられた焦点可変レンズ３４を含む。この構成によれば、分岐前のレーザＬに対して焦点可変レンズ３４が配置される。従って、一つのレンズによって、分岐レーザＬ１、Ｌ２の両方について焦点位置を調整することができる。

以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。

〔変形例１〕
図７に示す変形例１の二光子顕微鏡１Ｂは、第１実施形態の二光子顕微鏡１の変形例である。二光子顕微鏡１Ｂは、レーザ分岐部４の後に焦点調整部２９Ｂ、３３Ｂが配置されている点で、第１実施形態の二光子顕微鏡１と共通する。しかし、二光子顕微鏡１Ｂは、焦点調整部２９Ｂ、３３Ｂが光学系１８Ａ、１９Ａに配置されている点で、第１実施形態の二光子顕微鏡１と相違する。具体的には、二光子顕微鏡１Ｂは、光学系１８Ａ、１９Ａを有している。光学系１８Ａは、ミラー２１と、焦点調整部２９Ｂと、を有する。焦点調整部２９Ｂは、ミラー２１と出力１８ｂとの間に配置されている。換言すると、焦点調整部２９Ｂは、ダイクロイックミラー２７の前に配置されているとも言える。焦点調整部２９Ｂは、制御信号φ２Ｂをコントローラ８から受ける。同様に、光学系１９Ａは、ミラー２２、２３と、焦点調整部３３Ｂと、を有する。焦点調整部３３Ｂは、ミラー２３と出力１９ｂとの間に配置されている。換言すると、焦点調整部３３Ｂは、ダイクロイックミラー３１の前に配置されているとも言える。焦点調整部３３Ｂは、制御信号φ３Ｂをコントローラ８から受ける。

この構成によれば、照射ユニット２４Ａ、２６Ａにおいて、蛍光Ｆ１、Ｆ２のための光路Ｐ７、Ｐ８上に焦点調整部２９Ｂ、３３Ｂが配置されない。換言すると、蛍光Ｆ１、Ｆ２は、対物レンズ２８、３２、ダイクロイックミラー２７、３１を介して、検出ユニット３６、３７に入射する。つまり、蛍光Ｆ１、Ｆ２は、焦点調整部２９Ｂ、３３Ｂを透過しない。従って、蛍光Ｆ１、Ｆ２の光損失の発生を抑制できる。

〔変形例２〕
図８に示す変形例２の二光子顕微鏡１Ｃは、第２実施形態の二光子顕微鏡１Ａの変形例である。二光子顕微鏡１Ｃは、レーザ走査部３の後であり、かつ、レーザ分岐部４の前に焦点調整部２９Ａが配置されている点で、第２実施形態の二光子顕微鏡１Ａと共通する。しかし、二光子顕微鏡１Ｃは、光源２に代えて光源２Ａを有しており、さらに、フィルタホイール４２、４３を有する点で二光子顕微鏡１Ａと相違する。光源２Ａは、レーザ装置２ｂを有する。レーザ装置２ｂは、波長可変フェムト秒レーザを出射する。つまり、光源２Ａから出射するレーザＬは、所望の波長を選択できる。換言すると、励起波長を選択できる。レーザ装置２ｂから出射されるレーザの波長は、例えば、コントローラ８から提供される制御信号φ４によって制御されてもよい。また、フィルタホイール４２は、検出ユニット３６Ａに配置されている。具体的には、フィルタホイール４２は、入力３６ａとレンズ３９の間に配置されている。一方、フィルタホイール４３は、検出ユニット３７Ａに配置されている。フィルタホイール４２、４３は互いに同じ構成を有する。そして、フィルタホイール４２、４３は、レーザＬの励起波長に応じた蛍光フィルタを提供する。つまり、フィルタホイール４２は、対応する波長が互いに異なる複数の蛍光フィルタ４２ａ、４２ｂを有する。フィルタホイール４３も、複数の蛍光フィルタ４３ａ、４３ｂを有する。なお、フィルタホイール４２、４３が有する蛍光フィルタの数は、２以上であってもよい。フィルタホイール４２は、レーザＬの波長に対応する蛍光フィルタ４４ａを光路Ｐ７上に配置する。例えば、コントローラ８から提供される制御信号φ５に応じて、光路Ｐ７上に配置する蛍光フィルタ４２ａ、４２ｂを選択してもよい。

この構成によれば、光源２Ａによって吸収波長の異なる複数の蛍光色素を励起させることが可能になる。さらに、フィルタホイール４２、４３によってそれぞれの蛍光色素に応じた蛍光フィルタを提供することができる。

〔変形例３〕
図９に示す変形例３の二光子顕微鏡１Ｄは、第２実施形態の二光子顕微鏡１Ａの別の変形例である。二光子顕微鏡１Ｂは、レーザ走査部３の後であって、レーザ分岐部４の前に焦点調整部２９Ａが配置されている点で、第２実施形態の二光子顕微鏡１Ａと共通する。しかし、変形例３の二光子顕微鏡１Ｄは、光源２に代えて光源２Ｂを有し、レーザ分岐部４に代えてレーザ分岐部４Ａを有する点で、二光子顕微鏡１Ａと相違する。具体的には、光源２Ｂは、合波レーザＬＣ（第３レーザ）を出射する。合波レーザＬＣは、互いに異なる波長を有するレーザＬａ（第１レーザ）及びレーザＬｂ（第２レーザ）が合波されたものである。そこで、光源２Ｂは、レーザ装置２ｃ（第１光出射部）、レーザ装置２ｄ（第２光出射部）と、レーザ合波部２ｅ（第３光出射部）と、を有する。レーザ装置２ｃは、レーザＬａを出射する。レーザ装置２ｄは、レーザＬｂを出射する。レーザ合波部２ｅは、レーザ装置２ｃ、２ｄの光軸が交差する位置に配置されている。レーザ合波部２ｅは、レーザＬａ、Ｌｂを受けて、合波レーザＬＣを出力する。たとえば、レーザ合波部２ｅは、ダイクロイックミラーであってもよい。この場合にはレーザ合波部２ｅは、波長（λａ：第１波長）を有するレーザＬａを反射し、波長（λｂ：第２波長）を有するレーザＬｂを透過する。レーザ分岐部４Ａは、ハーフミラー１７に代えて、ダイクロイックミラー１７Ａを有する。例えば、ダイクロイックミラー１７Ａは、波長（λａ）を有するレーザＬａを反射し、波長（λｂ）を有するレーザＬｂを透過する。

この構成によれば、照射ユニット２４Ａは、波長（λａ）であるレーザを励起光として細胞塊１００に照射できる。また、照射ユニット２４Ｂは、波長（λｂ）であるレーザを励起光として細胞塊１００に照射できる。つまり、異なる波長を有するフェムト秒レーザを合波させることで、異なる波長による蛍光観察が可能になる。また、互いに異なる波長を有する励起光を互いに異なる方向から細胞塊１００に照射する。そうすると、照射によって生じる蛍光Ｆ１、Ｆ２も互いに異なる方向から検出することが可能になる。その結果、互いに異なる波長を含む蛍光をダイクロイックミラーによって波長ごとに分岐する構成を必要としない。その結果、蛍光観察系における光透過率の低下が抑制されるとともに、光路長の伸長も抑制される。従って、これらの要因により生じ得るいわゆるケラレの発生が抑制されるので、集光効率の低下を抑制することができる。

１，１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ…二光子顕微鏡、２，２Ａ，２Ｂ…光源、２ｓ，２ｂ、２ｃ，２ｄ…レーザ装置、２ｅ…レーザ合波部（第３光出射部）、３…レーザ走査部、４，４Ａ…レーザ分岐部、６…レーザ照射部、７…蛍光検出部、８…コントローラ、９…コンピュータ、１１…補助光学部、１２…コリメータレンズ、１３Ａ，１３Ｂ，２１，２２，２３…ミラー、１４，１４Ａ…補助光学部、１５…レンズ（ｆθレンズ）、１６…結像レンズ、１７…ハーフミラー、１７Ａ，２７，３１…ダイクロイックミラー、１８，１８Ａ，１９，１９Ａ…光学系、２４，２４Ａ，２４Ｂ，２６，２６Ａ…照射ユニット、２８，３２…対物レンズ（第１対物レンズ、第２対物レンズ）、２９，２９Ａ，２９Ｂ，３３，３３Ｂ…焦点調整部、３４…焦点可変レンズ（第１焦点可変レンズ、第２焦点可変レンズ、第３焦点可変レンズ）、３６，３６Ａ，３７，３７Ａ…検出ユニット、３８，３８Ａ…フィルタ（第１フィルタ、第２フィルタ）、３９，３９Ａ…レンズ、４１，４１Ａ…センサ（第１受光部、第２受光部）、４２，４３…フィルタホイール、１００…細胞塊、Ｃ１，Ｃ２…走査平面（第１走査平面、第２走査平面）、Ｆ１，Ｆ２…蛍光（第１被計測光、第２被計測光）、ＧＮ，ＧＭ…スライス画像、ＬＣ…合波レーザ（第３レーザ）、Ｌ，Ｌａ，Ｌｂ…レーザ、Ｌ１，Ｌ２…分岐レーザ（第１分岐レーザ、第２分岐レーザ）、Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５，Ｐ６，Ｐ７…光路、Ｓ１，Ｓ２…軸線、ＴＣ…基準点、ＴＤ１，ＴＤ２，ＴＤ３…三次元画像、Ｔ１，Ｔ２…照射位置、φ１，φ２，φ２Ａ，φ２Ｂ，φ３，φ３Ｂ，φ４，φ５…制御信号。

Claims (6)

1. パルスレーザを出射する光源と、
   前記パルスレーザを受け入れて、試料に対する前記パルスレーザの照射位置が二次元平面内において移動するように、前記パルスレーザの進行方向を変化させる走査部と、
   前記走査部から受け入れた前記パルスレーザを分岐して、第１分岐レーザ及び第２分岐レーザを形成する分岐部と、
   軸線上において互いに離間して配置された第１及び第２対物レンズを有する照射部であって、前記第１対物レンズは、前記軸線上に配置された前記試料と交差する第１走査平面に前記第１分岐レーザを集光し、前記第２対物レンズは、前記試料と交差すると共に前記第１走査平面に対して離間する第２走査平面に前記第２分岐レーザを集光する、前記照射部と、
   前記第１分岐レーザに起因して前記試料から出射された第１被計測光を検出する第１検出部と、
   前記第２分岐レーザに起因して前記試料から出射された第２被計測光を検出する第２検出部と、
   前記走査部から前記第１及び第２対物レンズに至る光路上に設けられて、前記軸線の方向における前記第１分岐レーザ及び第２分岐レーザが集光される位置を調整する調整部と、を備え、
   前記分岐部から前記第１対物レンズに至る光路長は、前記分岐部から前記第２対物レンズに至る光路長と等しく、
   前記軸線の方向から見た場合に、前記第１走査平面における前記第１分岐レーザの照射位置は、前記第２走査平面における前記第２分岐レーザの照射位置と重複する、二光子顕微鏡。
2. 前記調整部は、
   前記分岐部から前記第１対物レンズに至る光路上に設けられた第１焦点可変レンズと、
   前記分岐部から前記第２対物レンズに至る光路上に設けられた第２焦点可変レンズと、
   を含む、請求項１に記載の二光子顕微鏡。
3. 前記調整部は、前記走査部から前記分岐部に至る光路上に設けられた第３焦点可変レンズを含む、請求項１に記載の二光子顕微鏡。
4. 前記光源は、波長可変型パルスレーザである前記パルスレーザを出射する、請求項１～３の何れか一項に記載の二光子顕微鏡。
5. 前記光源は、
   第１波長を有する第１レーザを生成する第１光出射部と、
   前記第１波長とは異なる第２波長を有する第２レーザを生成する第２光出射部と、
   前記第１光出射部から前記第１レーザを受け入れると共に前記第２光出射部から前記第２レーザを受け入れて、前記第１レーザと前記第２レーザが合波された第３レーザを出射する第３光出射部と、を含む、請求項１～４の何れか一項に記載の二光子顕微鏡。
6. 前記第１検出部は、前記第１被計測光を受ける第１受光部と、前記試料から前記第１受光部へ至る光路上に配置された第１フィルタと、を有し、
   前記第２検出部は、前記第２被計測光を受ける第２受光部と、前記試料から前記第２受光部へ至る光路上に配置された第２フィルタと、を有する、請求項１～５の何れか一項に記載の二光子顕微鏡。

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