CN113984632A - 基于动态散斑照明的细胞三维空间迁移追踪方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种基于动态散斑照明的细胞三维空间迁移追踪方法和系统。其特征是：激光器发出的激光光束经扩束整形后，通过散射体在显微物镜的视场范围内形成全场散斑照明，激发待测活体细胞中的荧光团产生荧光信号。依次改变视场范围内的照明散斑图案，获得在不同散斑图案照明下待测活体细胞的多幅荧光图像。通过层析成像提取算法，获得待测活体细胞的三维层析荧光图像，进而实现待测活体细胞在三维空间中迁移过程的追踪方法。本发明可用于待测活体细胞三维空间中迁移过程的快速追踪，具有结构简单、造价低廉、操作简便等特点，可广泛应用于在医学、生物学研究中对特定待测活体细胞的迁移过程的长时间观察和研究。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是一种基于动态散斑照明的细胞三维空间迁移追踪方法和系统，可用于待测活体细胞的三维空间的高时间和空间分辨率的定位和迁移过程追踪，属于生物医学成像方法研究领域。
(二)背景技术
细胞是生命世界的基础，构成我们身体的组织和器官。一直以来，研究人类和动物是如何形成的，从受孕时的单个细胞到出生时的复杂个体，尤其对细胞如何移动和何时移动感兴趣。在很多情况下，细胞会快速地移动。当人体被割伤时，抗感染细胞会聚集到伤口处，吞噬细菌入侵者。然后，血小板细胞和血液中的蛋白质聚集并形成凝块来止血。最后，皮肤细胞开始进入伤口以缝合伤口。肿瘤细胞从原发肿瘤转移到身体其他部位。了解细胞迁移的方式和原因，可以为科学家提供新的方法来指导这些细胞，或者在需要的时候关闭或减缓运动。
细胞轨迹分析可以通过构建细胞间的变化轨迹来重塑细胞随着时间的变化过程，帮助人们从单细胞水平推断细胞之间的演化及分化过程，常见的单细胞轨迹研究方法细胞染色方式和图像序列分割分析方式两种。细胞染色方法过程繁琐，成本昂贵，尤其在针对大量细胞追踪和细胞的生长，增殖过程，精确度不高。图像分析作为新的一种研究方法，由于其基于图像处理和机器学习的图像序列分割分析方式，减少了人为操作，可以得到更为客观和准确的结果，但是程序的编程较为繁琐。
传统的细胞运动研究方法不但需要大量繁琐的人为操作，而且可重复操作性不强，最终的是传统的研究方法由于使用物理化学操作，使得研究结果不能客观的反应在自然条件下细胞的迁移运动过程，因而没有得到广泛的推广和使用。利用具有时间和空间分辨能力的荧光层析显微成像方法，为实现三维空间中待测活体细胞迁移过程的高精度定位和追踪提供了一种新的研究思路。
激光扫描共焦荧光显微技术(Laser Scanning Confocal FluorescenceMicroscopy，LSCM)已成为快速获取生物组织和活体细胞内部精细结构和功能信息的重要研究工具，从根本上改变了我们看待、记录、解释和理解生命体生命活动过程的方式。LSCM基于生物样品自体荧光或通过荧光标记提供高的化学特异性和成像对比度，采用聚焦激光光束逐点扫描的方式激发待测样品中的荧光团产生荧光信号。通过安装在光电探测器共轭位置处的共焦光阑有效消除离焦荧光信号的影响，从而实现具有高空间分辨率的三维层析成像。然而，LSCM系统采用逐点扫描的成像方式，导致成像时间长，激发效率低，结构复杂，造价昂贵。此外，光毒性、光损伤和光致漂白等也是其无法回避的问题。
近年来，基于动态散斑照明的宽场荧光显微成像技术得到了深入的研究和广泛的应用。该成像技术采用动态变化的散斑照明实现具有三维层析成像能力的宽场荧光层析成像方法，具有高的三维空间分辨能力，时间分辨率高，结构简单，成本低廉。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种基于动态散斑照明的细胞三维空间迁移追踪方法和系统，具有成像速度快、时间和空间分辨率高、结构简单等优点。
在基于动态散斑照明的细胞运动三维轨迹追踪方法和系统中，当激光束通过一个不断改变的散射体4时，会在复消色差显微物镜12的后焦面形成一系列随机变化的散斑图案，这些散斑图案用来照明放置在载物台14的培养皿13内的待测活体细胞15。待测活体细胞15受激发后产生的荧光信号分为两个来源，一个是来自复消色差显微物镜12视场焦平面上的荧光信号，另一个则是来自于复消色差显微物镜12视场焦平面以外的背景荧光信号。随着照明散斑图案的改变，散斑照明产生的散粒状分布的荧光强度在复消色差显微物镜12焦平面内发生剧烈变化，而在视场焦平面外的地方却变化缓慢，这种信号特征是实现层析成像的基础。通过CMOS相机8记录待测活体细胞15特定层上一系列变化的散斑图案，利用特殊的算法能够提取该层面的荧光信号，从而具有层析成像功能。
式中，N为图像序列中图像数，Ii为第i幅图像的强度，IRms为采集得到N幅图像的均方根图像，也就是层析成像，N一般取80-90就可以得到比较清晰的荧光层析图像。
通过图像提取算法得到荧光层析图像后，需要确定质心位置的变化来确定其在二维空间中的迁移轨迹。灰度质心法对于均匀光斑能够较准确定位，计算速度快。这种方法就是应用像素的灰度值作为权重来计算光斑的质心，设图片的像素为m×n，每个像素点的灰度值为G(x，y)，则待测活体细胞图像的质心(x0，y0)可表示为：
图像数据处理系统主要由计算机16组成。所述系统中，首先基于动态散斑照明方法获取待测活体细胞15的不同层面的层析图像。其次通过灰度质心法检测出待测活体细胞15在二维空间层面的质心位置并依次连接起来，这样就获得了待测活体细胞15二维空间上的轨迹。然后利用动态散斑照明方法中的均方根算法确定每一个图像上待测活体细胞15不同层面的层析深度，将每一个小球的圆心坐标在三维空间里确定的表示出来，并用线将每一个层析小圆球的圆心用线连接起来，从而可以在三维空间里确定小球的运动轨迹。通过三维空间成像图中的相邻两个层析小球的圆心坐标，可以计算出彼此之间的距离，并通过确定的曝光时间，由此可以计算出小圆球在空间中的运动速度与方向。
动态散斑照明系统主要由激光器1；透镜2、3、6、7；散射体4；微位移台5；双色镜11；复消色差显微物镜12；细胞培养皿13；载物台14；待测活体细胞15组成。所述系统中，激光器1发出的激光光束经透镜2和3扩束后投射到散射体4上后形成散斑图案，再经过透镜6、7的扩束后由双色镜11反射到复消色差显微物镜12后焦平面上形成散斑图案的像，然后在放置在载物台14的培养皿13内的待测活体细胞15上形成全场的散斑照明。然后通过不断调整微位移台5的位置，使得投射在待测活体细胞15的散斑图案不断发生变化，由激光所产生的不同散斑图案激发产生的荧光信号由复消色差显微物镜12收集。由于散斑照明条件下，焦平面附近激发产生的荧光信号变化最剧烈，利用均方根算法即可提取焦平面附近的多种荧光层析图像。
(四)附图说明
图1是一种基于动态散斑照明的细胞三维空间迁移追踪方法和系统示意图。
图2是动态散斑宽场荧光照明方法示意图。
图3是一种基于动态散斑照明的活体细胞迁移运动三维轨迹追踪方法和系统中二维轨迹示意图(a)和三维轨迹示意图(b)。
附图标记说明：1-激光器；2-透镜；3-透镜；4-散射体；5-微位移台；6-透镜；7-透镜；8-CMOS相机；9-成像镜头；10-滤光片；11-双色镜；12-复消色差显微物镜；13-细胞培养皿；14-载物台；15-待测活体细胞；16-计算机。
(五)具体实施方式
下面结合实例对本发明进行进一步的详细说明，以令本领域的技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
一种基于动态散斑照明的细胞三维空间迁移追踪方法和系统，其特征是：所述系统利用动态散斑照明宽场荧光显微成像方法获取活体单细胞的三维结构荧光层析图像，从而实现对活体细胞三维空间迁移过程的追踪。所述系统中主要由激光器1；透镜2、3、6、7；散射体4；微位移台5；CMOS相机8；成像镜头9；滤光片10；双色镜11；复消色差显微物镜12；细胞培养皿13；载物台14；待测活体细胞15；计算机16所组成。所述系统中，激光器1输出的激光光束经透镜2、3扩束后，通过散射体4后形成散斑图案，再经透镜6、7扩束整形后，经双色镜11反射后在复消色差显微物镜12的后焦面上形成散斑图案的像，经复消色差显微物镜12在放置在载物台14的培养皿13内的待测活体细胞15上形成全场的散斑照明。照明散斑激发待测活体细胞15内部的荧光团，产生的荧光信号由复消色差显微物镜12收集，经双色镜11和滤光片10消除杂散光和背景噪声，通过成像镜头9收集后，由CMOS相机8探测接收。通过微位移台5依次调整散射体4的位置，在待测活体细胞15上形成宽场散斑照明图案的动态变化。采集得到的不同散斑图案照明下待测活体细胞的荧光图像由计算机16分析、处理和存储。利用三维层析成像算法，获得待测活体细胞三维结构的荧光层析图像，进而获得三维空间中待测活体细胞的迁移轨迹，实现对活体细胞迁移过程的动态追踪方法。
所述系统中，激光器1发出的激光光束经透镜2和3扩束后投射到散射体4上后形成散斑图案，再经过透镜6、7的扩束后由双色镜11反射到复消色差显微物镜12后焦平面上形成散斑图案的像，然后在放置在载物台14的培养皿13内的待测活体细胞15上形成全场的散斑照明。然后通过不断调整微位移台5的位置，使得投射在待测活体细胞15的散斑图案不断发生变化，由激光所产生的不同散斑图案激发产生的荧光信号由复消色差显微物镜12收集。由于散斑照明条件下，焦平面附近激发产生的荧光信号变化最剧烈，利用均方根算法即可提取焦平面附近的多种荧光层析图像。
所述系统中，所述系统中，首先基于动态散斑照明方法获取待测活体细胞15的不同层面的层析图像。其次通过灰度质心法检测出待测活体细胞15在二维空间层面的质心位置并依次连接起来，这样就获得了待测活体细胞15二维空间上的轨迹。然后利用动态散斑照明方法中的均方根算法确定每一个图像上待测活体细胞15不同层面的层析深度，将每一个小球的圆心坐标在三维空间里确定的表示出来，并用线将每一个层析小圆球的圆心用线连接起来，从而可以在三维空间里确定小球的运动轨迹。通过三维空间成像图中的相邻两个层析小球的圆心坐标，可以计算出彼此之间的距离，并通过确定的曝光时间，由此可以计算出小圆球在空间中的运动速度与方向。
提供以上实例仅仅是为了描述本发明的目的，而并非限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改均应涵盖在本发明的范围内。
Claims (3)
1.一种基于动态散斑照明的细胞三维空间迁移追踪方法和系统，其特征是：所述系统利用动态散斑照明宽场荧光显微成像方法获取活体单细胞的三维结构荧光层析图像，从而实现对活体细胞三维空间迁移过程的追踪。所述系统中主要由激光器1；透镜2、3、6、7；散射体4；微位移台5；CMOS相机8；成像镜头9；滤光片10；双色镜11；复消色差显微物镜12；细胞培养皿13；载物台14；待测活体细胞15；计算机16所组成。所述系统中，激光器1输出的激光光束经透镜2、3扩束后，通过散射体4后形成散斑图案，再经透镜6、7扩束整形后，经双色镜11反射后在复消色差显微物镜12的后焦面上形成散斑图案的像，经复消色差显微物镜12在放置在载物台14的培养皿13内的待测活体细胞15上形成全场的散斑照明。照明散斑激发待测活体细胞15内部的荧光团，产生的荧光信号由复消色差显微物镜12收集，经双色镜11和滤光片10消除杂散光和背景噪声，通过成像镜头9收集后，由CMOS相机8探测接收。通过微位移台5依次调整散射体4的位置，在待测活体细胞15上形成宽场散斑照明图案的动态变化。采集得到的不同散斑图案照明下待测活体细胞的荧光图像由计算机16分析、处理和存储。利用三维层析成像算法，获得待测活体细胞三维结构的荧光层析图像，进而获得三维空间中待测活体细胞的迁移轨迹，实现对活体细胞迁移过程的动态追踪方法。
2.根据权利要求1所述的一种基于动态散斑照明的细胞三维空间迁移追踪方法和系统。动态散斑照明系统主要由激光器1；透镜2、3、6、7；散射体4；微位移台5；双色镜11；复消色差显微物镜12；细胞培养皿13；载物台14；待测活体细胞15组成。所述系统中，激光器1发出的激光光束经透镜2和3扩束后投射到散射体4上后形成散斑图案，再经过透镜6、7的扩束后由双色镜11反射到复消色差显微物镜12后焦平面上形成散斑图案的像，然后在放置在载物台14的培养皿13内的待测活体细胞15上形成全场的散斑照明。然后通过不断调整微位移台5的位置，使得投射在待测活体细胞15的散斑图案不断发生变化，由激光所产生的不同散斑图案激发产生的荧光信号由复消色差显微物镜12收集。由于散斑照明条件下，焦平面附近激发产生的荧光信号变化最剧烈，利用均方根算法即可提取焦平面附近的多种荧光层析图像。
3.根据权利要求1所述的一种基于动态散斑照明的细胞三维空间迁移追踪方法和系统。图像数据处理系统主要由计算机16组成。所述系统中，首先基于动态散斑照明方法获取待测活体细胞15的不同层面的层析图像。其次通过灰度质心法检测出待测活体细胞15在二维空间层面的质心位置并依次连接起来，这样就获得了待测活体细胞15二维空间上的轨迹。然后利用动态散斑照明方法中的均方根算法确定每一个图像上待测活体细胞15不同层面的层析深度，将每一个小球的圆心坐标在三维空间里确定的表示出来，并用线将每一个层析小圆球的圆心用线连接起来，从而可以在三维空间里确定小球的运动轨迹。通过三维空间成像图中的相邻两个层析小球的圆心坐标，可以计算出彼此之间的距离，并通过确定的曝光时间，由此可以计算出小圆球在空间中的运动速度与方向。
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| US20050259319A1 (en) * | 2004-05-19 | 2005-11-24 | Gary Brooker | Method and system for wide-field multi-photon microscopy having a confocal excitation plane |
| CN101303302A (zh) * | 2007-05-11 | 2008-11-12 | 深圳大学 | 用动态散斑照明实现准共焦荧光显微的方法及装置 |
| CN101950424A (zh) * | 2010-09-09 | 2011-01-19 | 西安电子科技大学 | 基于质心跟踪框架的特征关联细胞跟踪方法 |
| CN112835190A (zh) * | 2021-01-04 | 2021-05-25 | 桂林电子科技大学 | 基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统 |
-
2021
- 2021-10-12 CN CN202111189634.2A patent/CN113984632A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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