CN101019060A - 用于具有共焦激发平面的广视场多光子显微的方法及系统 - Google Patents

Abstract

一种广视场显微镜，包括固定其内有荧光材料的样品的平台(50)，产生基本平行的激发光束(25)的多光子激发光源(10)，该基本平行的激发光束(25)具有的单光子能量低于该荧光材料的单光子激发所需的吸收能量。

Description

用于具有共焦激发平面的广视场多光子显微的方法及系统

相关申请的交叉引用

本申请涉及并要求于2004年5月19日申请的美国申请序列号为10/847,862的优先权，在此引入其全部内容作为参考。

技术领域

本发明一般涉及荧光显微术，具体地涉及在共焦平面提供广视场多光子激发。

背景技术

光学显微术一直被用来检查太小而用肉眼无法清楚地看到的物体。光学显微术包括提供入射光束到样品上并通过放大镜观察来自该样品的光。荧光显微术是另一种类型的显微术，其中用荧光材料标记感兴趣的样品，然后用一定的波长光照射样品，该波长光提供的单光子能级足以激发荧光材料发出发射光。通过收集发射光而不是激发光来检测样品的图像。荧光显微术可实施作为标准的广视场显微术或共焦显微术。

在广视场荧光显微术中，诸如弧光灯的激发光源提供平行或准平行的激发光束，该激发光束被会聚到样品的预期焦平面上。焦平面处的图像由所有由特定物镜的点扩散特性包围的光产生。因为点扩散函数不能确定单个焦平面，所以荧光材料的激发发生在预期焦平面之上和之下，并且不能分辨出样品的卷信息。可以采用通常称为解卷积显微术的计算方法，来从在不同焦平面处获得的一堆图像中计算样品内特定平面的光，该计算方法利用物镜的点扩散函数的一种模型。这可以通过说明来自每个片段的光对其它片段的影响，从而近似一个规定厚度的共焦图像片段这样的方式完成。广视场解卷积共焦荧光显微术的实施类似于光学共焦显微镜法，然而在许多情况下，由于背景发射导致的差对比度所产生的图像噪声的影响，或由于在实际试验条件下，用于物镜的点扩散函数可能偏离它的相应模型，因此结果得到的图像发生失真。而且，这些问题使得难于构造样品的3-D再现。

在共焦荧光显微术中，激发光束被聚焦在样品的焦点。在激发光具有的波长足以提供荧光材料的单光子激发的情况下，激发发生在以焦点为中心的砂漏束腰中，该砂漏束腰近似于物镜的点扩散函数。但是，与广视场荧光显微术不同，通过对激发源和发射图像使用塞孔，可以获得共焦。由于只有来源于焦平面的平行光线才可以穿过塞孔，因此不具有平行光线(或焦平面之外)的光子会被该塞孔阻挡，不能到达探测器。因此，该塞孔阻挡了来自焦点之上和之下的发射光，从而可以提供不被焦平面之上和之下的信息失真的清晰图像。但是，由于发射针孔提供的是仅来自于激光束焦点的图像数据，因此必须在样品上面沿着x和y方向光栅扫描共焦系统的激发激光束，而且必须在每个x，y位置收集荧光发射的强度。从该数据，可在计算机中构造样品的图像片段。通过改变焦平面，可以获得几个图像，并且可在计算机中重新构造获得的图像堆，以获得样品的三维(3-D)再现。

广视场和共焦荧光显微术存在的一个共同问题是荧光材料的单光子激发发生在数据图像被实际收集所处的焦点之上和之下。这种不必要的激发将导致特定焦平面之上和之下的材料出现“漂白”，当该特定焦平面随后作为新焦平面的一部分被激发时，该特定焦平面将具有降低的发射特性。而且，位于焦平面之上和之下的组织的反复激发可能会损伤该组织，这对于活样品的图像生成是特别不希望的。

近年来，出现了一种用于减少漂白和组织损伤问题的新光学切片技术--多光子荧光显微术。这种类型的显微术使用的是具有比激发荧光材料所需波长更长波长的脉冲照明光源。例如，需要500nm激发波长的染料将用在1000nm工作的激光源照明，使得由于染料在1000nm不吸收光，样品中不产生单光子激发。但是，使用脉冲高功率激发激光器可以在焦点处提供足够高的光子强度，使得至少两个光子被荧光材料(基本同时地)吸收。这种长波长的双光子吸收提供的激发能量等于较短波长的单光子吸收，并致使激发局限在焦点处。因此，利用多光子激发，围绕着焦点的荧光材料将不被激发，从而消除了对塞孔的需要，并将因反复激发而产生的漂白和组织损伤问题减至最小。

图6示出了美国专利No.5,034,613中公开的多光子扫描显微系统。如图中所示，扫描显微镜10包括聚焦诸如激光器的光源16产生的入射光14到物面18的物镜12。由入射光束14提供的照明充满通常用24表示的会聚圆锥，该圆锥进入样品以到达在物面18处的焦平面并形成焦点26。从激光器16到物面18的光路径包括激光器16产生的光直接入射到其上的分色镜28。分光镜28向下偏转该光到达反射镜30，反射镜30接着通过曲面反射镜36和38将该光引导到一对扫描反射镜32和34。反射镜32和34可绕相互垂直的轴旋转，以便沿垂直的X和Y轴在物面上移动入射光14，因此利用入射光束可以扫描固定的样品。来自扫描反射镜的光穿过目镜40，通过物镜12聚焦到物面18。

由物面18中样品产生的荧光通过显微镜10传回，返回入射光束14的光路径，并因此穿过物镜12和目镜40，扫描反射镜34和32以及曲面反射镜38和36，并且被反射镜30反射回分光镜28。样品中荧光材料发射的光是包含在该样品中的荧光团的特定波长，因此能够穿过分色镜28而不被向激光器16反射回来，并沿着通常以44表示的光路径传播。荧光42因此穿过阻挡滤光器46并被平面反射镜48，50和52反射到诸如光电倍增管54的适当探测器。虽然不为多光子显微术所需要，但在收集光学系统44中可以设置可调的共焦针孔56，以将焦平面之上和之下的会聚和发散锥体内发出激发的背景荧光减至最少。

发明内容

尽管多光子荧光显微系统具有上述优点，但是本发明人发现这种类型的现有系统包括诸如图8中所示的复杂和昂贵的激发光束扫描机构。而且，对焦点激发光束的扫描通常会导致图像获取速度对于视频速率而言太慢，而对于样品成像而言又太高。

因此，本发明的一个目的是消除现有技术的多光子荧光显微术存在的上述问题。

本发明的另一目的是提供一种多光子显微术的方法及系统，其中可以减少或消除激发光源在样品上的扫描。

本发明的再一个目的是减少样品的图像获取时间。

这些和/或其它目的将通过用于具有共焦平面的广视场多光子显微术的方法及系统来提供。根据发明的一个方面，广视场显微镜包括配置成固定其内有荧光材料的样品的平台，和配置成产生基本平行的激发光束的多光子激发光源，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于在样品内包含的荧光材料的单光子激发所需的吸收能量。无限校正物镜被光学耦合到该多光子激发光源，并被配置成聚焦基本平行的激发光束到样品上，以便荧光材料的多光子激发同时在样品的预定区域上发生。聚焦透镜被配置成将从该样品的该预定区域发出的发射光同时聚焦到图像探测器的至少两个像素上。

根据另一方面，广视场显微镜包括固定其内有荧光材料的样品的装置，和产生基本平行的激发光束的装置，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于在该样品内包含的荧光材料的单光子激发所需的吸收能量。该方面还包括光学耦合到多光子激发光源的装置，其用于接收基本平行的激发光束并将该激发光聚焦到样品上，以便荧光材料的多光子激发同时在样品的预定区域上发生。将从该样品的该预定区域发出的发射光同时聚焦到图像探测器的至少两个像素上的装置。

本发明的另一个方面包括横跨一共焦平面提供广视场激发的方法。该方法包括固定其内有荧光材料的样品，产生基本平行的激发光束，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于在样品内包括的荧光材料的单光子激发所需的吸收能量，并施加基本平行的激发光束到无限校正物镜，该无限校正物镜聚焦该激发光到该样品上，以便在该样品的预定区域上同时发生荧光材料的多光子激发。将从该样品的该预定区域发出的发射光同时聚焦到图像探测器的至少两个像素上。

本发明的再一个方面包括具有广视场显微镜的柔性显微镜。该广视场显微镜包括配置成固定其内有荧光材料的样品的平台，和配置成产生基本平行的激发光束的多光子激发光源，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于在样品内包括的荧光材料的单光子激发所需的吸收能量。无限校正物镜被光学耦合到该多光子激发光源，并被配置成聚焦基本平行的激发光束到样品上，以便荧光材料的多光子激发同时在样品的预定区域上发生。聚焦透镜被配置成将从该样品的该预定区域发出的发射光同时聚焦到图像探测器的至少两个像素上。光纤耦合到该广视场显微镜上，光学部件固定器附接在该光纤末端上。至少该广视场显微镜的无限校正物镜包括在该光学部件固定器内，并且该广视场显微镜的所有没包括在该光学部件固定器内的部件包括在光耦合到该光纤的相反末端的外部单元内。

本发明的另一个方面包括广视场显微镜，该广视场显微镜具有配置成固定其内有荧光材料的样品的平台，和配置成产生基本平行的激发光束的多光子激发光源，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于在样品内包括的荧光材料的单光子激发所需的吸收能量。无限校正物镜被光学耦合到该多光子激发光源，并被配置成聚焦基本平行的激发光束到样品上，以便荧光材料的多光子激发同时在样品的预定区域上发生。聚焦透镜被配置成将从该样品的该预定区域发出的发射光聚焦到像平面上，以便通过双目目镜可以观察该像平面。

附图说明

通过参考下面结合附图考虑的详细描述，将容易地获得并更好地理解本发明更完整的评价及其许多附加优点，其中：

图1是根据本发明一实施例的多光子显微系统的系统图；

图2是根据本发明另一实施例的多光子显微系统的系统图；

图3是根据本发明再一实施例的多光子显微系统的系统图；

图4是根据本发明再一实施例的多光子显微系统的系统图；

图5是根据本发明的具有多光子显微系统的柔性显微镜的系统图；

图6是现有的多光子扫描显微系统；

图7是现有技术的广视场多光子显微系统的系统图；

图8是现有技术的去相关多焦点多光子系统的系统图。

具体实施方式

如上所述，现有的多光子荧光显微系统包括通过激发光源对样品的扫描。本发明人发现，在多光子显微术中使用扫描主要是由于人们广泛地感觉只需要激发样品的小焦点。而在现有的多光子显微镜中，小激发区域对应于显微探测器的单个像素，从而必须横跨视场，一个像素接一个像素地扫描激发光束。对需要横跨样品扫描的小区域多光子激发区域的感觉同样阻止了通过双目目镜的图像探测的使用，因为扫描的图像在观察之前必须通过计算机重新构造。但是，本发明人已经发现，通过同时激发样品的较大区域，可以减少或消除对激发光源扫描的需要。这种系统已经被研究来提供用于多光子显微术的超短脉冲激发激光器的有效的功率使用。例如，Wide-field Multi-photonand Temporally Decorrelated Multifocal Multi-photon Microscopy，by Fittinghoff，Wiseman and Squier，Optics Express，Vol.7，273-280，9 October 2000(下文中，称为Fittinghoff等人)公开了两种系统，该两种系统能够对样品的广区域提供同时激发，以允许激发激光功率的有效使用。

图7示出了Fittinghoff等人公开的广视场多光子显微镜。如该图所示，激发光束705由聚焦透镜710聚焦，然后穿过分色镜720并通过物镜730，该物镜730将该激发光施加到样品740的焦平面。激发光束705由20飞秒、800nm脉冲激光光源提供。样品发射的光束745返回穿过物镜730并被分色镜720反射射向镜筒透镜750。镜筒透镜750聚焦发射光束745到电荷耦合探测器760，生成图像。虽然广视场多光子显微镜能够产生样品的相对大区域的同时激发，但是Fittinghoff等人提及的解释是该系统具有差的轴向分辨率，并因此导致样品沿轴向的非常长区域发生激发。这导致如上述背景技术中描述的广视场显微系统的情况一样的共焦损失，从而将产生差的图像并不能产生3-D显微所需要的清晰切片。因此，Fittinghoff等人指出，虽然广视场多光子方法可以同时激发大区域，但是其不能提供用于清晰片段和3-D成像的共焦激发平面。

图8示出了Fittinghoff等人公开的去相关多焦多光子系统，去相关多焦多光子系统用于对样品的线性区域提供同时激发，同时允许3-D成像。如该图所示，激光束805输入到标准具810，该标准具810将该光束分成将被引导到透镜820的单个焦点光束阵列815。标准具810可被一系列将输入激光束分成等功率焦点光束阵列的分束器代替。透镜820然后引导多焦光束阵列815通过第一反射镜830，透镜840，第二反射镜850并到达透镜860。如图8中的箭头所示，反射镜830和850在彼此正交的方向可以移动，以提供多焦阵列扫描。从透镜860开始，该多焦光束阵列穿过分色镜870到达物镜880，该物镜880将该多焦光束阵列施加到平台890的样品上，以便每个阵列光束激发样品的小区域，例如单个像素大小。样品的光发射返回穿过物镜880到达分色镜870，该分色镜870反射发射光到达透镜895，该透镜895聚焦该发射光到电荷耦合探测器898上，该探测器898的单个像素收集来自各自发射光束的光。虽然这种多焦光束阵列的使用在图7的广视场系统基础上提供了改进的轴向分辨率，但是必须扫描多焦光束阵列，这是费时的并且需要上述发明的背景技术中描述的复杂而又昂贵的扫描机构。此外，还需要复杂的光学系统将光源的单个光束分成多个平行光束。

因此，Fittinghoff等人断定，广视场多光子显微镜缺少美国专利5,034,613中最初描述的标准多光子焦点扫描系统的内在切片，而单独的聚焦激发光束阵列的扫描可以被用来提供样品的清晰图像切片。然而，本发明人发现，Fittinghoff等人公开的广视场多光子显微系统其差的轴向分辨率和图像畸变是由脉冲激光激发光束的展宽导致的。具体地，脉冲的展宽降低了激发光的光子强度，这将导致减少的多光子激发以及激发区域的轴向分辨率的损失。认识到该问题后，本发明人发现，在Fittinghoff等人的图7的系统中出现的不期望的脉冲展宽是由于激发激光脉冲光束在到达物镜之前穿过光学部件导致的。

特别地，本发明人发现提供聚焦的激发光束到物镜会导致图7的系统提供差的图像片段。换句话说，由于透镜的色散特性和/或光束的会聚，在到达物镜之前穿过图7的聚焦透镜710的脉冲激发激光束会导致脉冲光束的脉冲展宽。类似地，穿过图6中分色镜620的脉冲激发激光束同样导致产生减少的轴向分辨率和畸变图像片段的脉冲展宽。此外，穿过聚焦透镜和反射镜的光束可以导致激发光束的衰减，其进一步减少了焦平面的多光子激发。在认识到图7中系统的这些问题后，本发明人发现，与Fittinghoff等人提及的结论相反，在维持清晰图像片段和3-D显微术所需的轴向分辨率的同时，广视场多光子显微系统能够实现样品的大区域的同时激发。

现在参考剩余附图，其中在几幅图中相同的附图标记表示相同或相应的部分，图1示出了根据本发明一实施例的广视场多光子显微系统。如该图所示，脉冲激光激发源10提供激发光束，该激发光束被扩束器20扩展成将被施加到分色镜30的基本平行的激发光束25。因此，在图1的实施例中，激发光源10和扩束器20起到配置成产生基本平行的激发光束的多光子激发光源的作用。本领域技术人员应该知道，各种已知构造都可用来提供基本平行的激发光束，例如图2中的弧光灯。

分色镜30将基本平行的激发光束25反射进入物镜装置40，该物镜装置40将激发光施加到固定在平台50上的样品1000上。在图1的实施例中，物镜40沿着激发光束的轴向是可移动的，以改变位于样品1000上的激发光束的焦平面，如箭头53所示。样品吸收激发光的至少2个光子，促使该样品发出发射光，该发射光返回穿过物镜40，分色镜30和发射滤光器60到镜筒透镜70。镜筒透镜70聚焦发射光55到像平面80，在那里探测器90可以检测样品1000一个区域的图像1010。

脉冲激光激发光源10提供具有预定波长的超短激光脉冲，该超短激光脉冲具有的单光子能级不足以导致样品的激发。由于可将多种具有不同激发特性的荧光材料添加到样品，所以激光激发光源10的工作波长取决于样品的荧光发射特性。因此，激光激发光源10可在大约700nm到大约1100nm范围操作并优选在该范围是可调谐的。激光激发光源10的短脉冲可在皮秒，飞秒或更短的脉冲持续范围内，并可具有高达100Mhz的脉冲重复率。在一实施例中，激光激发光源10可实施成由Spectra-Physics ofMountain View Califormia制造的可调谐钛：蓝宝石锁模激光器。但是，可以利用任何提供用于多光子激发的短脉冲激发源的激光器。

如上所述，扩束器20被配置成将激发激光束扩展成基本平行的激发光束。这里所用的术语基本平行的激发光束指的是该光束不穿过设计成会聚该光束光线的光学装置。在一实施例中，扩束器将脉冲激发光束扩展到其原始束宽的100倍。本发明者认识到，可以在仍旧允许横跨样品平面的多光子同时激发的同时，实现激光的这种扩展。而且，如上所述，减少的脉冲展宽和功率损耗有助于保持激光束的多光子激发特性。因此，扩束器20优选地被设计成提供减少的脉冲激光束的功率损耗和脉冲展宽。

扩束器同样优选地被设计成能够横跨扩展光束区域提供具有均匀特性的基本均匀的扩展光束。具体地，脉冲激发光源的脉冲展宽应该被最小化，且在横跨扩展光束区域上应该是基本恒定的。相似地，激发光的强度在横跨扩展光束区域上应该是基本恒定的。本发明人已经认识到这种均匀性可以在横跨样品的广视场激发区域上提供均匀的多光子激发特性。然而，商用的扩束器通常提供的扩展光束横跨光束区域具有非均匀的脉冲展宽和/或功率损耗。实际上，这可能是阻止使用扩束器来扩展多光子激发系统的脉冲激光源的因素。

本发明人在已经认识到减少的脉冲展宽和均匀的激发光束特性对广视场多光子纤维术的重要性的基础上，还认识到从商用扩束器产生的非均匀扩展光束是由于这种扩束器被设计成使进入该扩束器的不同部分激光束传播穿过不同数量的扩束器介质(例如，玻璃)而造成的。具体地，由于脉冲展宽和光衰减受到激光束必须传播穿过的介质的数量的影响，所以例如扩展光束的外围部分比扩展光束的中间部分可能具有不同的脉冲展宽和衰减特性。因此，本发明的扩束器专门设计成允许激光束在扩展光束的每一点传播穿过基本相同数量的玻璃(或其它扩束器材料)。

扩束器20产生的基本未聚焦平行激发光束施加到分色镜30，该分色镜30被设计成反射某一波长范围而通过另一不同的波长范围。多光子荧光显微系统的特性是激发光具有与样品的荧光发射波长基本不同的波长。例如，提供的激发波长通常是样品的荧光发射所需波长(即大约是单个光子能量的一半)的大约两倍。当在少于样品内荧光材料的特征衰减时间的时间周期内有两个或多个激发光子激发样品时，样品被激发到如同被更高能量的单光子激发到的能级，因此发射波长高于(能量低于)单光子激发波长的发射光子。该发射波长取决于荧光染料的物理化学特性。多光子激发可以通过激发光是激发波长3x倍的3光子激发类似地实现。更多倍激发波长同样可以用于实现更高倍的多光子激发。

因此，在图1所示的本发明实施例中，分色镜30反射较长波长的激发光而通过较短波长的发射光。分色镜是本领域技术人员熟知的光学部件。而且，任何已知的能够实现分色镜相同功能的光学部件可用来取代反射镜30。

物镜40是一个无限校正物镜装置，其具有用于接收来自分色镜30的基本未聚焦平行激发光束的后面透镜部分42，和用于聚焦该激发光束到样品的焦平面上的前面透镜部分44。通过利用上述扩束器20，无限校正物镜40优选地被设计成提供最小功率衰减和减少的超短激发激光脉冲展宽。而且，无限校正物镜40可以提供多种不同的数值孔径(NA)和放大能力特性。表1提供了无限校正物镜40可提供的示意性NA和放大能力特性的列表。

表1

N/A	放大能力
		.10	4
.25	10
		.75	20
.4	32
		1.25	40
1.3	100
		1.4	40，60，63，100

本领域技术人员应该明白，其它NA和放大能力的透镜可被用来实现特定应用所需的分辨率和放大率。

无限校正物镜40的前面透镜部分44会聚激发光到平面区域上，以使横跨焦平面预定区域上存在充分的光子密度，以促使在对应于焦平面的预定区域的相对大区域内荧光材料的多光子同时激发。这种相对大区域允许通过诸如双目目镜的光学探测器观察图像。除此之外，样品大区域的同时激发允许对显微图像探测器上的至少两个像素进行同时检测。但是，不同于上述现有技术的广视场多光子显微系统，图1的实施例提供了清晰图像切片所期望的轴向分辨率，这将在下文中描述。因此，固定样品的平台50优选地是相对于物镜沿光束的轴向可动的，如图1中的箭头53所示。这种相对移动提供了在样品的不同深度的激发平面的聚焦，所以可以实施样品的3-D成像。

平台50的相对移动可通过相对于固定的物镜40沿着轴向移动平台来提供，或相对于固定的平台50移动物镜40来提供。同样，还可以既提供平台50的移动又提供物镜40的移动。而且，平台50和/或物镜的移动可通过手动或自动的移动机构实现，这些机构对于显微技术领域的技术人员是熟知的。例如，可以通过电动机或齿轮传动装置，或压电执行组件提供轴向移动。这种自动的移动可被计算机控制，如显微技术领域的技术人员熟知的那样。

从样品的预定激发区域收集的发射光返回穿过无限校正物镜40的前面透镜部分44，并从后面透镜部分42射出，作为被引导向分色镜30的基本平行的光束。如上所述，分色镜30被设计成反射激发光25的波长并通过发射光55的波长。因此，分色镜30起到从激发光25中分离发射光55的作用。发射滤光器60阻挡除发射波长以外的波长，并将滤光后的平行发射光束施加到聚焦透镜70。由于发射光束是基本平行的，所以聚焦透镜70被提供来会聚该发射光束到像平面80上，以便可以探测并观察样品的图像。该聚焦透镜可以是管筒透镜，或其它任何将平行的发射光束聚焦到焦平面80上的已知透镜。在图1所示的实施例中，焦平面80与探测装置90相对应。探测装置90可以是简单的光学探测器，例如图1中所示的双目目镜，摄像机，冷却CCD相机，电子轰击CCD相机或任何其它用于探测图像的已知装置。

图1的广视场多光子显微系统提供了横跨焦平面的同时多光子激发，其具有比图7中所示的那种现有技术系统改进的轴向分辨率。如上所述，本发明人认识到，图7系统中的轴向分辨率损失是由于施加到物镜上的聚焦激发光束引起的。因此，不同于图7的系统，图1的本发明的激发光束是作为基本平行光束施加到物镜40的。在优选的实施例中，基本平行的激发光束是通过利用扩束器扩展脉冲激光的束宽而提供的，本发明人发现，这仍旧提供了足够的能量以横跨相对大区域焦平面产生激发。将基本平行的光束施加到物镜上减少了激发光源的脉冲展宽，这允许横跨样品中的平面产生共焦激发。脉冲展宽的减少还同样由被分色镜30向物镜反射而不像图7的系统那样穿过反射镜的激发光束来提供。而且，通过除去激发光束穿过的2个光学部件(图7中的聚焦透镜和分色镜)，可以减少激发光的衰减，从而允许沿着焦平面的更大样品激发。

通过提供激发的共焦平面，本发明的广视场显微系统减少了对激发光束扫描的需要。在优选实施例中，激发平面覆盖期望的观察平面，以致于根本不需要扫描机构，例如图1中的实施例。但是，当期望的图像观察区域太大而不能同时发生多光子激发时，一些沿着xy方向的广视场系统的扫描可被用来提供改进的图像，这些图像被组合来提供覆盖样品期望区域的图像切片。例如，样品的同时多光子激发区域覆盖显微镜探测器的至少两个像素区域是足够的。当利用诸如双目目镜的光学探测器时，同时多光子激发区域覆盖用户通过目镜可以观察的区域是足够的。本领域普通技术人员可以容易地实现同时激发区域的调整。例如，通过改变扩束器中光学元件的相对位置可以实现调整。除了减少扫描外，由于背景荧光的减少而产生改进的对比度，本发明可以生成改进的图像切片，并可以相对于现有技术的广视场系统进一步减少漂白和组织损伤问题。

更进一步，本发明的广视场显微系统可以提供改进的图像获取时间。特别的，激发光束扫描的减少或消除允许更多时间用于曝光，这将产生更快速的获取时间。而且，虽然图像获取时间与分布在本发明的广视场系统的宽区域上的焦点处的光束强度有关，但是广视场系统提供的效率上的改进可以不需要或只需要增加一点同时观察宽区域所需的曝光时间。特别地，通常衰减现有技术的焦点多光子显微系统的激发光源，以避免样品的组织损伤。本发明的广视场多光子显微系统可使用激发光源的全功率，并将该功率分布在较大的平面区域之上，以使该区域之上的平均功率仍旧低于组织损伤的阈值功率。因此，大区域的曝光时间并不需要被增加超过现有的小区域曝光时间，因为这种通常使用衰减光束的小区域曝光是本发明所避免的。

即使假定本发明没有提供任何效率改进，但是本发明的减少或无扫描显微镜产生的图像获取时间也将较小地增加超过或没有增加超过利用在相同的区域上扫描较高的功率斑点的现有点扫描技术所需的图像获取时间。例如，利用现有扫描显微镜扫描1000×1000像素图像可能需要1秒(每个像素曝光1微秒)。在本发明中，该光束可扩展到利用1秒曝光时间收集发射光，而曝光整个1000×1000像素图像。在该利用扩展光束的情况下，每个像素接受1,000,000次较低的激发能量，而曝光时间增加1,000,000倍，因此净成像结果是相同的。

图2是根据本发明另一个实施例的广视场多光子显微系统的系统图。在图2的实施例中，利用弧光灯210提供激发光。如图1中描述的激光光源，弧光灯210提供具有足够导致样品激发的单光子能级的预定波长的激发光。然而，弧光灯210产生具有不需要扩束器的宽束宽的基本未聚焦的平行激发光束。弧光灯210优选是高功率弧光灯，其产生具有允许当激发光束被聚焦到样品的焦平面时的多光子激发的足够功率的基本平行光束。以与图1的实施例相同的方法，将基本未聚焦的平行激发光束施加到样品，并收集来自样品的发射光，因此没有重复对剩余光学部件的讨论。

图3是根据本发明另一实施例的广视场多光子显微系统。如图中所示，本发明的实施例包括设置在物镜70和像平面80之间的中间像平面中的塞孔375。塞孔375提高了激发平面的共焦性，以便可以获得样品的更清晰的图像切片和3-D图像。虽然图3中所示的与超短脉冲激发光源有关，但是塞孔375可以和例如相对于图2描述的弧光灯一起使用。塞孔375可被实施成可沿着xy方向扫描的可移动的孔。在另一实施例中，塞孔375可实施为具有通过旋转扫描发射面的多个针孔的尼普科夫圆盘。旋转尼普科夫圆盘和xy扫描塞孔对于共焦显微领域的技术人员都是熟知的。以与图1的实施例相同的方法，将基本未聚焦的平行激发光束施加到样品，并收集来自样品的发射光，因此没有重复对剩余光学部件的讨论。

图4是根据本发明再一实施例的广视场多光子显微系统。在图4的实施例中，通过产生分别具有第一和第二波长的激发光的两个光源410和420提供激发光。光源410和420可以实施成图1中描述的超短脉冲激光器10，或图2中描述的弧光灯210。而且，其它具有不同波长的光源可以添加到图4中省略号表示的系统中。光源410和420产生的激发光通过光束组合器430结合成具有至少两种激发光波长的单激发光束440。因此，图4的系统可用于多荧光成像，其中不同波长的激光脉冲被施加到利用具有根本不同的发射特性的不同荧光材料标记的样品。

光束组合器包括配置成将光源410和420的激发光彼此叠加的光学部件。例如，光束组合器可以是分色镜，该分色镜通过与光束440轴向对准的光源410产生的第一波长，而反射定位成与光束440的轴正交的光源420产生的第二波长。本领域普通技术人员可以实施其它已知的光束组合器。如图上述的实施例，具有至少两种波长的激发光束440是基本未聚焦的平行光束。因此，虽然图4中没有示出，但是当光源被实施成超短脉冲激光器时，如图1所描述的利用扩束器扩展光束。

通过与图1-3中所描述的基本相似的光学系统，将基本未聚焦的平行激发光束施加到样品。但是，在图4的实施例中，样品包括对应于激发光束的每种波长的荧光材料。因此，样品中不同荧光材料的多光子激发同时发生，以提供用来对比样品的不同部分的不同波长发射光。这种发射光由物镜收集，并被以与上述基本相同的方法送到探测器。本领域普通技术人员应该明白，诸如图4实施例中的分色镜的光学部件应该设计成适应包括在激发和发射光束中的波长范围。而且，图3中描述的塞孔可实施到图4的实施例中。

对于本发明具有设置在平台上的样品之下的激发源和透镜系统的显微镜，已经描述了图1-4的实施例。然而，本发明的广视场多光子显微系统可被实施成直立显微镜，其具有平台之上的激发系统和平台之上的透镜系统。而且，本发明的广视场多光子显微系统可与焦点系统结合实施。具体地，聚焦光束可被施加到样品和用于激光消融扫描的光栅，而广视场光束可用于多光子激发和检测。而且，根据本发明的多广视场激发光束可以平行地排列在类似于参看图8所述的现有技术系统的构造中。然而，需要注意的是，本发明的这种实施不需要扫描广视场光束阵列。这些系统可被具有这里所描述的本发明知识的本领域普通技术人员容易地实施。

再进一步，本发明的广视场多光子显微系统可以实施成例如用于活的有机体内成像的柔性显微镜。图5示出了利用本发明的广视场多光子激发技术的柔性显微镜。如图中所示，该系统包括耦合到光纤520的外部单元510，该光纤520在远离该外部单元的光纤末端具有物镜530。在优选实施例中，该物镜530只包括对应于相对于图1描述的前面透镜的聚焦透镜。在该实施例中，无限校正物镜，管筒透镜，激发光源以及其它任何光学部件都设置在外部单元510中。但是，无限校正透镜和其它光学部件可被实施成光纤的物镜单元，以减少脉冲激发激光束的脉冲展宽。而且，光纤520可被实施成多个单个光纤，并可被封装在导管中。

优选实施例的例子

例1.根据本发明，可改进具有机械化Z焦点电动机和外荧光设备的ZeissAxiovert135(Carl Zeiss，德国)广视场显微镜以用于2-光子广视场荧光。物镜包括Zeiss 10X，20X，40X，63X和100X Plan-neofluar和Plan-Apcromat，其物镜具有的NA在0.4-1.4的范围内。荧光滤光器滑动器中的一个位置包含专门的滤光器，以适应2-光子激发和发射。分色镜及激发和发射滤光器在激发侧没有包含滤光器，而是包含由Chroma Technology Corporation，Rockingham，VT生产的反射波长为700nm以上的光而通过波长为700nm以下的光的专门分色镜。根据染料和脉冲激光器照明的波长，可以使用450nm到700nm之间的各种带通发射滤光器。移去弧光灯和外部照明路径中的光学部件，并利用在700-1100nm范围可调谐的光谱物理学(Mountain View，CA)可调MaiTai飞秒激光器取代弧光灯照明系统。

能够维持激光束的相干性和横跨扩展光束的激光飞秒脉宽的均匀性的常规设计的扩束器设置在激光器的出口和显微激发光路的入口之间。将Hamamatsu(Japan)Orca-ER冷却CCD相机安装在显微镜上，记录荧光图像。使用诸如Universal Imaging MetaMorph(Downingtown，PA)或ScanalyticsIPLab(Fall Church，VA)的软件来控制显微镜的焦点、相机并获取图像。使用单独的计算机控制MaiTai激光器，选择激光特性和2-光子激发的波长。图像获取软件通过一些线路与控制MaiTai激光器的计算机进行通信，选择激发波长。

使用2-光子显微镜，对来自生长于安装在阿托氟石(Attofluor)不锈钢盖玻片固定器(Molecular Probes(分子探针)，Eugene OR)中的25mm玻璃盖玻片上的活细胞的荧光图像进行成像。在活细胞的情况下，例如，胞内钙被在装载有比率染料fura-2AM(激发705nm和760nm，发射500nm-520nm)或fluo-4AM(激发970nm，发射520nm)的细胞内成像。从来自多种细胞类型和组织的人工培养的细胞和组织部分中准备的载玻片通过使该载玻片与特殊抗血清反应，并利用荧光标记的第二抗体可用于特殊抗原的成像，以检测载玻片上的原始抗体。利用Alexa350，Alexa488和Alexa546标记的次级抗体被用来检测原始抗体。这些染料可用飞秒激光器产生的700nm，976nm和1092nm的光分别或同时激发。多带通发射滤光器(Chroma61003m)被用来监测每一波长处的发射。

例子2.

根据本发明，可改进通道HT高容量筛选(Pathway HT High ContentScreening)显微镜(Atto Bioscience，Inc)以用于2-光子广视场荧光。物镜包括Zeiss 10X，20X，40X，63X和100X Plan-neofluar和Plan-Apcromat，和Olympus 20X 0.75NA和60X 1.4NA物镜。分色镜及激发和发射滤光器轮在激发侧不包含任何滤片器，而是包括Chroma Technology Corporation，Rockingham，VT生产的反射波长为700nm以上的光而通过波长为700nm以下的光的专门分色镜。根据染料和脉冲激光器照明的波长，可以使用450nm到700nm之间的各种带通发射滤光器。用在700-1100nm范围内可调谐的光谱物理学(Mountain View，CA)可调MaiTai飞秒激光器取代弧光灯和用于灯的外部照明路径中的其他光学部件。

能够维持激光束的相干性和横跨扩展光束的激光飞秒脉宽的均匀性的常规设计的扩束器设置在激光器的出口与显微激发光路的入口之间。装置中的Hamamatsu(Japan)Orca-ER冷却CCD相机可以记录荧光图像。该装置固有的软件可用来控制显微镜的焦点、物镜位置，相机以及获取图像。使用单独的计算机控制MaiTai激光器，以选择激光特性和2-光子激发的波长。图像获取软件通过串行线与控制MaiTai激光器的计算机通信，选择激发波长。

使用2-光子显微镜，对来自生长于安装在阿托氟石(attofluor)不锈钢盖玻片固定器(Molecular Probes(分子探针)，Eugene OR)中的25mm玻璃盖玻片上的活细胞的荧光图像进行成像。在活细胞的情况下，例如，胞内钙被在装载有比率染料fura-2AM(激发705nm和760nm，发射500nm-520nm)或fluo-4AM(激发970nm，发射520nm)的细胞内成像。通过用于高产量或高容量药品筛选的本发明，根据它们的荧光发射可以监测多级板内的标记有荧光染料的固定或活的细胞。从来自各种细胞类型和组织的人工培养的细胞和组织部分中制备的载玻片，通过使该载玻片与特殊抗血清反应，并利用荧光标记的第二抗体，可以用于特殊抗原的成像，以检测载玻片上的原始抗体。利用Alexa 350，Alexa 488和Alexa 546标记的次级抗体可被用来检测原始抗体。这些染料利用飞秒激光器产生的700nm，976nm和1092nm光进行激发。多带通发射滤光器(Chroma 61003m)被用来监测每一波长处的发射。

显然，根据上面的教导，本发明的许多改进和改变都是可能的。因此，应当理解的是，在所附权利要求的范围之内，本发明可以以与这里具体描述不同的方式进行实施。

Claims (61)

1.一种广视场显微镜，包括：

配置成固定其内有荧光材料的样品的平台；

配置成产生基本平行的激发光束的多光子激发光源，该激发光束具有的单光子能量低于所述荧光材料的单光子激发所需的吸收能量；

无限校正物镜，其光学耦合到该多光子激发光源并被配置成将基本平行的激发光束聚焦到样品上，以使荧光材料的多光子激发在样品的预定区域上同时发生；

配置成将从该样品的所述预定区域发出的发射光同时地聚焦到图像探测器的至少两个像素上的聚焦透镜。

2.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中所述显微镜不配置成沿着横跨该样品的x或y方向扫描该基本平行的激发光束。

3.根据权利要求2所述的广视场显微镜，还包括分色镜，该分色镜被配置成向该无限校正物镜反射该激发光，并通过其向聚焦透镜传送该发射光。

4.根据权利要求3所述的广视场显微镜，其中该分色镜包括配置成反射相对长波长激发光而通过相对较短波长发射光的表面。

5.根据权利要求3所述的广视场显微镜，还包括设置在该分色镜和聚焦透镜之间的光路中的发射滤光器。

6.根据权利要求1所述的广视场显微镜，还包括：

配置成调整该无限校正物镜和固定在该平台上的该样品之间的距离的移动系统。

7.根据权利要求6所述的广视场显微镜，其中该平台是固定的，而物镜装置沿着任一或所有X，Y，和Z维移动。

8.根据权利要求6所述的广视场显微镜，其中物镜装置是固定的，而该平台沿着任一或所有X，Y，和Z维移动。

9.根据权利要求6所述的广视场显微镜，其中该移动系统包括手工移动系统。

10.根据权利要求6所述的广视场显微镜，其中该移动系统包括机械移动系统。

11.根据权利要求6所述的广视场显微镜，其中该移动系统包括计算机控制的移动系统。

12.根据权利要求6所述的广视场显微镜，其中该移动系统包括压电移动系统。

13.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中检测装置包括摄像机。

14.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中检测装置包括冷却CCD相机。

15.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中检测装置包括电子轰击CCD相机。

16.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该多光子激发光源包括：

配置成发射激发光的激光器；以及

配置成将激发光形成比该激光器提供的光束具有更宽光束直径的基本平行光束的扩束器。

17.根据权利要求16所述的广视场显微镜，其中：

该激光器包括被配置成提供皮秒、飞秒或更短脉冲持续时间的脉冲激光光源，以及

该扩束器被配置成提供基本没有脉冲展宽的脉冲激光。

18.根据权利要求16所述的广视场显微镜，其中：

该激光器包括被配置成提供皮秒、飞秒或更短脉冲持续时间的脉冲激光光源，以及

该扩束器被配置成提供扩展的脉冲激光束，该扩展的脉冲激光束具有横跨该扩展的脉冲激光束的区域的基本均匀特性。

19.根据权利要求18所述的广视场显微镜，其中该扩束器被配置成对所有脉冲光束的光提供基本等量的扩束器介质。

20.根据权利要求16所述的广视场显微镜，其中该扩束器被配置成扩展激光束直径100倍。

21.根据权利要求16所述的广视场显微镜，其中该激光器包括在大约700nm和大约1100nm之间可调谐的可调谐激光器。

22.根据权利要求16所述的广视场显微镜，其中该激光器被配置成输出具有800nm波长的光。

23.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该多光子激发光源包括具有在大约300nm和2000nm之间的波长输出的弧光灯。

24.根据权利要求23所述的广视场显微镜，其中该弧光灯是可调谐的。

25.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该多光子激发光源包括：

配置成产生具有第一波长的激发光的第一激发光发生器；

配置成产生具有第二波长的激发光的第二激发光发生器；以及

配置成将该第一和第二发生器的激发光组合成包括第一和第二波长的基本未聚焦的平行激发光束的光束组合器。

26.根据权利要求25所述的广视场显微镜，其中光发生器包括脉冲至少一个的激光器和弧光灯。

27.根据权利要求25所述的广视场显微镜，其中该光束组合器包括分色镜。

28.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该无限校正物镜包括：

配置成聚焦光束的前面透镜部分；以及

配置成维持光束基本平行的后面透镜部分。

29.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该无限校正物镜装置包括具有4倍放大率和0.10数值孔径(NA)的物镜。

30.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该无限校正物镜包括具有10倍放大率和0.25NA的物镜。

31.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该无限校正物镜包括具有20倍放大率和0.75NA的物镜。

32.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该无限校正物镜包括具有32倍放大率和0.40NA的物镜。

33.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该无限校正物镜包括具有40倍放大率和1.4NA的物镜。

34.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该无限校正物镜包括具有40倍放大率和1.25NA的物镜。

35.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该无限校正物镜包括具有60倍放大率和1.4NA的物镜。

36.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该无限校正物镜包括具有63倍放大率和1.4NA的物镜。

37.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该无限校正物镜包括具有100倍放大率和1.4NA的物镜。

38.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该无限校正物镜包括具有100倍放大率和1.3NA的物镜。

39.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该系统包括直立显微镜或倒转显微镜。

40.根据权利要求1所述的广视场显微镜，其中该多光子激发光源被配置成产生基本未聚焦的平行激发光束，该基本未聚焦的平行激发光束具有的光子能量只有在该荧光材料基本同时吸收2个或更多个光子时才致使样品激发。

41.根据权利要求40所述的广视场显微镜，其中该多光子激发光源被配置成产生基本未聚焦的平行激发光束，该基本未聚焦的平行激发光束具有的光子能量只有在该荧光材料基本同时吸收3个或更多个光子时才致使样品激发。

42.根据权利要求1所述的广视场显微镜，还包括配置成将多个检测的图像组成样品的三维图像的计算机。

43.根据权利要求1所述的广视场显微镜，还包括配置成调整所述基本平行的激发光束的束宽的调整装置。

44.根据权利要求43所述的广视场显微镜，其中所述调整装置包括配置成改变扩束器中的光学元件的相对位移的机构。

45.一种广视场显微镜，包括：

固定其内有荧光材料的样品的装置；

产生基本平行的激发光束的装置，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于该样品内包含的荧光材料其单光子激发所需的吸收能量；

光学耦合到多光子激发光源上的装置，其用于接收基本平行的激发光束，并将该激发光聚焦到样品上，以便荧光材料的多光子激发在样品的预定区域上同时发生；以及

将从该样品的该预定区域产生的发射光同时聚焦到图像探测器的至少两个像素上的装置。

46.根据权利要求45所述的广视场显微镜，还包括向无限校正物镜反射该激发光而通过该发射光到聚焦透镜的装置。

47.根据权利要求46所述的广视场显微镜，还包括用于对该发射光滤光的装置，该用于滤光的装置设置在反射装置和聚焦装置之间的光路中。

48.根据权利要求45所述的广视场显微镜，还包括：

固定该样品的装置；以及

相对于用于接收该基本未聚焦平行光束的装置移动该样品的装置。

49.根据权利要求45所述的广视场显微镜，还包括探测聚焦在像平面上的图像的装置。

50.根据权利要求49所述的广视场显微镜，还包括将多个检测的图像组合成样品的三维图像的装置。

51.一种横跨共焦平面提供广视场激发的方法，该方法包括：

固定其内有荧光材料的样品；

产生基本平行的激发光束，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于在该样品内包含的荧光材料的单光子激发所需的吸收能量；

施加基本平行的激发光束到无限校正物镜，该无限校正物将该激发光聚焦到该样品上，以便荧光材料的多光子激发在样品的预定区域上同时发生；以及

将从该样品的所述预定区域发出的发射光同时聚焦到图像探测器的至少两个像素上。

52.根据权利要求51所述的方法，还包括监测用于高产量或高容量药品筛选的荧光发射的多阱(multi-well)板内的标记有荧光染料的固定或活的细胞。

53.根据权利要求49所述的方法，还包括向该无限校正物镜反射激发光，并通过该发射光到聚焦透镜。

54.根据权利要求50所述的方法，还包括聚焦该发射光到像平面上。

55.根据权利要求50所述的方法，还包括在该像平面之前在沿着聚焦发射光束的会聚点滤光该发射光。

56.根据权利要求50所述的方法，还包括通过相对于该无限校正物镜移动该样品聚焦共焦激发平面。

57.根据权利要求50所述的方法，还包括检测聚焦在该像平面上的图像。

58.根据权利要求47所述的方法，还包括将多个检测的图像组合成样品的三维图像。

59.一种柔性显微镜，包括：

广视场显微镜，包括：

配置成固定其内有荧光材料的样品的平台；

配置成产生基本平行的激发光束的多光子激发光源，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于所述荧光材料的单光子激发所需的吸收能量；

光学耦合到该多光子激发光源并被配置成聚焦基本平行的激发光束到样品上，以便荧光材料的多光子激发在样品的预定区域上同时发生的无限校正物镜；

配置成将从该样品的所述预定区域发出的发射光同时聚焦到图像探测器

的至少两个像素上的聚焦透镜；

耦合到所述广视场显微镜的光纤；以及

附接在该光纤末端的光学部件固定器，其中至少所述广视场显微镜的无限校正物镜包括在所述光学部件固定器内，且该广视场显微镜的所有没包括在该光学部件固定器内的部件包括在光学耦合到该光纤的相反末端的外部单元内。

60.一种广视场显微镜，包括：

配置成固定其内有荧光材料的样品的平台；

配置成产生基本平行的激发光束的多光子激发光源，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于所述荧光材料的单光子激发所需的吸收能量；

光学耦合到该多光子激发光源并被配置成聚焦基本平行的激发光束到样品上，以便荧光材料的多光子激发在样品的预定区域上同时发生的无限校正物镜；

配置成将从该样品的所述预定区域发出的发射光聚焦到像平面的聚焦透镜，以使所述像平面可通过双目目镜观察。

61.一种广视场显微镜，包括：

配置成固定其内有荧光材料的样品的平台；

配置成产生基本平行的激发光束的多光子激发光源，该基本平行的激发光束具有的单光子能量低于所述荧光材料的单光子激发所需的吸收能量；

光学耦合到该多光子激发光源并被配置成聚焦基本平行的激发光束到样品上，以便荧光材料的多光子激发在样品的预定区域上同时发生的无限校正物镜；

配置成将从该样品的所述预定区域发出的发射光聚焦到像平面的聚焦透镜，以使所述像平面可通成像探测器阵列观察。

Images