KR101252938B1 - 초고해상도 현미경 시스템 및 그 시스템을 이용한 영상 획득 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 실시예들은 초고해상도 현미경 시스템 및 그 시스템을 이용한 영상 획득 방법에 관한 것으로, 불규칙적인 산란광을 입사하여 인접한 공간에서의 상관관계를 적게 만들어 이러한 특성을 이용하여 대상 물체를 고해상도로 관찰할 수 있는 방법 및 그 현미경 시스템에 관련된다. 본 발명의 실시예에 의하면, 세포 연구에 유용한 형광 현미경의 회절한계를 극복할 수 있고, 나노미터급 초고수준의 해상도의 영상을 얻을 수 있다.
Description
아래 실시예들은 초고해상도 현미경 시스템 및 그 시스템을 이용한 영상 획득 방법에 관한 것으로, 형광 특성을 이용하여 대상 물체를 고해상도로 관찰할 수 있는 방법 및 그 현미경 시스템에 관련된다.
종래의 광학 현미경은 빛의 파장과 렌즈의 개구수(numerical aperture)에 따라서 최대 해상도가 제한된다. 따라서, 종래의 광학 현미경은 근접장 영역을 제외한 원거리 영역에서 최대 해상도가 파장의 0.5배 정도가 되고, 이를 회절한계 (diffraction limitation)라 부른다. 이러한 회절한계에 의해서, 광학계에서는 세포내부의 분자단위 기관들의 해부학적 구조나 신호전달과정을 이해하기 힘들 수 있다.
형광 입자와 형광 단백질은 세포 연구에서 형태학적 특징을 이해하고 신호전달 과정에서 수반되는 단백질 발현과정을 관찰하기에 유용하다.
형광 기법을 이용한 측정 방법은 형광 물질을 세포의 관심 영역에 직접 붙이거나, 특정 단백질에 부착된 형광 물질을 이용하여 세포의 해부학적 영상이나 신호 전달등을 관찰한다. 그러나, 이러한 방법으로는 광학계의 회절한계를 극복하는데 한계가 있을 수 있으며, 특히, 파장의 0.5배보다 작은 물체에 대한 영상 획득에는 제한이 있을 수 있다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 비선형적인 형광물질의 특성을 이용하는 여러가지 방법들이 있다. 예를 들어서, STED(Stimulated Emission Depletion) 방법이나, 혹은 PALM(Photo-activated Localization Microscopy)와 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)와 같이 형광 물질이나 광학계 비선형적인 특성을 이용하여 응집된 분자구조에서 단일 분자들을 활성화하여 각 분자들의 위치를 추정하는 여러 방법들이 있다. 그러나, 이와 같이 비선형적인 형광물질의 특성을 이용하는 방법들은 비선형적 천이가 가능한 형광물질을 사용해야 하는 단점이 있다.
본 발명의 실시예에 의하면, 무작위 산란 무늬를 이용하여 세포 연구에 유용한 형광 현미경의 회절한계를 극복할 수 있는 초고해상도 현미경 시스템 및 그 시스템을 이용한 영상 획득 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 의하면, 배열신호처리 기법을 이용하여 나노미터급 초고수준의 해상도를 얻을 수 있는 초고해상도 현미경 시스템 및 그 시스템을 이용한 영상 획득 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 초고해상도 현미경 시스템은 대상 물체의 형광 광원들을 촬영하기 위하여 송출된 레이저의 빛을 산란기에 통과시켜 산란 무늬를 생성하는 산란 무늬 생성기와, 적어도 하나의 광학 렌즈를 배치하여, 상기 생성된 산란 무늬를 시편에 맺히도록 입사하는 입사 광학계와, 상기 입사된 산란 무늬를 적어도 하나의 여기 필터 및 형광 필터에 차례로 통과시켜, 상기 산란 무늬의 형광빛을 촬영하는 형광 영상 광학계를 포함한다.
이때, 상기 산란 무늬 생성기는 반사형 또는 투과형 산란기를 이용하여 불규칙 패턴을 가지는 산란 무늬를 생성할 수 있다.
또한, 상기 산란기를 통과한 빛은 인접한 빛에 대하여 공간적으로 상관관계가 적어지도록 만들어질 수 있다.
또한, 상기 입사 광학계는 상기 생성된 산란 무늬를 시편에 맺히도록 입사하되, 상기 산란 무늬의 불규칙 패턴의 크기가 회절한계를 가지는 광학렌즈를 배치하거나, 또는 회절 한계가 줄어지도록 전반사 광학계를 배치할 수 있다.
또한, 상기 여기 필터 및 상기 형광 필터에 차례로 통과된 산란 무늬는 상기 여기 필터에 의해 형광 물질이 여기된 후, 상기 형광 필터에 의해 형광 빛이 선택적으로 통과되는 특징을 가질 수 있다.
또한, 상기 입사 광학계 또는 상기 형광 영상 광학계는 반사형 현미경, 투과형 현미경, 전반사 광학 현미경 중 적어도 하나를 위한 구조로 배치될 수 있다.
또한, 상기 초고해상도 현미경 시스템은 상기 형광 영상 광학계를 통해 촬영된 영상을 반복적으로 획득하고, 상기 반복적으로 획득된 영상을 기초로, 시간에 따라 각 화소에서 변화하는 데이터를 감지하여 상기 영상을 고해상도로 복원하는 영상 복원 알고리즘을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 영상 복원 알고리즘은 배열 신호 처리 기법을 통해, 상기 촬영된 영상에 대한 불규칙 패턴을 생성하고, 상기 생성된 불규칙 패턴을 이용하여 공분산행렬의 광원들의 상관관계 및 점확산함수를 산출하고, 상기 산출 결과를 기초로 상기 대상 물체의 형광 광원들에 대한 영상을 고해상도로 복원할 수 있다.
또한, 상기 영상 복원 알고리즘은 아래의 수학식을 이용하여, 상기 공분산 행렬을 계산할 수 있다.
여기서, T는 총 영상획득 시간을 나타내고, 
는 일정 시간에서 형광 광원들의 변화를 측정한 데이터를 나타내고, R은 공분산행렬을 나타내고, 
는 잡음 공분산 행렬을 나타내고, A는 광원들의 점확산함수를 나타내고, P는 광원들의 상관관계를 나타낸다.
또한, 상기 영상 복원 알고리즘은 산란광이 인접한 공간에서 시간적인 상관관계가 적은 성질을 이용할 수 있다.
또한, 상기 영상 복원 알고리즘은 상기 촬영된 영상의 신호를 신호부공간과 잡음부공간으로 분해하고, 상기 분해된 잡음부공간을 이용하여 잡음이 최소가 되는 위치에 상기 신호가 존재한다는 원리를 이용하여, 상기 대상 물체의 형광 광원들의 위치를 복원할 수 있다.
또한, 상기 영상 복원 알고리즘은 부공간기법, 배열신호처리 기법 또는 MUSIC 방법을 이용하여, 상기 대상 물체의 형광 광원들의 위치를 복원할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법은 대상 물체의 형광 광원들을 촬영하기 위한 레이저를 송출하는 단계와, 상기 송출된 레이저의 빛을 산란기에 통과시켜 산란 무늬를 생성하는 단계와, 적어도 하나의 광학 렌즈를 이용하여, 상기 생성된 산란 무늬를 시편에 맺히도록 입사하는 단계와, 상기 입사된 산란 무늬를 적어도 하나의 여기 필터 및 형광 필터에 차례로 통과시켜, 상기 산란 무늬의 형광빛을 촬영하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 빛을 산란기에 통과시켜 산란 무늬를 생성하는 단계는 반사형 또는 투과형 산란기를 이용하여 불규칙 패턴을 가지는 산란 무늬를 생성할 수 있다.
또한, 상기 산란기를 통과한 빛은 인접한 공간에서의 시간적인 상관관계가 적어지도록 만들어질 수 있다.
또한, 상기 적어도 하나의 광학 렌즈는 상기 산란 무늬의 불규칙 패턴의 크기가 회절한계를 가지도록 배치될 수 있다.
또한, 상기 여기 필터 및 상기 형광 필터에 차례로 통과된 산란 무늬는 상기 여기 필터에 의해 형광 물질이 여기된 후, 상기 형광 필터에 의해 형광 빛이 선택적으로 통과되는 특징을 가질 수 있다.
또한, 상기 초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법은 상기 형광 영상 광학계를 통해 촬영된 영상을 반복적으로 획득하는 단계와, 상기 반복적으로 획득된 영상을 기초로, 시간에 따라 각 화소에서 변화하는 데이터를 감지하여 상기 영상을 고해상도로 복원하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 영상을 고해상도로 복원하는 단계는 배열 신호 처리 기법을 통해, 상기 반복적으로 획득된 영상에 대한 불규칙 패턴을 생성하는 단계와, 상기 생성된 불규칙 패턴을 이용하여 공분산행렬의 광원들의 상관관계 및 점확산함수를 산출하는 단계와, 상기 산출 결과를 기초로 상기 대상 물체의 형광 광원들에 대한 영상을 고해상도로 복원하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 영상 복원 알고리즘은 형광 여기 빛의 통계적인 분포가 공간적인 상관이 적도록 할 수 있다.
또한, 상기 영상을 고해상도로 복원하는 단계는 상기 촬영된 영상의 신호를 신호부공간과 잡음부공간으로 분해하고, 상기 분해된 잡음부공간을 이용하여 잡음이 최소가 되는 위치에 상기 신호가 존재한다는 원리를 이용하여, 상기 대상 물체의 형광 광원들의 위치를 복원할 수 있다.
또한, 상기 영상 복원 알고리즘은 부공간기법, 배열신호처리 기법 또는 MUSIC 방법을 이용하여, 상기 대상 물체의 형광 광원들의 위치를 복원할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 초고해상도 현미경 시스템은 입사 광학계와, 형광 영상 광학계와, 대상 물체의 형광 광원들을 촬영하기 위하여 송출된 레이저의 빛을 산란기에 통과시켜 산란 무늬를 생성하는 산란 무늬 생성기와, 영상 복원 알고리즘을 구동하는 영상 복원 알고리즘 구동기를 포함하고, 상기 입사 광학계 및 상기 형상 광학계는 적어도 하나의 광학 렌즈를 반사형 현미경, 투과형 현미경, 전반사 광학 현미경 중 적어도 하나를 위한 구조로 배치되고, 상기 영상 복원 알고리즘 구동기는 상기 영상 복원 알고리즘을 구동함으로써, 상기 형광 영상 광학계를 통해 촬영된 영상을 반복적으로 획득하고, 상기 반복적으로 획득된 영상을 기초로, 시간에 따라 각 화소에서 변화하는 데이터를 감지하여 상기 영상을 고해상도로 복원한다.
또한, 상기 영상 복원 알고리즘 구동기는 배열 신호 처리 기법을 통해, 상기 촬영된 영상에 대한 불규칙 패턴을 생성하고, 상기 생성된 불규칙 패턴을 이용하여 공분산행렬의 광원들의 상관관계 및 점확산함수를 산출하고, 상기 산출 결과를 기초로 상기 대상 물체의 형광 광원들에 대한 영상을 고해상도로 복원할 수 있다.
본 발명의 실시예에 의하면, 불규칙 패턴과 배열신호처리 기법을 이용하여 나노미터급 초고해상도의 영상을 획득함으로써, 대상 물체의 형광 광원들에 대한 영상을 고해상도로 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 의하면, 비선형적 천이를 위한 고출력 레이저의 도움이 필요하지 않으며, 또한 비선형적 형광 물질과 같은 특정 형광 물질만의 사용에 국한되지 않을 수 있다.
아울러, 본 발명의 실시예들에 의하면, 무작위 산란 무늬를 이용하여 기존의 형광 현미경의 입사 광학계를 수정하여 세포 연구에 유용한 형광 현미경의 회절한계를 극복할 수도 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 초고해상도 현미경 시스템의 구성을 설명하기 위한 도면.
도 2는 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템의 동작을 보여주는 도면.
도 3a 및 도 3b는 상기 초고해상도 현미경 시스템에서 투과형 또는 반사형 산란기를 통과하는 결맞은 빛을 보여주는 도면.
도 4는 도 1의 초고해상도 현미경 시스템에서 구현될 수 있는 현미경 구조의 제1 예시를 보여주는 도면.
도 5는 도 1의 초고해상도 현미경 시스템에서 구현될 수 있는 현미경 구조의 제2 예시를 보여주는 도면.
도 6은 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템에 의한 마이크로 형광 비드 결과 영상의 일례를 보여주는 도면.
도 7은 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템 및 종래의 현미경 시스템에 대한 액틴 형광 염색 결과 영상의 일례를 설명하기 위한 도면.
도 8은 도 7에 도시된 액틴 형광 염색 결과 영상들을 비교하기 위한 그래프를 보여주는 도면.
도 9a 및 도 9b는 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템에 의한 마이토콘드리아(mitochondria) 염색 결과 영상의 일례를 보여주는 도면.
도 2는 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템의 동작을 보여주는 도면.
도 3a 및 도 3b는 상기 초고해상도 현미경 시스템에서 투과형 또는 반사형 산란기를 통과하는 결맞은 빛을 보여주는 도면.
도 4는 도 1의 초고해상도 현미경 시스템에서 구현될 수 있는 현미경 구조의 제1 예시를 보여주는 도면.
도 5는 도 1의 초고해상도 현미경 시스템에서 구현될 수 있는 현미경 구조의 제2 예시를 보여주는 도면.
도 6은 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템에 의한 마이크로 형광 비드 결과 영상의 일례를 보여주는 도면.
도 7은 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템 및 종래의 현미경 시스템에 대한 액틴 형광 염색 결과 영상의 일례를 설명하기 위한 도면.
도 8은 도 7에 도시된 액틴 형광 염색 결과 영상들을 비교하기 위한 그래프를 보여주는 도면.
도 9a 및 도 9b는 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템에 의한 마이토콘드리아(mitochondria) 염색 결과 영상의 일례를 보여주는 도면.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 현미경 시스템은 지속파 레이저(continuous wave laser) 및 산란기(diffuser)를 구비하여, 상기 산란기에서 생성되는 산란 모늬를 형광 물질의 여기빛(excitation light)로 입사하고, 상기 산란 무늬가 시간에 따라 무작위로 변화도록 하고, 산란기의 광학적 또는 전기적 특징을 변화시켜 순차적으로 입사시킨다. 그리고, 상기 초고해상도 현미경 시스템은 상기 입사된 형광 무늬로부터 형광 신호들을 반복적으로 획득한다. 상기 형광 신호들은 이색 거울(dichroic mirror) 및 형광 필터(emission filter)를 거친 뒤 카메라에서 영상으로 측정한다.
이를 위하여, 초고해상도 현미경 시스템은 도 1에 도시된 바와 같은 구성들을을 포함한다. 즉, 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 초고해상도 현미경 시스템의 구성을 설명하기 위한 도면이다.
도 1을 참조하면, 블록으로 표현된 초고해상도 현미경 시스템의 각 구성을 볼 수 있다.
이를 위하여, 상기 초고해상도 현미경 시스템은 산란 무늬 생성기(110), 입사 광학계(120), 형광 영상 광학계(130) 및 영상 복원 알고리즘(140)을 포함한다.
산란 무늬 생성기(110)는 산란기(diffuser)을 구비한다. 그리고, 산란 무늬 생성기(110)는 지속파 레이저(continuous wave laser)로부터 송출된 레이저의 빛을 상기 산란기에 통과시켜 산란 무늬를 생성한다. 이에 따라, 상기 산란기를 통과한 빛은 인접한 빛에 대하여 공간적으로 상관관계가 적어지도록 만들어질 수 있다. 산란 무늬 생성기(110)는 상기 산란기를 이용하는 방법외에도, 공간적인 상관관계가 적은 산란 무늬를 생성하기 위한 다른 방식을 이용할 수도 있다.
입사 광학계(120)는 산란 무늬 생성기(110)에 의해 생성된 산란 무늬가 시편에 맺어질 수 있도록, 상기 산란기를 통과한 빛을 상기 시편에 입사시킨다. 또한, 입사 광학계(120)는 형광 현미경의 회절한계를 극복하기 위하여, 상기 산란 무늬의 불규칙 패턴의 크기가 회절한계를 가지는 광학렌즈를 배치하거나, 또는 회절 한계가 줄어지도록 전반사 광학계를 배치할 수 있다.
형광 영상 광학계(130)는 입사 광학계(120)에 의해 입사된 산란 무늬를 적어도 하나의 여기 필터 및 형광 필터에 차례로 통과시켜, 상기 산란 무늬의 형광빛을 카메라를 이용하여 촬영한다. 즉, 상기 여기 필터 및 상기 형광 필터에 차례로 통과된 산란 무늬는 상기 여기 필터에 의해 형광 물질이 여기된 후, 상기 형광 필터에 의해 형광 빛이 선택적으로 통과되는 특징을 가질 수 있다.
영상 복원 알고리즘(140)은 형광 영상 광학계(130)를 통해 촬영된 영상을 반복적으로 획득하고, 상기 반복적으로 획득된 영상을 기초로, 시간에 따라 각 화소에서 변화하는 데이터를 감지하여 상기 영상을 고해상도로 복원한다. 이때, 복원된 영상은, 시간에 따라 변화한 데이터들이 더욱 뚜렷하게 보여지는 것으로, 상기 대상 물체의 형광 광원들이 고해상도로 보여질 수 있다. 이 영상 복원 알고리즘(140)은 영상 복원 알고리즘 구동기에 의해 구동될 수 있다.
상기 영상 복원 알고리즘은 상기 산란기에 의해 생성된 빛이 인접한 공간에서 시간적인 상관관계가 적다는 성질을 이용할 수 있다.
특히, 상기 산란기에서 생성된 불규칙패턴(s)를 샘플에 입사할 때 형광 광학계를 이용하여 획득한 영상의 수학적 모델은 아래와 같이 표현될 수 있다.
[수학식 1]
여기서, (x, y)는 카메라의 좌표를 나타내고, t는 영상을 획득한 시간을 나타내고, s는 불규칙 패턴이다. 그리고, 
는 상기 불규칙 패턴이 컨볼루션되는 집광 렌즈 또는 대물 렌즈 점확산함수이고, 
는 형광빛이 컨볼루션되는 대물 렌즈 점확산함수이다.
따라서, 수학식 1에서 생성된 불규칙 패턴(s)는 집광 렌즈 혹은 대물 렌즈 점확산함수와 컨볼루션되어 시편으로 입사되고, 상기 입사에 대응하여 방출되는 형광빛은 대물 렌즈 점확산함수와 컨볼루션된다.
상기 수학식 1을 해석적으로 표현하고, 점확산함수들을 단일 점확산함수(PSF) 형태로 표현하면, 아래의 수학식 2와 같이 나타낼 수 있다.
[수학식 2]
또한, 수학식 2를 행렬식으로 나타내고, 수학식 2에서 컨볼루션되는 점확산함수를 콘볼루션 행렬(A)로 나타내면, 아래의 수학식 3과 같이 나타낼 수 있다.
[수학식 3]
그리고, 상기 배열 신호 처리 기법은 일정 시간에서 형광 광원들의 변화를 측정한 데이터(
)를 이용하여 공분산행렬(R)을 계산하면, 아래의 수학식 4와 같이 나타낼 수 있다.
[수학식 4]
여기서, T는 총 영상획득 시간을 나타내고, 
는 일정 시간에서 형광 광원들의 변화를 측정한 데이터를 나타내고, R은 공분산행렬을 나타내고, 
는 잡음 공분산 행렬을 나타내고, A는 광원들의 점확산함수를 나타내고, P는 광원들의 상관관계를 나타낸다.
따라서, 상기 배열 신호 처리 기법은 공분산행렬(R)을 광원들의 상관관계(P) 및 점확산함수(A)로 표현하고, 광원들과 관계가 없는 백색잡음(w)을 잡음 공분산 행렬(
)로 나타내며 광원들과 직접적인 상관관계가 없는 것으로 간주하여 고려하지 않을 수 있다.
또한, 산란광의 전자기장관의 간의 상관관계는 아래의 수학식 5와 같이 나타낼 수 있다.
[수학식 5]
여기서, 
는 산란기 표면의 높이 변화에 따른 위상 변화를 나타내고, x는 입사되는 불규칙 패턴을 나타낸다. 그리고, 
는 두 지점간의 거리에 대한 함수로서 두 지점의 거리가 가까워질수록 1로 수렴하는 특성을 가질 수 있다.
따라서, 광원들간의 상관관계는 산란기 표면의 높이의 변화(
)가 클수록 함수가 델타함수로 수렴하게 되고, 광원간의 상관관계 행렬(P)는 대각행렬화가 될 수 있다. 이와 같이, 광원들간의 상관관계 행렬(P)이 대각 행렬로 표현되면, 형광광원들을 복원하는 추정기의 성능은 단일 형광 물질을 복원하는 추정기의 성능과 동일할 수 있다.
나아가, 상기 배열 신호 처리 기법은 측정값의 공분산행렬(R)을 신호와 잡음 부공간으로 분리해서 신호의 위치를 찾아내는 부공간기법(subspace method)의 여러가지 방법이나 그중 MUSIC(Multiple Signal Classification) 방법을 이용하여 형광광원들의 위치를 복원할 수 있다. 또한 다양한 배열신호처리 알고리즘을 이용하여 형광광원의 위치를 복원할 수 있다.
상기 복원을 위한 알고리즘 중의 하나인 MUSIC 방법은 기존 안테나 배열신호처리 기법에서 사용되는 방법으로 아래의 수학식 6을 이용할 수 있다.
[수학식 6]
따라서, 상기 MUSIC 방법은 공분산행렬(R)을 특이값분해(singular value decomposition)하고, 이러한 특이값들의 분포에서 백색잡음 분산(
)의 크기를 고려하여 특이벡터(U)를 신호(
)과 잡음(
) 부공간으로 분리한다. 또한, 상기 MUSIC 기방법은 아래의 수학식 7을 더 이용할 수 있다.
[수학식 7]
여기서, p는 0≤p≤∞이다. 상기 MUSIC 방법은 상기 수학식 7을 기초로, 잡음부공간에 대한 특이벡터(
)과 점확산함수(A)를 이용하여 잡음 부공간의 영 스펙트럼을 계산하고 역수를 취하여 신호의 위치를 복원할 수 있다. 이러한 방법은 상기 촬영된 영상의 신호를 신호부공간과 잡음부공간으로 분해하고, 상기 분해된 잡음부공간을 이용하여 잡음이 최소가 되는 위치에 상기 신호가 존재한다는 원리를 이용하여, 상기 대상 물체의 형광 광원들의 위치를 복원할 수 있다.
도 2는 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템의 동작을 보여주고, 도 3a 및 도 3b는 상기 초고해상도 현미경 시스템에서 빛이 산란기를 투과 또는 통과하는 것을 보여준다. 특히, 도 3a의 산란기(301)는 투과형 산란기이고, 도 3b의 산란기(311)는 반사형 산란기이다.
먼저, 대상 물체의 형광 광원들을 촬영하기 위하여, 지속파 레이저에서 레이저가 송출되면, 산란 무늬 생성기(110)는 200 단계에서, 상기 송출된 레이저의 빛을 산란기에 통과시켜 산란 무늬를 생성한다.
특히, 도 3a를 참조하면, 지속파 레이저에서 출력된 레이저의 결맞은 빛(coherent light)(300)이 투과형 산란기(310)를 통과한다.
따라서, 결맞은 빛(300)은 투과형 산란기(310)를 통과하면서, 산란 무늬를 생성한다. 그리고, 투과형 산란기(310)는 결맞은 빛(300)을 산란시켜 통과시킴으로써, 투과형 산란기(310)을 통과한 결맞은 빛은 기계적, 광학적 특성 혹은 전기적 변화에 따른 비상관관계를 가질 수 있다.
도 3b를 참조하면, 결맞은 빛(310)은 반사형 산란기(311)에 반사된다. 반사형 산란기(311)는 결맞은 빛(310)을 산란시켜 반사함으로써, 반사형 산란기(311)에 반사된 결맞은 빛은 기계적 특성, 광학적 특성 혹은 전기적 특성의 변화에 따른 비상관관계를 가질 수 있다.
결과적으로, 투과형 산란기(310) 또는 반사형 산란기(311)는 결맞은 빛(300, 310)의 산란 무늬들을 지속적으로 생성할 수 있다.
210 단계에서, 입사 광학계(120)는 적어도 하나의 광학 렌즈를 이용하여, 상기 200 단계에서 생성된 산란 무늬를 시편에 맺히도록 입사한다.
220 단계에서, 형광 영상 광학계(130)는 상기 입사된 산란 무늬를 적어도 하나의 여기 필터에 통과시켜 형광 물질을 여기시킨다. 그리고, 형광 영상 광학계(130)는 상기 여기된 결과의 형광 빛을 적어도 하나의 형광 필터에 통과시킨 후, 상기 산란 무늬의 형광빛을 촬영한다.
230 단계에서, 상기 영상 복원 알고리즘(140)는 상기 형광 영상 광학계를 통해 촬영된 영상을 N번 반복적으로 획득한다.
240 단계에서, 상기 영상 복원 알고리즘(140)는 상기 반복적으로 획득된 영상을 기초로, 시간에 따라 각 화소에서 변화하는 데이터를 감지하여 상기 영상을 고해상도로 복원한다. 상기 영상 복원 알고리즘(140)는 앞서 설명된 바와 같이, 배열 신호 처리 기법을 이용하거나, 부공간기법 또는 MUSIC 방법을 이용할 수 있다.
한편, 입사 광학계(120) 및 형광 영상 광학계(130)는 상기 적어도 하나의 광학 렌즈를 반사형 현미경, 투과형 현미경, 전반사 광학 현미경 중 적어도 하나를 위한 구조로서 배치할 수 있다.
도 4는 도 1의 초고해상도 현미경 시스템에서 구현될 수 있는 현미경 구조의 제1 예시를 보여주는 도면이다.
도 4를 참조하면, 상기 제1예시는 형광 영상 광학계(130)가 투과형 현미경(400)인 구조를 보여준다.
상기 투과형 현미경(400)에서, 결맞은 빛(10)은 투과형 산란기(401)를 통과하여 상기 투과형 산란기(401)에 의해 산란 무늬가 생성된다.
따라서, 투과형 현미경(400)은 투과형 산란기(401), 제1 광학 렌즈(402), 제2 광학 렌즈(403), 여기 필터(404), 집광 렌즈(405), 시편(406), 대물 렌즈(407), 형광 필터(408), 어뎁터 렌즈(409) 및 CCD/CMOS 카메라(410)를 포함한다.
특히, 투과형 현미경(400)은 제1 광학 렌즈(402), 제2 광학 렌즈(403) 및 집광 렌즈(405)를 일렬로 정렬시켜, 상기 생성된 산란 무늬를 제1 광학 렌즈(402)의 후방 초점 거리(11)에 위치하도록 하고, 제2 광학 렌즈(403)의 후방 초점 거리(13)를 제1 광학 렌즈(402)의 전방 초점 거리(12)에 일치시키고, 제2 광학 렌즈(403)의 전방 초점 거리(14)를 집광 렌즈(405)의 후방 초점 거리(15)에 일치시킨다.
그리고, 투과형 현미경(400)은 형광물질을 활성화하는 빛 파장을 필터링하는 여기 필터(404)를 제2 광학 렌즈(403) 및 집광 렌즈(405) 사이에 배치한다.
따라서, 상기 산란 무늬는 시편(406)에 최종 입사되며, 여기 필터(404)를 통과하여 형광 물질이 활성화되어 방출된 빛은 대물 렌즈(407)에 의해 상이 확대되고, 형광 필터(408)를 통과한다. 상기 형광 필터(408)를 통과한 빛은 형광빛만 선택적으로 통과한 빛으로서, 어뎁터 렌즈(409)에 의해 CCD/CMOS 카메라(410)에 상을 맺는다.
도 5는 도 1의 초고해상도 현미경 시스템에서 구현될 수 있는 현미경 구조의 제2 예시를 보여주는 도면이다.
도 5를 참조하면, 상기 제2 예시는 형광 영상 광학계(130)가 반사형 현미경(500)인 구조를 보여준다.
반사형 현미경(500)은 투과형 현미경(400)과 마찬가지로, 반사형 현미경(500)은 투과형 산란기(501), 제1 광학 렌즈(502), 제2 광학 렌즈(503), 대물 렌즈(505), 및 시편(3b)을 일렬로 배치하여, 제2 광학 렌즈(503)의 후방 초점 거리(23)를 제1 광학 렌즈(502)의 전방 초점 거리(22)에 일치시키고, 제2 광학 렌즈(503)의 전방 초점 거리(24)를 대물 렌즈(505)의 후방 초점 거리(25)에 일치시킨다.
다만, 반사형 현미경(500)은 제2 광학 렌즈(503) 및 대물 렌즈(505) 사이에, 여기 필터(504) 및 이색 필터(507)을 배치하고, 이색 필터(507)에서 빛이 반사되는 경로에, 형광 필터(508), 어뎁터 렌즈(509) 및 CCD/CMOS 카메라(510)를 배치할 수 있다.
따라서, 결맞은 빛(20)은 투과형 산란기(501)를 통과하여 상기 투과형 산란기(501)에 의해 산란 무늬가 생성된다. 그리고, 상기 생성된 산란 무늬는 제1 광학 렌즈(502), 제2 광학 렌즈(503), 대물 렌즈(505)를 통해 시편(506)에 입사된다. 그리고, 형광물질이 활성화되고 방출된 빛은 다시 대물 렌즈(505)에 의해 집광되고, 이색필터(507)에 의해 반사되고, 형광 필터(508)를 통과한다. 상기 형광 필터(508)를 통과한 빛은 형광빛만 선택적으로 통과한 빛으로서, 어뎁터 렌즈(509)에 의해 CCD 혹은 CMOS 카메라(510)에 상을 맺을 수 있다.
도 6은 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템에 의한 마이크로 형광 비드 결과 영상의 일례를 보여주는 도면이다.
도 6을 참조하면, 상기 마이크로 형광 비드 결과 영상은 2마이크로미터 크기의 형광 구슬을 복원한 영상이다. 특히, 610은 60배 대물 렌즈로 관찰한 영상이고, 620은 상기 610과 동일한 위치를 10배 대물 렌즈로 관찰한 영상이다. 그리고, 630은 상기 620의 영상을 1배로 복원한 결과이고, 640은 상기 620의 영상을 2배로 복원한 결과이고, 650은 상기 620의 영상을 4배로 복원한 결과이다. 결과적으로, 이러한 620 내지 630의 영상들을 통해, 실제 2마이크로미터의 형광 구슬이 복원될 수 있음을 알 수 있다.
도 7은 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템 및 종래의 현미경 시스템에 대한 액틴 형광 염색 결과 영상의 일례를 설명하기 위한 도면이고, 도 8은 도 7에 도시된 액틴 형광 염색 결과 영상들을 비교하기 위한 그래프이다.
도 7을 살펴보면, 상기 액틴 형광 염색 결과 영상은 세포의 액틴(actin)을 염색하여 60배 대물 렌즈를 이용하여 관찰한 영상들이다. 특히, 700은 상기 세포를 기존의 형광 현미경을 이용하여 관찰한 영상이고, 710은 상기 세포를 본 발명의 일 실시에에 따른 초고해상도 현미경 시스템을 이용하여 복원한 영상이다.
상기 700의 점선 A 및 상기 710의 점선 B 부분의 영상 데이터들을 비교해보면, 도 8에 도시된 그래프로 나타낼 수 있다.
도 8을 참조하면, 상기 그래프의 가로축은 실제 샘플의 길이에 해당되고, 세로축은 정규화된 신호 크기에 해당된다. 따라서, 상기 710의 점선 B 부분의 영상 데이터 810은 상기 700의 점선 A의 영상 데이터 800에 비하여, 배경 잡음이 줄고 해상도가 향상되었음을 알 수 있다.
도 9a 및 도 9b는 도 1에 도시된 초고해상도 현미경 시스템에 의한 마이토콘드리아(mitochondria) 염색 결과 영상의 일례를 보여주는 도면이다.
도 9a 및 도 9b를 살펴보면, 상기 마이토콘드리아 염색 결과 영상은 상기 세포의 마이토콘드리아를 염색하여, 60배 대물 렌즈를 이용하여 관찰한 영상들이다. 특히, 900 및 920의 영상은 상기 세포를 종래의 형광 현미경을 이용하여 관찰한 영상이고, 910 및 930의 영상은 상기 세포를 본 발명의 일 실시예에 따른 초고해상도 현미경 시스템을 이용하여 관찰한 영상이다. 따라서, 상기 세포를 종래의 형광 현미경을 이용하여 관찰한 900 및 920의 경우보다, 본 발명의 일 실시예에 따른 초고해상도 현미경 시스템을 이용하여 관찰한 910 및 930의 경우가 보다 뚜렷한 영상을 보여주어 해상도가 향상되었음을 알 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 방법들은 다양한 컴퓨터 수단을 통하여 수행될 수 있는 프로그램 명령 형태로 구현되어 컴퓨터 판독 가능 매체에 기록될 수 있다. 상기 컴퓨터 판독 가능 매체는 프로그램 명령, 데이터 파일, 데이터 구조 등을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 상기 매체에 기록되는 프로그램 명령은 본 발명을 위하여 특별히 설계되고 구성된 것들이거나 컴퓨터 소프트웨어 당업자에게 공지되어 사용 가능한 것일 수도 있다.
이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
Claims (25)
- 대상 물체의 형광 광원들을 촬영하기 위하여 송출된 레이저의 빛을 산란기에 통과시켜 산란 무늬를 생성하는 산란 무늬 생성기;
적어도 하나의 광학 렌즈를 배치하여, 상기 생성된 산란 무늬를 시편에 맺히도록 입사하는 입사 광학계; 및
상기 입사된 산란 무늬를 적어도 하나의 여기 필터 및 형광 필터에 차례로 통과시켜, 상기 산란 무늬의 형광빛을 촬영하는 형광 영상 광학계
를 포함하는 초고해상도 현미경 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 산란 무늬 생성기는
반사형 또는 투과형 산란기를 이용하여 불규칙 패턴을 가지는 산란 무늬를 생성하는
초고해상도 현미경 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 산란기를 통과한 빛은
인접한 빛에 대하여 공간적으로 상관관계가 적어지도록 만들어진
초고해상도 현미경 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 입사 광학계는
상기 생성된 산란 무늬를 시편에 맺히도록 입사하되, 상기 산란 무늬의 불규칙 패턴의 크기가 회절한계를 가지는 광학렌즈를 배치하거나, 또는 회절 한계가 줄어지도록 전반사 광학계를 배치하는
초고해상도 현미경 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 여기 필터 및 상기 형광 필터에 차례로 통과된 산란 무늬는
상기 여기 필터에 의해 형광 물질이 여기된 후, 상기 형광 필터에 의해 형광 빛이 선택적으로 통과되는 특징을 가지는
초고해상도 현미경 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 입사 광학계 또는 상기 형광 영상 광학계는
반사형 현미경, 투과형 현미경, 전반사 광학 현미경 중 적어도 하나를 위한 구조로 배치된
초고해상도 현미경 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 형광 영상 광학계를 통해 촬영된 영상을 반복적으로 획득하고, 상기 반복적으로 획득된 영상을 기초로, 시간에 따라 각 화소에서 변화하는 데이터를 감지하여 상기 영상을 고해상도로 복원하는 영상 복원 알고리즘
을 더 포함하는 초고해상도 현미경 시스템. - 제7항에 있어서,
상기 영상 복원 알고리즘은
배열 신호 처리 기법을 통해, 상기 촬영된 영상에 대한 불규칙 패턴을 생성하고, 상기 생성된 불규칙 패턴을 이용하여 공분산행렬의 광원들의 상관관계 및 점확산함수를 산출하고, 상기 산출 결과를 기초로 상기 대상 물체의 형광 광원들에 대한 영상을 고해상도로 복원하는
초고해상도 현미경 시스템. - 제7항에 있어서,
상기 영상 복원 알고리즘은
아래의 수학식을 이용하여, 공분산 행렬을 계산하는
(여기서, T는 총 영상획득 시간을 나타내고,는 일정 시간에서 형광 광원들의 변화를 측정한 데이터를 나타내고, R은 공분산행렬을 나타내고,
는 잡음 공분산 행렬을 나타내고, A는 광원들의 점확산함수를 나타내고, P는 광원들의 상관관계를 나타냄)
초고해상도 현미경 시스템. - 제7항에 있어서,
상기 영상 복원 알고리즘은
산란광이 인접한 공간에서 시간적인 상관관계가 적은 성질을 이용하는
초고해상도 형광현미경 시스템, - 제7항에 있어서,
상기 영상 복원 알고리즘은
상기 촬영된 영상의 신호를 신호부공간과 잡음부공간으로 분해하고, 상기 분해된 잡음부공간을 이용하여 잡음이 최소가 되는 위치에 상기 신호가 존재한다는 원리를 이용하여, 상기 대상 물체의 형광 광원들의 위치를 복원하는
초고해상도 현미경 시스템. - 제7항에 있어서,
상기 영상 복원 알고리즘은
부공간기법, 배열신호처리 기법 또는 MUSIC 방법을 이용하여, 상기 대상 물체의 형광 광원들의 위치를 복원하는
초고해상도 현미경 시스템. - 대상 물체의 형광 광원들을 촬영하기 위한 레이저를 송출하는 단계;
상기 송출된 레이저의 빛을 산란기에 통과시켜 산란 무늬를 생성하는 단계;
적어도 하나의 광학 렌즈를 이용하여, 상기 생성된 산란 무늬를 시편에 맺히도록 입사하는 단계; 및
상기 입사된 산란 무늬를 적어도 하나의 여기 필터 및 형광 필터에 차례로 통과시켜, 상기 산란 무늬의 형광빛을 촬영하는 단계
를 포함하는 초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법. - 제13항에 있어서,
상기 빛을 산란기에 통과시켜 산란 무늬를 생성하는 단계는
반사형 또는 투과형 산란기를 이용하여 불규칙 패턴을 가지는 산란 무늬를 생성하는
초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법. - 제13항에 있어서,
상기 산란기를 통과한 빛은
인접한 공간에서의 시간적인 상관관계가 적어지도록 만들어지는
초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법. - 제13항에 있어서,
상기 적어도 하나의 광학 렌즈는
상기 산란 무늬의 불규칙 패턴의 크기가 회절한계를 가지도록 배치된
초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법. - 제13항에 있어서,
상기 여기 필터 및 상기 형광 필터에 차례로 통과된 산란 무늬는
상기 여기 필터에 의해 형광 물질이 여기된 후, 상기 형광 필터에 의해 형광 빛이 선택적으로 통과되는 특징을 가지는
초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법. - 제13항에 있어서,
상기 형광 영상 광학계를 통해 촬영된 영상을 반복적으로 획득하는 단계; 및
상기 반복적으로 획득된 영상을 기초로, 시간에 따라 각 화소에서 변화하는 데이터를 감지하여 상기 영상을 고해상도로 복원하는 단계
를 더 포함하는 초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법. - 제18항에 있어서,
상기 영상을 고해상도로 복원하는 단계는
배열 신호 처리 기법을 통해, 상기 반복적으로 획득된 영상에 대한 불규칙 패턴을 생성하는 단계;
상기 생성된 불규칙 패턴을 이용하여 공분산행렬의 광원들의 상관관계 및 점확산함수를 산출하는 단계; 및
상기 산출 결과를 기초로 상기 대상 물체의 형광 광원들에 대한 영상을 고해상도로 복원하는 단계
를 포함하는 초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법. - 제18항에 있어서,
상기 영상을 고해상도로 복원하는 과정에서 사용되는 영상 복원 알고리즘은
형광 여기 빛의 통계적인 분포가 공간적인 상관이 적도록 하는
초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법. - 제18항에 있어서,
상기 영상을 고해상도로 복원하는 단계는
상기 촬영된 영상의 신호를 신호부공간과 잡음부공간으로 분해하고, 상기 분해된 잡음부공간을 이용하여 잡음이 최소가 되는 위치에 상기 신호가 존재한다는 원리를 이용하여, 상기 대상 물체의 형광 광원들의 위치를 복원하는
초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법. - 제18항에 있어서,
상기 영상을 고해상도로 복원하는 과정에서 사용되는 영상 복원 알고리즘은
부공간기법, 배열신호처리 기법 또는 MUSIC 방법을 이용하여, 상기 대상 물체의 형광 광원들의 위치를 복원하는
초고해상도 현미경 시스템을 이용한 영상 획득 방법. - 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독 가능 기록 매체.
- 입사 광학계;
형광 영상 광학계;
대상 물체의 형광 광원들을 촬영하기 위하여 송출된 레이저의 빛을 산란기에 통과시켜 산란 무늬를 생성하는 산란 무늬 생성기; 및
영상 복원 알고리즘을 구동하는 영상 복원 알고리즘 구동기
를 포함하고,
상기 입사 광학계 및 상기 형광 영상 광학계는 적어도 하나의 광학 렌즈가 반사형 현미경, 투과형 현미경, 전반사 광학 현미경 중 적어도 하나를 위한 구조로 배치되고,
상기 영상 복원 알고리즘 구동기는
상기 영상 복원 알고리즘을 구동함으로써, 상기 형광 영상 광학계를 통해 촬영된 영상을 반복적으로 획득하고, 상기 반복적으로 획득된 영상을 기초로, 시간에 따라 각 화소에서 변화하는 데이터를 감지하여 상기 영상을 고해상도로 복원하는 초고해상도 현미경 시스템. - 제24항에 있어서,
상기 영상 복원 알고리즘 구동기는
배열 신호 처리 기법을 통해, 상기 촬영된 영상에 대한 불규칙 패턴을 생성하고, 상기 생성된 불규칙 패턴을 이용하여 공분산행렬의 광원들의 상관관계 및 점확산함수를 산출하고, 상기 산출 결과를 기초로 상기 대상 물체의 형광 광원들에 대한 영상을 고해상도로 복원하는
초고해상도 현미경 시스템.
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