CN113281305B - 一种基于散射介质实现超分辨显微成像方法及其装置 - Google Patents

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Abstract

本发明属于光学显微成像、散射光学以及计算成像交叉领域。基于散射介质实现超分辨显微成像装置主要由照明装置1、载物台2、待观测目标3、散射介质4、光阑5、面阵探测器6和中央处理器7构成。其中，面阵探测器6与散射介质4之间的距离，需要通过考虑探测的散斑图满足奈奎斯特定理来确定；待观测目标3到散射介质4的距离，由显微成像具体的视场和分辨率来确定。光阑5紧靠散射介质4；待观测目标3置于载物台2上，由中央处理器7控制照明装置1主动引入稀疏且随机点光源照明。本发明还涉及基于散射介质实现超分辨显微成像方法。

Description

一种基于散射介质实现超分辨显微成像方法及其装置
技术领域
本发明属于光学显微成像、散射光学以及计算成像交叉领域，具体涉及一种基于散射介质结合计算成像技术。
背景技术
超分辨光学成像技术通常指的是基于远场光学显微镜的超分辨成像技术，主要包括两种实现途径：一种是基于特殊强度分布照明光场的超分辨成像方法(如STED)。另一种是基于单分子成像和定位的方法(如PALM)。1.受激发射损耗显微镜技术(StimulatedEmission Depletion Microscopy，简称STED)该成像理论来源于爱因斯坦的受激辐射理论，德国科学家斯蒂芬·赫尔(Stefan W.Hell)创造性地利用受激辐射来抑制自发荧光辐射，最终实现了受激发射损耗显微镜技术(STED)。一个典型的STED显微镜需要两束严格共轴的激光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光(也称STED光)。利用激发光使艾里斑范围内的荧光分子被激发，其电子从基态跃迁到激发态。随后，使用甜甜圈型(Doughnut，跟救生圈形状类似)的损耗光照射样品，使得处于激发光斑外围的激发态分子以受激辐射的方式释放能量回到基态，而位于激发光斑内部区域的激发态分子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。这种照明方式的组合，将荧光发射区域限制在小于艾里斑的区域内，获得了一个小于衍射极限的荧光发光点。最后，通过在二维(或三维)空间内扫描共轴的激发光和损耗光，获得一幅二维(或三维)超分辨图像。1994年，斯蒂芬·赫尔等人提出了STED显微镜的理论。2000年，斯蒂芬·赫尔研究组通过生物实验证实了STED显微镜的超分辨成像能力。2.光激活定位显微镜技术(Photoactivation Localization Microscopy，简称PALM)阿贝极限指出，在远场无法分辨相距l/2NA的两个荧光分子所成的像，但是并没有对单个荧光分子的中心位置确定精度进行限制。如果在艾里斑内仅有一个分子在发射荧光，我们可以利用单分子定位算法并结合光学系统艾里斑的形状，以超高精度(纳米量级)获得荧光分子的中心位置。倘若将这个单分子定位思想用于实现超分辨成像，其关键在于如何在一个艾里斑内区分多个荧光分子。为了克服一个艾里斑内只允许一个分子发射荧光的限制，1995年美国科学家埃里克·白兹格(Eric Betzig)通过理论分析，提出可以利用光谱特性对艾里斑内的发射波长不同的荧光分子进行分时探测和中心位置定位，从而实现荧光密集标记样本的超分辨成像。2006年，埃里克·白兹格等人利用光激活绿色荧光蛋白(PA-GFP)的可控荧光开关特性，结合单分子定位算法，实现了生物样本的超分辨成像。他们首先利用低能量的405nm激光(激活光)来稀疏活化PA-GFP，再使用561nm激光(激发光)对活化后的PA-GFP进行单分子荧光成像，直至活化后的PA-GFP分子被光漂白。重复激活-激发-定位-漂白过程，可以在艾里斑内高精度找到大量PA-GFP分子的中心位置，从而重建出一幅由PA-GFP分子中心位置组成的超分辨图像。这种技术被称为光激活定位显微镜(Photoactivation Localization Microscopy,简称PALM)。2006年，哈佛大学的庄小威小组提出了随机光学重建显微镜(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，简称STORM)，其成像原理与PALM类似，但是在密集标记样本内实现荧光发射稀疏化的方案有所不同。
这些传统的显微成像技术无一例外都需要构成的镜头。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：如何基于散射介质实现超分辨显微成像，不需要使用透镜。
本发明所采用的技术方案是：基于散射介质实现超分辨显微成像方法，按如下步骤进行：
步骤一：引入主动照明，使待观测目标的稀疏位置点随机发光n次，则有
Figure BDA0003069446200000021
其中，O是待观察目标的图像，Oi是待观察目标第i次发光的位置点图，n为自然数；
步骤二：采集步骤一中待观测目标的每次发光经过散射介质散射后形成的散斑图，待观测目标的n次发光相应采集获得n幅散斑图；
步骤三：待观察目标第i次发光经过散射介质散射后形成的散斑图为Ii，计算其自相关值Ii★Ii，其中★表示自相关运算；
步骤四：由于散射介质的记忆效应，即在一定的视场角度范围内，待观察目标的自相关近似等于经过介质散射测得散斑图的自相关，即
Figure BDA0003069446200000031
其中P为功率谱，因此，依据该功率谱P，通过相位恢复算法，可以计算得到
Figure BDA0003069446200000032
Figure BDA0003069446200000033
是Oi经过散射介质的模糊的像，即因为散射介质衍射极限限制，
Figure BDA0003069446200000034
步骤五：对相位恢复获得的
Figure BDA0003069446200000035
上稀疏的每个模糊点位置，实施高斯拟合重定位处理，获得
Figure BDA0003069446200000036
使它几乎等于Oi，即突破衍射极限限制，使
Figure BDA0003069446200000037
步骤六：在记忆效应范围内，基于散射介质实现超分辨显微成像系统，可以看成是一个线性系统，因而满足
Figure BDA0003069446200000038
相应地
Figure BDA0003069446200000039
因而，可以由散斑图Ii和步骤四计算得到的
Figure BDA00030694462000000310
去获得该成像系统的点扩散函数PSF，由维纳反卷积算法得到PSF：
Figure BDA00030694462000000311
其中，deconv表示反卷积，{ }c表示复共轭，FFT{ }表示快速傅里叶变换，FFT-1{ }表示逆快速傅变换里叶变换，SNR表示系统的信噪比；
步骤七：由于系统是线性移不变的，因而可由步骤六计算得到的PSF和步骤二记录的n个散斑图，逐个地先经过反卷积运算，然后实施高斯拟合重定位处理获得
Figure BDA00030694462000000312
即有：
Figure BDA00030694462000000313
其中，k＝1...n，Loc{ }表示高斯拟合重定位处理；
步骤八：把步骤七中获得的所有
Figure BDA00030694462000000314
对应位置叠加，就可以获得突破衍射极限的超分辨图像
Figure BDA00030694462000000315
即有：
Figure BDA00030694462000000316
突破衍射极限的超分辨图像
Figure BDA00030694462000000317
几乎完全等于待观测目标图像。
基于散射介质实现超分辨显微成像装置主要由照明装置1、载物台2、待观测目标3、散射介质4、光阑5、面阵探测器6和中央处理器7构成。其中，面阵探测器6与散射介质4之间的距离，需要通过考虑探测的散斑图满足奈奎斯特定理来确定；待观测目标3到散射介质4的距离，由显微成像具体的视场和分辨率来确定。光阑5紧靠散射介质4；待观测目标3置于载物台2上，由中央处理器7控制照明装置1主动引入稀疏且随机点光源照明。
本发明具有如下优点：成像装置结构简单；无需复杂的光机结构，就可以实现纳米尺度成像；性价比很高。仅利用基于散射介质的简易装置，就能实现纳米量级超分辨显微成像。具有成像系统装置简单、成像分辨率高、性价比高等优点。适合于生物学和生命科学等领域中，对纳米尺度微观结构的观测应用。
本发明属于无透镜成像的范畴，它不是由透镜成像原理来实现，而是依据散射介质的记忆效应实现的，即在一定的视场角度范围内，待成像目标的自相关，近似等于经过介质散射测得散斑图的自相关。为了实现超分辨成像，本发明首次提出利用待观测目标发光稀疏性、随机性、以及探测获得的对应一些列散斑图的相关性，结合计算成像算法，就可以实现纳米量级超分辨显微成像。具有成像系统装置简单、成像分辨率高、性价比高等优点。适合于生物学和生命科学等领域中，对纳米尺度微观结构的观测应用。
附图说明
图1基于散射介质实现超分辨显微成像装置示意图
1、照明装置 2、载物台 3、待观测目标 4、散射介质 5、光阑 6、面阵探测器 7、中央处理器。
具体实施方式
基于散射介质实现超分辨显微成像装置，包括按顺序直线顺序排列的照明装置1、载物台2、散射介质4、面阵探测器6，待观测目标3安装在载物台2上，光阑5安装在散射介质4的上表面，照明装置1发出的光照在载物台2上，待观测目标(3)通过光阑5后被面阵探测器6探测，照明装置1和面阵探测器6连接中央处理器7，面阵探测器6与散射介质4之间的距离满足奈奎斯特定理
面阵探测器6与散射介质4之间的距离，需要通过考虑探测的散斑图满足奈奎斯特定理来确定；待观测目标3到散射介质4的距离，由显微成像具体的视场和分辨率来确定。光阑5紧靠散射介质4；待观测目标3置于载物台2上，由中央处理器7控制照明装置1主动引入稀疏且随机点光源照明。
基于散射介质实现超分辨显微成像方法的步骤如下：
步骤一：通过中央处理器7控制照明装置1，使待观测目标的稀疏位置点(透光点)随机发光n次，则有
Figure BDA0003069446200000051
其中，O是待观察目标的图像，Oi是待观察目标第i次发光的位置点图，n为自然数；
步骤二：中央处理器7通过面阵探测器6，采集步骤一中待观测目标的每次发光经过散射介质4散射后形成的散斑图，待观测目标的n次发光相应采集获得n幅散斑图；
步骤三：待观察目标第i次发光经过散射介质散射后形成的散斑图为Ii，计算其自相关值Ii★Ii，其中★表示自相关运算；
步骤四：由于散射介质的记忆效应，即在一定的视场角度范围内，待观察目标的自相关近似等于经过介质散射测得散斑图的自相关，即
Figure BDA0003069446200000052
其中P为功率谱，因此，依据该功率谱P，通过相位恢复算法，可以计算得到
Figure BDA0003069446200000053
Figure BDA0003069446200000054
是Oi经过散射介质的模糊的像，即因为散射介质衍射极限限制，
Figure BDA0003069446200000055
步骤五：对相位恢复获得的
Figure BDA0003069446200000056
上稀疏的每个模糊点位置，实施高斯拟合重定位处理，获得
Figure BDA0003069446200000057
使它几乎等于Oi，即突破衍射极限限制，使
Figure BDA0003069446200000058
步骤六：在记忆效应范围内，基于散射介质实现超分辨显微成像系统，可以看成是一个线性系统，因而满足
Figure BDA0003069446200000059
相应地
Figure BDA00030694462000000510
因而，可以由散斑图Ii和步骤四计算得到的
Figure BDA00030694462000000511
去获得该成像系统的点扩散函数PSF，由维纳反卷积算法得到PSF：
Figure BDA00030694462000000512
其中，deconv表示反卷积，{ }c表示复共轭，FFT{ }表示快速傅里叶变换，FFT-1{ }表示逆快速傅变换里叶变换，SNR表示系统的信噪比；
步骤七：由于系统是线性移不变的，因而可由步骤六计算得到的PSF和步骤二记录的n个散斑图，逐个地先经过反卷积运算，然后实施高斯拟合重定位处理获得
Figure BDA0003069446200000061
即有：
Figure BDA0003069446200000062
其中，k＝1...n，Loc{ }表示高斯拟合重定位处理；
步骤八：把步骤七中获得的所有
Figure BDA0003069446200000063
对应位置叠加，就可以获得突破衍射极限的超分辨图像
Figure BDA0003069446200000064
即有：
Figure BDA0003069446200000065
突破衍射极限的超分辨图像
Figure BDA0003069446200000066
几乎完全等于待观测目标图像。
面阵探测器可以为CCD相机、sCOMS，散射介质为人工透明散射介质中一种如毛玻璃。

Claims (1)

1.基于散射介质实现超分辨显微成像方法，其特征在于按如下步骤进行：
步骤一：引入主动照明，使待观测目标的稀疏位置点随机发光n次，则有
Figure FDA0003835587090000011
其中，O是待观察目标的图像，Oi是待观察目标第i次发光的位置点图，n为自然数；
步骤二：采集步骤一中待观测目标的每次发光经过散射介质散射后形成的散斑图，待观测目标的n次发光相应采集获得n幅散斑图；
步骤三：待观察目标第i次发光经过散射介质散射后形成的散斑图为Ii，计算其自相关值Ii★Ii，其中★表示自相关运算；
步骤四：由于散射介质的记忆效应，即在一定的视场角度范围内，待观察目标的自相关近似等于经过介质散射测得散斑图的自相关，即
Figure FDA0003835587090000012
其中P为功率谱，因此，依据该功率谱P，通过相位恢复算法，可以计算得到
Figure FDA0003835587090000013
是Oi经过散射介质的模糊的像，即因为散射介质衍射极限限制，
Figure FDA0003835587090000014
步骤五：对相位恢复获得的
Figure FDA0003835587090000015
上稀疏的每个模糊点位置，实施高斯拟合重定位处理，获得
Figure FDA0003835587090000016
使它几乎等于Oi，即突破衍射极限限制，使
Figure FDA0003835587090000017
步骤六：在记忆效应范围内，基于散射介质实现超分辨显微成像系统，可以看成是一个线性系统，因而满足
Figure FDA0003835587090000018
相应地
Figure FDA0003835587090000019
因而，可以由散斑图Ii和步骤四计算得到的
Figure FDA00038355870900000110
去获得该成像系统的点扩散函数PSF，由维纳反卷积算法得到PSF：
Figure FDA00038355870900000111
其中，deconv表示反卷积，{}c表示复共轭，FFT{}表示快速傅里叶变换，FFT-1{}表示逆快速傅变换里叶变换，SNR表示系统的信噪比；
步骤七：由于系统是线性系统，因而可由步骤六计算得到的PSF和步骤二记录的n个散斑图，逐个地先经过反卷积运算，然后实施高斯拟合重定位处理获得
Figure FDA0003835587090000026
即有：
Figure FDA0003835587090000021
其中，k＝1...n，Loc{}表示高斯拟合重定位处理；
步骤八：把步骤七中获得的所有
Figure FDA0003835587090000022
对应位置叠加，就可以获得突破衍射极限的超分辨图像
Figure FDA0003835587090000023
即有：
Figure FDA0003835587090000024
突破衍射极限的超分辨图像
Figure FDA0003835587090000025
几乎完全等于待观测目标图像。
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