CN113514441A - 基于细胞旋转主动光操控技术的光片荧光显微方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的是一种基于细胞旋转主动光操控技术的光片荧光显微方法和系统。其特征是：一台激光器输出的激光耦合进显微物镜稳定捕获待测细胞。另一台激光器输出的激光经声光偏转器可偏转不同角度，由显微物镜聚焦交替照射到被捕获细胞两端，实现细胞旋转角度的精准主动光操控。当被捕获细胞旋转至特定角度并稳定后，第三台激光器输出的激光经扩束整形形成片状光，激发照明层面内的荧光团，产生的荧光信号经与片状光垂直的显微物镜收集。通过对细胞旋转的精准主动光操控，获取细胞三维结构的高空间分辨率荧光层析图像。本发明提供的方法和系统具有非接触、光致损伤小、灵活性高等特点，在生物学、医学和生命科学等研究领域中具有广泛的应用前景。

Description

基于细胞旋转主动光操控技术的光片荧光显微方法和系统
(一)技术领域
本发明提供的是一种基于细胞旋转主动光操控技术的光片荧光显微成像方法和系统，通过声光偏转器改变聚焦激光光束的位置，对活体单细胞旋转角度进行精准的主动光操控，从而实现片状光束在细胞内部的快速扫描，获取活体单细胞内部的荧光层析图像，属于光操控和光学显微成像领域。
(二)背景技术
21世纪是生命科学的世纪。人们对生命的认识从结构开始，遵循着由宏观向微观，由整体向局部，从个体到器官、组织、细胞、细胞器、乃至组成生命的基本物质——分子这样一个过程逐步展开。细胞作为生命结构和功能的基本单位，对其进行深入研究是揭示生命现象奥秘、征服疾病和改造生命的关键。随着研究的深入，我们所面临的挑战是以展开生命活动的大环境活细胞作为“试管”，在尽量避免影响细胞自身性质及其所处微环境的前提下，以非接触、无损伤的方式获取活体单细胞的亚细胞精细结构图像信息，细胞生命过程中不同种类生物分子的空间分布及其变化信息，以及细胞器和生物分子、不同种类生物分子之间相互作用过程的功能信息，为在更深层次上揭示生命活动的本质和基本规律提供可靠的科学依据。
随着对生命活动本质逐渐深入的探索，人们希望通过对细胞内部结构进行更加细致的观察，从而逐步获得对细胞结构和功能更清晰的认识。从列文虎克借助第一台显微镜首次发现了细胞结构，到如今的多种类型的新型显微方法和系统被发明出来，借助这些现代化的仪器和先进的技术，人们逐渐打开了微观世界的大门。显微镜的出现，使研究者们对微观世界，尤其是对细胞有了一个全新的认识，让人们对生物的认识从表象进入了实质。
目前的医学研究对显微镜的分辨率、精度的要求都很高，越是复杂的研究就越需要高性能的实验仪器，近几年，生物成像领域始终使研究的热门，日新月异的新技术使得实验方法也多种多样。
随着荧光标记技术、激光技术、微弱信号探测技术和计算机技术的发展，现代显微成像技术能够以前所未有的时间和空间分辨率记录生物系统的时空信息，改变我们看待、记录、解释和理解生物事件的方式。特别是基于自体荧光或通过荧光标记提供高的化学特异性和成像对比度的宽场荧光显微技术成为研究活体单细胞，获取其内部精细三维结构和定量功能信息的重要研究工具。
近年来，使用薄片状激光束实现的光片荧光显微技术已被证明是实现这种具有挑战性目标的首选技术之一。光片荧光显微镜包括激发光路和探测光路两个主要的组成部分。激发光路中使用通常称为“光片”的薄片状激光束作为激发光，激发片状照明区域内的荧光团。探测光路使用宽场荧光信号并行探测方式，在与片状激发光平面垂直的方向收集产生的荧光信号。通过片状激发光的快速扫描，获取待测生物样品具有高空间分辨率的三维结构层析图像。光片荧光显微镜的这种高效的激发和探测方式不仅有效避免了片状照明区域以外的荧光团和内源有机分子的光漂白和光损伤等问题，减少了整个样品所受到的光毒性的影响，保证了在长时间研究过程中待测活体生物样品的活力，而且有效避免了离焦荧光信号的干扰，大大提高了系统的信噪比。
光镊技术利用聚焦光场形成的光阱产生力学效应，可以在不影响细胞内部及所处微环境的条件下，以非机械接触、无损伤的方式稳定捕捉、精准操控和快速筛选单个病毒、细胞甚至生物大分子。此外，光镊不仅可以操控微粒，还可以进行微小力的测量。作为定量分析工具，光镊技术可以对感兴趣的系统施加经校准的皮牛量级的光阱力，实现对光阱力作用引起的目标系统位移量的高精度、高灵敏度的测量。目前，在分子生物学、生物化学和生物物理学等研究领域中，分析光镊技术已经发展成为一种在分子水平上操控和分析细胞的强大工具，广泛应用于生物力学、生物聚合物、生物大分子和分子马达等众多研究领域中。同时，光镊技术的提出和发展为以非机械接触、无损伤的方式长时间观察处于液态环境中的活细胞，获取其内部结构，及其物理和化学性质，进而深入研究细胞生命活动过程的生物调控机制等打开了大门。将光片荧光显微技术与光镊技术有机地结合在一起，使研究人员从对活细胞进行被动的观察转而成为主动的操控，为解决上述问题提供了一种有效的途径。
光片荧光显微镜经过多年的发展，成像速度和分辨率已经满足大多数的实验要求，不容忽视的还有对样品的操控和固定的方式。对样品的固定也对成像有很大的影响，在光片荧光显微成像系统中，为了获取细胞完整的三维结构图像，需要对细胞进行旋转或移动，才能采集到细胞不同层面的完整的信息。现在的技术最多使用的是加入微位移台来控制待测细胞的轴向移动；或者是通过移动光片，通过对样本细胞扫来实现对细胞的层析成像。
本发明公开了一种基于细胞旋转角度主动光操控技术的光片荧光显微成像方法和系统，可广泛应用于获取细胞或微生物的高空间分辨率的三维结构图像。该设计采用高斯光束经过扩束和整形产生片状光，片状光经物镜聚焦在待测细胞中激发荧光分子产生荧光信号，通过检测物镜收集荧光信号并由 CMOS相机记录以获取细胞的层析图像。通过光操控系统控制细胞旋转，得到不同角度上细胞的层析图像，经过图像重构获得细胞的三维结构图像。本设计的光操控系统通过控制声光偏转器实现对细胞旋转角度精准主动光操控的目的，具有结构简单、灵活性高、易于操作、成本低廉等特点，在生物学、医学和生命科学等众多研究领域中具有广泛的应用前景。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种结构简单，操控方便，并且与细胞无接触的基于细胞旋转精准主动光操控技术的光操控光片荧光显微成像方法和系统。
本发明的目的是这样实现的：
它由激光光源1、13、18；透镜2、3、14、15、20、21；反射镜4、22；柱透镜5；复消色差显微物镜6、9、17；滤光片10；成像镜头11；CMOS相机 12；双色镜16；声光偏转器19；片状照明光束7；以及待测活体单细胞8组成。激光器13输出的激光经透镜14、15扩束后，经双色镜16反射耦合进复消色差显微物镜17，作用在待测活体单细胞8上形成聚焦光场，稳定捕获待测活体单细胞。激光器18输出的激光耦合进声光偏转器19，产生具有一定偏转角度的激光光束。经透镜20、21耦合进复消色差显微物镜17。通过交替改变声光偏转器的调制频率，使光束在待测活体单细胞8的两端交替形成聚焦光场，分别作为推动细胞旋转的转动光和停止细胞旋转的制动光，实现对细胞转动角度的精准主动光操控。当细胞旋转至一个角度并达到稳定后，激光光源1输出的激光经透镜2、3扩束后，由反射镜4反射，经柱透镜5整形后耦合进复消色差显微物镜6，产生片状照明光束7照明待测细胞8的一个层面。激发待测活体单细胞8照明区域内的荧光团，产生的荧光信号由光轴与片状照明光束7的平面相垂直的复消色差显微物镜9收集。荧光信号经滤光片10和成像镜头11后，由CMOS相机12探测接收，获取片状照明区域的荧光层析图像。在推动光和制动光的交替作用下，待测活体单细胞8连续转动，实现片状照明光束7在细胞内的快速扫描，从而获取细胞内三维结构的高空间分辨荧光层析图像。
光片荧光显微镜工作时，首先由激光光源发出激光，扩束系统对入射的光束进行扩束，经过柱透镜的整形，最后以片状光的形式照射到待测样品上。光片显微镜的分辨率主要由光片的厚度决定，可以表示为：
Figure BDA0003157581910000041
其中，f为焦距；λ为光源波长；Dl为瑞丽长度。而光片的长度b决定了光片荧光显微镜的视场范围可以表示为：
Figure BDA0003157581910000042
当待测样品被光片照射时，细胞内的荧光标记染料被激发并发出荧光，荧光通过检测物镜收集并传送到CMOS相机，实现对细胞的一个薄层成像的效果。
为了实现对细胞的固定和操控，本发明加入了光操控系统，可以实现对细胞旋转角度精准主动的操控，该光操控装置主要通过声光偏转器19来完成。
其中声光偏转器19通过交替改变声光偏转器的调制频率，使光束交替聚焦在待测活体单细胞8的两端，分别作为推动细胞旋转的转动光和停止细胞旋转的制动光，实现对细胞转动角度的精准主动光操控，控制细胞旋转。激光器13输出的激光经过设计后的光路最终到达细胞，用作对细胞的捕获。图2为光操控细胞示意图。
激光光源13发出的激光由透镜14、15扩束后，经双色镜16反射耦合进复消色差显微物镜17，作用在待测活体单细胞8上形成聚焦光场，稳定捕获待测活体单细胞。激光器18输出的激光耦合进声光偏转器19，产生具有一定偏转角度的激光光束。经透镜20、21耦合进复消色差显微物镜17。通过交替改变声光偏转器的调制频率，使光束在待测活体单细胞8的两端交替形成光场，分别作为推动细胞旋转的转动光和停止细胞旋转的制动光，实现对细胞转动角度的精准主动光操控。
推动时的光功率略大于制动时的光功率，所以随着AOD将激光的角度转换，光功率也应该随之改变，目的是为了给细胞一定的时间旋转，功率变换时序图如图3所示。如图2所示，以细胞顺时针旋转为例，激光经过复消色差显微物镜17照射到细胞左侧以推动细胞旋转，细胞旋转一定角度后AOD改变光偏转的角度，激光此时照射到细胞右侧，对细胞的旋转进行制动，细胞停止后的一段时间内没有操控光的输出，细胞处于静止状态，这段时间用于细胞成像，一段时间后再继续重复上述过程。
每控制细胞旋转一次并且待细胞稳定后，CMOS相机就会获取一次细胞其中一层的图像，当细胞经过多次旋转后，可获得细胞多个层面的结构，如图4所示。
(四)附图说明
图1是一种基于细胞旋转精准主动光操控技术的光操控光片荧光显微成像方法和系统的结构示意图。
图2是光操控部分的示意图，展示了捕获光和操控光的结构，该部分由一束固定的光和一束交替产生的激光构成，用来固定细胞和操控细胞。
图3是对操控细胞旋转和固定的光的功率示意图。
图4是对细胞进行成像的方法的示意图，通过图2光操控部分的固定和多次旋转一定的角度，来对细胞的不同层面进行成像。
附图标记说明：1-激光光源；2-透镜；3-透镜；4-反射镜；5-柱透镜； 6-复消色差显微物镜；7-片状照明光束；8-待测细胞；9-复消色差显微物镜；10- 滤光片；11-成像镜头；12-CMOS相机；13-激光光源；14-透镜；15-透镜；16- 双色镜；17-复消色差显微物镜；18-激光光源；19-声光偏转器；20-透镜；21- 透镜；22-反射镜。
(五)具体实施方式
下面结合实例对本发明进行进一步的详细说明，以令本领域的技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
一种基于细胞旋转角度光操控技术的光操控光片荧光显微成像方法和系统。其特征是：它由激光光源1、13、18；透镜2、3、14、15、20、21；反射镜4、22；柱透镜5；复消色差显微物镜6、9、17；滤光片10；成像镜头11； CMOS相机12；双色镜16；声光偏转器19；片状照明光束7；以及待测活体单细胞8组成。激光器13输出的激光经透镜14、15扩束后，经双色镜16反射耦合进复消色差显微物镜17，作用在待测活体单细胞8上形成聚焦光场，稳定捕获待测活体单细胞。激光器18输出的激光耦合进声光偏转器19，产生具有一定偏转角度的激光光束。经透镜20、21耦合进复消色差显微物镜17。通过交替改变声光偏转器的调制频率，使光束在待测活体单细胞8的两端交替形成光场，分别作为推动细胞旋转的转动光和停止细胞旋转的制动光，实现对细胞转动角度的精准主动光操控。当细胞旋转至一个角度并达到稳定后，激光光源1 输出的激光经透镜2、3扩束后，由反射镜4反射，经柱透镜5整形后耦合进复消色差显微物镜6，产生片状照明光束7照明待测细胞8的一个层面。激发待测活体单细胞8照明区域内的荧光团，产生的荧光信号由光轴与片状照明光束 7的平面相垂直的复消色差显微物镜9收集。荧光信号经滤光片10和成像镜头 11后，由CMOS相机12探测接收，获取片状照明区域的荧光层析图像。在推动光和制动光的交替作用下，待测活体单细胞8连续转动，实现片状照明光束 7在细胞内的快速扫描，从而获取细胞内三维结构的高空间分辨荧光层析图像。
当待测样品被光片照射时，细胞内的荧光染料被激发并发出荧光信号，荧光通过检测物镜收集并传送到CMOS相机达到对细胞的一个薄层成像的效果。为了实现对细胞的固定和操控，本设计加入了光操控系统。细胞的固定是依靠激光光源13发出的激光实现的，激光光源13经过透镜14、透镜15的准直扩束后，由反射镜16经过复消色差显微物镜17形成聚焦光场，稳定捕获细胞。同时要满足捕获光的功率要大于操控细胞旋转的光的功率，才能保证操控细胞旋转时，捕获光稳定的抓住细胞不被操控光推到其他地方。细胞的旋转主要是靠声光偏转器来完成的，激光器18输出的激光耦合进声光偏转器19，产生具有一定偏转角度的激光光束。经透镜20、21耦合进复消色差显微物镜17照射到细胞左侧以推动细胞旋转，细胞旋转一定角度后通过交替改变声光偏转器的调制频率，激光此时照射到细胞右侧，对细胞的旋转进行制动，在AOD的作用下光束在待测活体单细胞8的两端交替形成光场，分别作为推动细胞旋转的转动光和停止细胞旋转的制动光，实现对细胞转动角度的精准主动光操控。细胞停止后的一段时间内没有操控光的输出，细胞处于静止状态，这段时间用于细胞成像，此时光片显微镜开始工作，对细胞的一层进行成像，CMOS相机获取到细胞的层析图像后，重复上述成像过程，获取完整的细胞结构。
对于同一个种类的细胞，捕获光的强度保持不变，并且强度要大于推动光，来确保细胞固定，不会在推动光的作用下推到视野外。细胞在培养液中的旋转相对缓慢，所以细胞推动时的光功率要略大于制动时的光功率，并且制动与推动之间有一小段时间间隔，这段时间让细胞在惯性作用下旋转，旋转过一个角度后开始制动，细胞缓慢停止，细胞在推动光推动阶段，惯性旋转阶段，以及制动阶段旋转过的角度之和就是每一次成像细胞旋转的角度，这个角度可以通过控制光功率的大小，以及时间间隔的长短来控制，满足我们对不同大小、不同质量的细胞都可以精确的控制旋转的角度。
细胞每旋转一次并且稳定后，CMOS相机就可以获得该角度的细胞的一层结构图象，当细胞多次旋转后，就可获得细胞完整的三维结构图像。
提供以上实例仅仅是为了描述本发明的目的，而并非限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改均应涵盖在本发明的范围内。

Claims (3)

1.本发明提供的是一种基于细胞旋转主动光操控技术的光片荧光显微成像方法和系统。其特征是：它由激光光源1、13、18；透镜2、3、14、15、20、21；反射镜4、22；柱透镜5；复消色差显微物镜6、9、17；滤光片10；成像镜头11；CMOS相机12；双色镜16；声光偏转器19；片状照明光束7；以及待测活体单细胞8组成。激光器13输出的激光经透镜14、15扩束后，经双色镜16反射耦合进复消色差显微物镜17，作用在待测活体单细胞8上形成聚焦光场，稳定捕获待测活体单细胞。激光器18输出的激光耦合进声光偏转器19，产生具有一定偏转角度的激光光束。经透镜20、21耦合进复消色差显微物镜17。通过交替改变声光偏转器的调制频率，使光束交替聚焦在待测活体单细胞8的两端，分别作为推动细胞旋转的转动光和停止细胞旋转的制动光，实现对细胞转动角度的精准主动光操控。当细胞旋转至一个角度并达到稳定后，激光光源1输出的激光经透镜2、3扩束后，由反射镜4反射，经柱透镜5整形后耦合进复消色差显微物镜6，产生片状照明光束7照明待测细胞8的一个层面。激发待测活体单细胞8照明区域内的荧光团，产生的荧光信号由光轴与片状照明光束7的平面相垂直的复消色差显微物镜9收集。荧光信号经滤光片10和成像镜头11后，由CMOS相机12探测接收，获取片状照明区域的荧光层析图像。在推动光和制动光的交替作用下，待测活体单细胞8连续转动，实现片状照明光束7在细胞内的快速扫描，从而获取细胞内三维结构的高空间分辨荧光层析图像。
2.根据权利要求1所述的光操控装置：光操控部分由激光器13发出的捕获光和激光器18发出的经声光偏转器19控制的可偏转的光组成。捕获光的作用是稳定捕获待测细胞，使细胞固定在一个位置，以便于成像和绕固定轴心旋转。激光器18发出的激光耦合进声光偏转器19，改变声光偏转器19的调制频率从而改变激光的偏转角度，通过显微物镜17聚焦在被捕获细胞的一侧来推动细胞。当细胞转过一定的角度，通过声光偏转器19使激光聚焦在细胞的另一端，对转动中的细胞起到制动作用。当细胞静止时，CMOS相机再次收集不同角度的细胞的结构图像。在捕获光、推动光和制动光的共同作用下，细胞绕特定转动轴连续转动，从而实现片状照明光在细胞内部的快速扫描，最终获取细胞的三维结构图像。
3.根据权利要求1所述的片状光成像系统。其特征是：所述的光片显微镜是由激光光源1发出的激光由透镜2、3组成的扩束系统扩束，经过反射镜4的反射，经柱透镜5整形后耦合进复消色差显微物镜6，产生片状照明光束7照明待测细胞8的一个层面。待测细胞8的某一层被片状光的束腰部分激发，细胞中带有荧光染料标记的结构被激发出荧光，荧光信号通过复消色差显微物镜9收集，经滤光片10消除背景噪声，由CMOS相机12记录获得荧光图像。再经由上述光操控系统使细胞旋转一定的角度，待细胞稳定后拍摄细胞在不同角度的荧光图像，最终通过图像处理获得完整的细胞三维结构图像。
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