IT201800003984A1

IT201800003984A1 - Metodo di microscopia assistita da dispersione a super localizzazione e relativo apparato

Info

Publication number: IT201800003984A1
Application number: IT102018000003984A
Authority: IT
Inventors: Marco Leonetti; Giuseppe Antonacci; Raino Ceccarelli
Original assignee: Crestoptics S P A; Fondazione St Italiano Tecnologia
Priority date: 2018-03-27
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2019-09-27
Also published as: EP3775850B8; JP7233437B2; US20210063721A1; EP3775850A1; CN111886491B; JP2021519448A; EP3775850B1; CN111886491A; WO2019186393A1; US11867893B2

Description

METODO DI MICROSCOPIA ASSISTITA DA DISPERSIONE A SUPER LOCALIZZAZIONE

E RELATIVO APPARATO

La presente invenzione si riferisce ad un metodo per aumentare la risoluzione ottica di un apparato di microscopia a fluorescenza, su campioni opachi o dispersivi, senza aumentare la complessità dell’apparato, in modo semplice, affidabile, versatile ed economico. Tale metodo utilizza la luce diffusa dal campione stesso per aumentare l’apertura numerica effettiva dell’apparato di microscopia superando la risoluzione del sistema ottico di raccolta della luce che viene utilizzato, i.e. l’obiettivo. Tale metodo è basato sulla modulazione in ampiezza e/o fase di un fronte d’onda di un fascio di luce coerente di eccitazione che investe un campione dispersivo per creare interferenza costruttiva di fasci di luce dispersi dal campione, generando quindi un fuoco stretto, e sul controllo della luce dispersa dal campione. In particolare il metodo secondo la presente invenzione massimizza l’intensità di un segnale fluorescente emesso da proteine fluorescenti di un campione di tessuto biologico ed assembla le informazioni totali ottenute dalla fluorescenza generata da una pluralità di fuochi generati in diversi punti del campione dopo ripetute ottimizzazioni in un’immagine la cui risoluzione non è limitata dalle ottiche di illuminazione e di collezione.

La presente invenzione si riferisce altresì ad un apparato di microscopia a fluorescenza a risoluzione ottica aumentata.

Sebbene la presente invenzione sia diretta principalmente all’investigazione di campioni biologici dove le condizioni sperimentali richiedono che le ottiche di collezione dei segnali fluorescenti siano posizionate distanti dai campioni, si deve tenere presente che può essere applicata a segnali fluorescenti prodotti da altri tipi di campioni dispersivi, in diversi ambiti quali ad esempio astronomico ed atmosferico, o d’indagine a distanza per applicazioni civili o di sicurezza, sempre rimanendo nell’ambito di protezione definito dalle rivendicazioni allegate.

Il limite di diffrazione formulato da Abbe e Rayleigh, afferma che la risoluzione massima raggiungibile da una lente è definita dall’apertura numerica NA. Più grandi sono gli angoli solidi dell’ottica di illuminazione e di collezione, maggiore è la risoluzione spaziale raggiungibile da un sistema di formazione delle immagini. Gli articoli di Tang et al. “Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique”, Proceedings of the National Academy of Sciences 109, 8434–8439 (2012) e di Ni N. et al “Adaptive optics via pupil segmentation for high-resolution imaging in biological tissues”, Nature methods 7, 141–147 (2010) insegnano come correggere le aberrazioni con ottiche adattive per ottenere la risoluzione teorica di una lente reale. Tale risoluzione teorica può essere aggirata con tecniche a risoluzione superiore, come insegnato ad esempio negli articoli di Betzig, E. et al. “Imaging intracellular ﬂuorescent proteins at nanometer resolution.” Science 313, 1642–1645 (2006), di Hell, S. W. & Wichmann, N. “Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion ﬂuorescence microscopy.” Optics letters 19, 780–782 (1994), di Schermelleh, L. et al “A guide to superresolution ﬂuorescence microscopy.” The Nournal of cell biology 190, 165–175 (2010), di Leung, B. O. & Chou, K. C. “Review of super-resolution ﬂuorescence microscopy for biology.” Applied spectroscopy 65, 967–980 (2011), di Pawley, N. B. Fundamental Limits in Confocal Microscopy, 20–42 (Springer US, Boston, MA, 2006), di Betzig, E. & Trautman, N. K. “Near-ﬁeld optics: microscopy, spectroscopy, and surface modiﬁcation beyond the diffraction limit.” Science 257, 189–196 (1992), e di Gustafsson, M. G. “Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.” Journal of microscopy 198, 82–87 (2000).

Le soluzioni proposte soffrono di alcuni svantaggi. Anzitutto la risoluzione massima che può essere raggiunta attraverso apparati di microscopia ottica convenzionale richiede un obiettivo posto in prossimità del campione, che può costituire una limitazione severa nelle misure non invasive e in vivo. Inoltre, un’elevata apertura numerica NA è ancora un elemento essenziale nella maggior parte delle attuali microscopie che cercano di aggirare il limite di diffrazione, quali ad esempio la microscopia confocale, a campo vicino, ad illuminazione strutturata, a deplezione mediante emissione stimolata, di localizzazione fotoattivata. Infine, la dispersione, ad esempio da un tessuto biologico opaco, rappresenta un ostacolo per queste microscopie per perfezionare la messa a fuoco, degradando la forma del fronte d’onda con aberrazioni ottiche e limitando la risoluzione raggiungibile. Ad esempio, la maggior parte dei tessuti dei vertebrati (compresi gli esseri umani) appare otticamente opaca in modo tale che un fascio luminoso coerente che entri in una porzione di pelle è diffuso in molti percorsi ottici non correlati e dopo una certa distanza (cioè il cammino libero medio di trasporto ℓ) la loro direzione di percorrenza è completamente randomizzata.

Scopo della presente invenzione è quello di superare gli svantaggi fin qui descritti, consentendo in modo affidabile, semplice ed economico di aumentare la risoluzione ottica di un apparato di microscopia a fluorescenza, indipendentemente dall’apertura numerica NA dell’ottica del microscopio ed in maniera non invasiva.

Forma oggetto specifico della presente invenzione un metodo di microscopia a fluorescenza comprendente le seguenti fasi:

A. illuminare un campione dispersivo includente uno o più emettitori fluorescenti con un fascio di luce di eccitazione coerente con un fronte d’onda avente una prima configurazione iniziale C<1 >per eccitare detti uno o più emettitori fluorescenti presenti nel campione dispersivo;

B. acquisire una prima immagine iniziale F<1 >corrispondente ad un’immagine di background F<1>=FB del campione dispersivo mediante un’unità di formazione di immagini a pixel ottenendo un’immagine a grani di speckle;

C. selezionare M pixel bersaglio PN, con N = 1,…,M, di coordinate [xN, yN] appartenenti ad un’area della prima immagine iniziale F<1 >contenente segnali di fluorescenza di almeno un emettitore fluorescente, ognuno degli M pixel bersaglio PN avendo una prima intensità iniziale IPN<1>;

D. ottimizzare la prima configurazione iniziale del fronte d’onda per ognuno degli M pixel bersaglio PN per diminuire le dimensioni dei grani di speckle della prima immagine iniziale F<1 >ed ottenere un’immagine finale F<fin>(IPN<max>) del campione dispersivo con un massimo locale IPN<max >di segnale di fluorescenza corrispondente ad un’intensità massima nel pixel bersaglio PN;

E. sottrarre la prima immagine iniziale FB di background ottenuta nella fase B dall’immagine finale F<fin>(IPN<max>) ottenuta nella fase D per ognuno degli M pixel bersaglio PN ottenendo un’immagine Fspeckle(PN) contenente solo segnali di fluorescenza provenienti da un grano di speckle posizionato nel pixel [xN, yN] con intensità IPN<speckle >per ognuno degli M pixel bersaglio PN;

F. eseguire un fit dell’immagine Fspeckle(PN), ottenuta nella fase E, con una funzione Gaussiana con coordinate di centro libere per ognuno degli M pixel bersaglio PN ottenendo coordinate (�N,�N) ed intensità IN in un piano xy;

G. ricostruire un’immagine FN contenente una distribuzione Gaussiana centrata nelle coordinate (�N,�N) e con intensità IN ottenute nella fase F e con una cintura uguale ad una dimensione media S del grano di speckle del campione dispersivo per ognuno degli M pixel bersaglio PN;

H. ricostruire un’immagine finale del campione sommando le M immagini FN ottenute nella fase G per ognuno degli M pixel bersaglio PN.

Secondo un altro aspetto dell’invenzione, la fase D del metodo può comprendere, per ognuno degli M pixel bersaglio PN, le seguenti sotto-fasi:

D.1 – porre la prima configurazione iniziale C<1 >del fronte d’onda come configurazione di riferimento C<1 >= C<ref >del fronte d’onda, la prima immagine iniziale F<1 >come immagine di riferimento F<1 >= F<ref>, , e una prima intensità IPN<1 >nel pixel bersaglio PN della prima immagine iniziale F<1 >come intensità di riferimento IPN<1>= IPN<ref >nel pixel bersaglio PN;

D.2 – ripetere per T volte, con T>1, il seguente ciclo di sottofasi:

D.2.1 - variare la configurazione di riferimento C<ref >del fronte d’onda mediante un’unità di modulazione di ampiezza e/o fase per ottenere una iesima configurazione Cdel fronte d’onda;

D.2.2 - acquisire una i-esima immagine Fcon un’i-esima intensità IPNnel pixel bersaglio PN;

D.2.3 – verificare se il valore dell’i-esima intensità IPNnel pixel bersaglio PN è maggiore dell’intensità di riferimento IPN<ref >per cui:

se IPN> IPN<ref>, la i-esima configurazione Cdel fronte d’onda ottenuta nella fase D.2.1 è accettata come configurazione di riferimento C<ref >del fronte d’onda, i.e. C<ref >= C, e si pone F<ref>= Fe IPN<ref>= IPN, altrimenti

se IPN< IPN<ref >la i-esima configurazione Cdel fronte d’onda ottenuta nella fase D.2.1 non è accettata e si ripristina la configurazione C<ref >della configurazione del fronte d’onda precedente alla variazione eseguita nella fase D.2.1;

D.3 – porre l’immagine di riferimento F<ref >come immagine finale F<ref>=F<fin>(IPN<max>) e l’intensità di riferimento IPN<ref >come massimo locale IPN<max >di segnale di fluorescenza nel pixel bersaglio PN.

Secondo un ulteriore aspetto dell’invenzione, detta unità di modulazione di ampiezza e/o fase può essere un dispositivo (10) digitale a microspecchi contenente una matrice p x q di microspecchi e la fase D.2.1 può essere ottenuta variando l’orientazione di Q ≥ 1 microspecchi del dispositivo (10) digitale a microspecchi, per cui Q ≤ p x q, in cui ogni microspecchio può assumere V > 2 orientazioni, per cui T = V x Q.

Secondo un aspetto aggiuntivo dell’invenzione, la dimensione media S del grano di speckle del campione dispersivo può essere posta uguale �/2n, dove� è una lunghezza d’onda della luce di eccitazione ed n è un indice di rifrazione del campione.

Secondo un altro aspetto dell’invenzione, detta dimensione media S del grano di speckle del campione dispersivo è calcolata da misure di autocorrelazione di intensità di immagini del campione in funzione della distanza Secondo un ulteriore aspetto dell’invenzione, il metodo può comprendere una fase di demagnificazione del fascio (5) di luce di eccitazione coerente prima della fase A.

È un altro oggetto specifico della presente invenzione un apparato di microscopia a fluorescenza comprendente un’unità di modulazione di fronte d’onda, configurata per ricevere e modulare in ampiezza e/o fase un fascio di luce coerente di eccitazione, l’apparato essendo configurato per illuminare un campione con il fascio di luce coerente di eccitazione modulato dall’unità di modulazione di fronte d’onda, in cui l’apparato comprende altresì un’unità di formazione dell’immagine configurata per ricevere ed acquisire un fascio fluorescente emesso dal campione ed un’unità di controllo collegata all’unità di modulazione di fronte d’onda ed all’unità di formazione dell’immagine, in cui l’apparato è configurato per eseguire il metodo di microscopia a fluorescenza illustrato sopra, per cui l’unità di controllo è configurata per controllare secondo la fase D l’unità di modulazione di fronte d’onda in funzione del fascio fluorescente acquisito dall’unità di formazione dell’immagine..

Secondo un altro aspetto dell’invenzione, detta unità di modulazione di fronte d’onda può essere un dispositivo digitale a microspecchi (DMD Digital Micromirror Device).

Secondo un ulteriore aspetto dell’invenzione, detto apparato può comprendere un’unità di demagnificazione del fascio di luce coerente di eccitazione per eseguire il metodo illustrato sopra.

Il metodo secondo la presente invenzione utilizza algoritmi di ottimizzazione per sagomare una configurazione di ampiezza e fase di un fronte d’onda di un fascio di luce coerente di eccitazione, in modo da massimizzare il segnale fluorescente emesso da un emettitore localizzato su una superficie o incorporato in un campione. Nel seguito della presente descrizione, si parlerà indifferentemente di ottimizzazione o sagomatura della configurazione di ampiezza e fase di un fronte d’onda di un fascio di luce, intendendo una o più variazioni di ampiezza e/o fase del fronte d’onda atte a massimizzare un segnale fluorescente emesso da un emettitore. L’aumento del segnale è dovuto ad un aumento dell’intensità di luce di un grano di speckle che si trova in corrispondenza dell’emettitore bersaglio (grano di speckle aumentato). Nella presente descrizione e nelle rivendicazioni allegate, per speckle si intende una figura punteggiata ottenuta quando un’onda di luce coerente è riflessa da un mezzo dispersivo ed un grano di speckle è un massimo di intensità che si trova nel campo di speckle. Una volta che l’ottimizzazione è completata, il segnale del grano dispeckle (ottenuto sottraendo la fluorescenza non ottimizzata all’immagine ottimizzata) è superlocalizzato mediante un fit Gaussiano dei dati. Generando una pluralità di fuochi, i.e di grani di speckle aumentati, in successione nel campo visivo, ed aggregando le informazioni da tutti i contributi, viene ricostruita un’immagine completa del campione.

I vantaggi offerti dal metodo secondo l’invenzione rispetto alle soluzioni della tecnica anteriore sono numerosi e significativi.

Il metodo secondo la presente invenzione si basa sul fatto che la dimensione di un fuoco di un fascio di luce di eccitazione, o fuoco di luce, ottenuto da una sagomatura della configurazione di ampiezza e fase del fronte d’onda vicino o all’interno di un campione dispersivo, non è limitata dall’aperura numerica NA dell’ottica di illuminazione e collezione, ma è definita da una dimensione del grano di speckle aumentato del campione. In altre parole, si ottiene un fuoco di luce la cui dimensione, dopo la sagomatura della configurazione di ampiezza e fase del fronte d’onda, è uguale a quella del grano di speckle. Da qui l’indipendenza della risoluzione spaziale dall’ottica di illuminazione/raccolta dell’apparato di microscopia. La dimensione media S di un grano di speckle è pari a λ/2n come divulgato in Goodman, N. W. et al “Speckle phenomena in optics: theory and applications” (Roberts and Company Publishers, 2007), dove λ è la lunghezza d’onda della luce incidente ed n è l’indice di rifrazione del mezzo. Recentemente, la dimensione S di un grano di speckle alla superficie di un mezzo altamente dispersivo è stata misurata essere inferiore ai 100 nanometri, come mostrato in Park, N.-H. et al. “Subwavelength light focusing using random nanoparticles.” Nature photonics 7, 454–458 (2013) e Van Putten, E. et al. “Scattering lens resolves sub-100 nm structures with visible light.” Physical review letters 106, 193905 (2011).

In altre parole l’apertura numerica NA limitante per il metodo secondo la presente invenzione è quella definita dai vettori d’onda k generati dal campione attraverso la diffusione nel mezzo piuttosto che da quelli definiti dall’ottica di illuminazione e collezione. Questo permette vantaggiosamente di ottenere una risoluzione sub-diffrattiva di un campione dispersivo, anche di sei volte superiore al limite di diffrazione teorico.

Un secondo vantaggioso aspetto del metodo secondo l’invenzione è che, essendo la risoluzione indipendente dalle ottiche dell’apparato di microscopia, il metodo secondo l’invenzione permette di lavorare con ottiche aventi lunghe distanze di lavoro e quindi non direttamente collegate ai campioni investigati. In altre parole, vantaggiosamente il controllo della luce dispersa da un campione può essere un potente strumento per aumentare la risoluzione, specialmente nei casi in cui è richiesta un’alta risoluzione e una lunga distanza di lavoro. Inoltre, per l’esecuzione del metodo è possibile utilizzare apparati sperimentali relativamente semplici combinando le caratteristiche comuni nella maggior parte dei microscopi ottici, come ad esempio fotocamere e filtri di interferenza, con un modulatore di luce spaziale. Questo vantaggiosamente rende il metodo estremamente versatile, perché può essere applicato a qualsiasi sistema di formazione dell’immagine fluorescente.

Infine, poiché il metodo secondo l’invenzione permette di ottenere elevate risoluzioni senza dover utilizzare sorgenti di luce ad alta potenza, un ulteriore vantaggio è quello di poterlo utilizzare per investigare campioni con basse soglie del danno, e può essere facilmente eseguito per investigare in vivo tessuti sensibili quali ad esempio una retina umana.

La presente invenzione verrà ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue preferite forme di realizzazione, con particolare riferimento alle Figure dei disegni allegati, in cui:

la Figura 1 mostra (a) uno schema di una preferita forma di realizzazione di un apparato configurato per eseguire il metodo secondo l’invenzione, (b) una rappresentazione schematica del limite di risoluzione dipendente dalle ottiche di un apparato standard di microscopia, e (c) una rappresentazione schematica del limite di risoluzione dipendente dalla dimensione S di un grano di speckle ottenuto con il metodo secondo la presente invenzione;

la Figura 2 mostra le dimensioni di un fuoco di un fascio di luce coerente di eccitazione che investe una superficie di vetro lucidato (Fig. 2a) ed un mezzo dispersivo noto (Fig.2b) rispettivamente, ottenuti sperimentalmente eseguendo una fase di sagomatura della configurazione di ampiezza e fase del fronte d’onda del fascio di luce di eccitazione di una preferita forma di realizzazione del metodo secondo l’invenzione, i relativi profili di intensità (Fig.2c) ed i relativi valori della cintura del fascio (beam waist) in funzione dell’apertura numerica NA;

la Figura 3 mostra schematicamente alcune fasi della preferita forma di realizzazione del metodo eseguito dall’apparato di Figura 1 per l’ottenimento di immagini ad alta risoluzione di un primo campione dispersivo noto;

la Figura 4 mostra immagini (a), (d) e (g) di un secondo campione dispersivo noto ottenute con un metodo standard di microscopia a fluorescenza al variare dell’apertura numerica NA delle ottiche di collezione e le corrispondenti immagini (b), (e), ed (h) ottenute con la preferita forma di realizzazione del metodo delle Figure 2 e 3, e confronta i differenti profili di intensità (c), (f) ed (i) lungo una stessa linea tratteggiata;

la Figura 5 mostra immagini di un campione biologico ottenute con un metodo standard di microscopia a fluorescenza (Figg.5l e 5m) e con la preferita forma di realizzazione del metodo eseguito dall’apparato di Figura 1 ed illustrato in Figura 3 (Fig.5n);

la Figura 6 mostra i grafici di autocorrelazione in funzione della distanza rispettivamente del campione dispersivo già mostrato nelle immagini di Figura 4 e del campione biologico già mostrato nelle immagini di Figura 5.

Con riferimento alla figura 1a, un apparato 100 configurato per l’esecuzione del metodo secondo l’invenzione comprende una sorgente (non mostrata in figura 1) che emette un fascio 5 di luce di eccitazione coerente con lunghezza d’onda λ tale da eccitare emettitori fluorescenti in un campione 20, ad esempio un fascio di luce laser monocromatico, opzionalmente con lunghezza d’onda di 532 nanometri (nm). L’apparato 100 comprende altresì un’unità di demagnificazione non mostrata in figura per demagnificare il fascio 5, quale ad esempio un telescopio Galileiano comprendente due lenti il cui rapporto delle focali f1/f2 è uguale alla demagnificazione. L’apparato 100 comprende un’unità 10 di modulazione di ampiezza e/o di fase di una configurazione di ampiezza e fase di un fronte d’onda di luce, configurata per ricevere e modulare in ampiezza e/o fase il fascio 5 di luce coerente di eccitazione. Nella preferita forma di realizzazione dell’apparato 100, tale unità 10 di modulazione della configurazione di ampiezza e fase del fronte d’onda è un dispositivo digitale a microspecchi (DMD Digital Micromirror Device). Altre forme di realizzazione della presente invenzione possono includere differenti unità 10 di modulazione della configurazione di ampiezza e fase del fronte d’onda quali ad esempio modulatori spaziali di luce e specchi deformabili. A valle dell’unità 10 di modulazione, seguendo il percorso del fascio 5 di luce dalla sorgente al campione 20, l’apparato 100 comprende una lente 25 ed un obiettivo ottico 30, che può anche essere una lente semplice, per focalizzare il fascio 5 di luce coerente di eccitazione modulato uscente dall’unità 10 di modulazione sul campione 20. L’obiettivo ottico 30, inoltre, raccoglie la luce proveniente dal campione 20, che include una componente emessa di fluorescenza (i.e. un fascio fluorescente emesso dal campione 20) ed una componente riflessa del fascio 5 di luce di eccitazione. L’apertura numerica NA dell’obiettivo ottico 30 è controllata da un diaframma 35. L’apparato 100 comprende altresì un beam splitter 40 che dirige la luce proveniente dal campione verso un’unità 45 di formazione dell’immagine, quale ad esempio una camera CMOS o CCD. Un filtro spettrale 50 rimuove la componente riflessa del fascio 5 di luce di eccitazione dalla luce proveniente dal campione, in modo che solo la componente emessa di fluorescenza arrivi all’unità 45 di formazione dell’immagine dopo avere attraversato un gruppo ottico 55, ad esempio una lente oculare. Nella preferita forma di realizzazione della presente invenzione, il filtro spettrale 50 è un filtro interferenziale. Un’unità 60 di controllo è collegata all’unità 10 di modulazione della configurazione di ampiezza e fase del fronte d’onda ed all’unità 45 di formazione dell’immagine. Tale unità 60 di controllo comanda l’unità 10 di modulazione della configurazione di ampiezza e fase del fronte d’onda in funzione delle immagini formate dall’unità 45 di formazione dell’immagine, cioè mediante un circuito di retroazione, o di feedback, come sarà descritto nel seguito in particolare in relazione alle Figure 2 e 3. Le Figure 1b ed 1c, mostrano uno schema del principio alla base del metodo secondo l’invenzione. Mentre in generale la risoluzione di un microscopio è definita dall’ottica di focalizzazione/collezione (Figura 1b), il segnale di un emettitore fluorescente in un campione dispersivo può essere utilizzato per superare le limitazioni dell’ottica di collezione. In tal caso la risoluzione è limitata dalla dimensione S del grano di speckle sulla superficie del campione (Figura 1c).

Per semplicità di trattazione, nel seguito della presente descrizione e nelle rivendicazioni utilizzeremo il termine “configurazione” di un fronte d’onda intendendo una configurazione di ampiezza e fase del fronte d’onda, in cui l’ampiezza e/o la fase possono essere modulate o meno.

Nel metodo secondo la presente invenzione si investe il campione 20 con un fronte d’onda del fascio 5 di luce di eccitazione avente una prima configurazione iniziale C<1 >non modulata, e si acquisisce una prima immagine iniziale F<1>, o frame di background F<1>=FB, del campione 20 mediante l’unità 45 di formazione dell’immagine. Si seleziona un’area di interesse dell’immagine formata dall’unità 45 in cui sono presenti segnali di fluorescenza, all’interno della quale si scelgono M pixel PN, con N = 1,…,M, le cui coordinate su un piano immagine xy sono [xi, yi].

Successivamente, si esegue una fase di ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda del fascio 5 di luce di eccitazione, per massimizzare il segnale fluorescente proveniente dalla superficie del campione 20 generando un grano di speckle aumentato. Recentemente, algoritmi di ottimizzazione del fronte d’onda sono stati eseguiti per mettere a fuoco la luce su un singolo grano di uno schema speckle disorganizzato, come mostrato ad esempio negli articoli di Vellekoop, I. M., et al. “Exploiting disorder for perfect focusing.” Nature photonics 4, 320–322 (2010), di Vellekoop, I. M. et al. “Focusing coherent light through opaque strongly scattering media.” Optics letters 32, 2309–2311 (2007), e di Di Battista, D., et al. Enhanced adaptive focusing through semitransparent media.” Scientiﬁc reports 5, 17406 (2015). Un fuoco di luce ottenuto con tali algoritmi viene costruito tramite interferenze costruttive da molti percorsi ottici distinti, sagomando la configurazione del fronte d’onda del fascio di luce di eccitazione, cioè agendo sulla fase o ampiezza del fascio di luce di eccitazione, con modulatori spaziali di luce quali dispositivi digitali a micro specchi mediante un circuito di retroazione, come mostrato ad esempio negli articoli di Vellekoop, I. & Mosk, A. “Phase control algorithms for focusing light through turbid media.” Optics communications 281, 3071–3080 (2008) e di Akbulut, D. et al. “Focusing light through random photonic media by binary amplitude modulation.” Optics express 19, 4017–4029 (2011). Nella preferita forma di realizzazione del metodo secondo l’invenzione, l’ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda del fascio di luce di eccitazione prevede una fase preliminare di demagnificazione del fascio 5 in modo da illuminare omogeneamente un’area attiva della superficie dell’unità 10 di modulazione DMD. In altre parole il campione viene illuminato tramite un’immagine demagnificata dell’unità 10 di modulazione DMD illuminato dal fascio 5. Successivamente, si sceglie uno degli M pixel, PN con N = 1…M, come pixel bersaglio e si varia la configurazione del fronte d’onda che investe il campione 20 mediante l’unità 10 di modulazione fino a massimizzare l’intensità di un segnale di fluorescenza associata al pixel come descritto nel seguito in dettaglio.

Si pone la prima immagine iniziale F<1 >come immagine di riferimento F<ref >del pixel bersaglio PN, una prima intensità IPN<1 >nel pixel bersaglio PN della prima immagine iniziale F<1>come intensità di riferimento IPN<ref >nel pixel bersaglio PN e la prima configurazione iniziale C<1 >del fronte d’onda come configurazione di riferimento C<1 >= C<ref>. L’unità 10 di modulazione DMD è organizzata in p x q segmenti o microspecchi, ognuno dei quali può assumere una orientazione tra una pluralità di V=2 orientazioni. In ulteriori forme di realizzazione dell’invenzione ogni microspecchio può assumere più di due configurazioni, i.e. V≥2. Si varia l’orientazione di un microspecchio m del DMD scelto casualmente per cui il fronte d’onda che investe il campione assume una seconda configurazione C<2 >diversa dalla prima C<2 >� C<1 >e si acquisisce una seconda immagine F<2>. Si confronta una seconda intensità IPN<2 >nel pixel bersaglio PN della seconda immagine F<2 >con l’intensità di riferimento IPN<ref >nel pixel bersaglio PN. Se la seconda intensità IPN<2 >è maggiore dell’intensità IPN<ref >di riferimento, la variazione di orientazione del microspecchio m e quindi la seconda configurazione del fronte d’onda è accettata. Quindi si assume come intensità di riferimento l’intensità maggiore tra le due, ossia IPN<ref >= IPN<2>, come configurazione di riferimento del fronte d’onda quella per cui si ha l’intensità maggiore, ossia C<ref >= C<2>, e come immagine di riferimento l’immagine in cui l’intensità nel pixel bersaglio PN è maggiore, ossia F<ref>=F<2>. Se la seconda intensità IPN<2 >è minore dell’intensità IPN<ref>, la variazione non è accettata e viene ripristinata l’orientazione del microspecchio m e quindi la configurazione del fronte d’onda precedenti. In quest’ultimo caso l’intensità di riferimento e la configurazione di riferimento rimangono invariate, assieme all’immagine di riferimento.

Successivamente si varia l’orientazione di un microspecchio n, con n� m, scelto casualmente, per cui il fronte d’onda che investe il campione assume una terza configurazione C<3 >e si acquisisce una terza immagine F<3>. Si confronta una terza intensità IPN<3 >nel pixel bersaglio PN della terza immagine F<3 >con l’intensità di riferimento IPN<ref>. Se la terza intensità IPN<3 >è maggiore dell’intensità IPN<ref >di riferimento, la variazione di orientazione del microspecchio n, e quindi la terza configurazione C<3 >del fronte d’onda, è accettata. Quindi si assume come intensità di riferimento l’intensità maggiore tra le due, ossia IPN<ref >= IPN<3>, come configurazione di riferimento del fronte d’onda quella per cui si ha l’intensità maggiore, ossia C<ref >= C<3>, e come immagine di riferimento l’immagine in cui l’intensità nel pixel bersaglio PN è maggiore, ossia F<ref>=F<3>. Se la terza intensità IPN<3 >è minore dell’intensità IPN<ref >di riferimento la variazione non è accettata e viene ripristinata l’orientazione del microspecchio n e quindi la configurazione del fronte d’onda precedenti. In quest’ultimo caso l’intensità di riferimento e la configurazione di riferimento rimangono invariate.

La procedura sopra descritta è ripetuta per un numero Q di microspecchi dell’unità 10 di modulazione DMD per ogni pixel bersaglio (i.e. per ognuno degli M pixel bersaglio PN) contenuto nell’area di interesse. Nella preferita forma di realizzazione del metodo, Q è maggiore od uguale a 60. Complessivamente, per ogni pixel bersaglio, il campione viene investito da VxQ configurazioni di fronte d’onda del fascio di luce di eccitazione.

La fase di ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda diminuisce la dimensione S di un grano di speckle dell’immagine di un campione dispersivo, ottenendo un grano di speckle a dimensioni ridotte, e la rendono indipendente dall’apertura ottica delle ottiche di focalizzazione.

Gli inventori hanno eseguito un esperimento per osservare la luce coerente scatterata da un campione non dispersivo e quella scatterata da un campione dispersivo. L’esperimento è stato realizzato utilizzando l’apparato di figura 1 senza il filtro spettrale 50 e con il diaframma 35 posto prima del beam splitter 40 per non influenzare la risoluzione dell’ottica di raccolta. In Figura 2 sono riportate le immagini di fuochi di un fascio 5 di luce coerente di eccitazione ottenute al termine della fase di ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda sopra descritta su un campione non dispersivo e su un campione dispersivo. In particolare, per uno stesso valore, pari a 0.03, dell’apertura numerica NA delle ottiche di focalizzazione, determinata dal diaframma 35, la figura 2a mostra un’immagine del fuoco di luce ottenuto su un campione di vetro lucidato (campione non dispersivo), mentre la figura 2b mostra un’immagine del fuoco di luce ottenuto su uno strato di 60�m di spessore di diossido di titanio TiO2 commerciale (Prodotto 224227 da SIGMA ALDRICH) preparato in una sospensione di etanolo e depositato su un vetrino (campione dispersivo). Lo spessore dello strato è stato regolato utilizzando un calibro a spessori. Si può osservare che la dimensione media S di un grano di speckle del campione dispersivo è di circa λ/2n = 150 nm. L’ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda è stata eseguita utilizzando un DMD Vialux discovery 4100 suddiviso in 11 x 11 segmenti quadrati ognuno con dimensione laterale pari a 70 micrometri ( μm). Nell’esperimento il tempo di esposizione per ogni configurazione del fronte d’onda su un pixel target, è variato da 2 a 40 microsecondi ( μs), e la fase di ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda è stata eseguita per 60 microspecchi per ogni pixel bersaglio. Le figure 2a e 2b mostrano che la dimensione di un fuoco di luce, ottenuta dalla fase di ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda, su una superficie liscia è molto maggiore della dimensione ottenuta su una superficie dispersiva. Nella figura 2c vengono riportati i profili di intensità, in unità arbitrarie, del fuoco di luce di figura 2a (punti pieni) e del fuoco di luce di figura 2b (punti vuoti), da cui si misurano, tramite fit gaussiani (linee continue), i valori della cintura misurata, M.W. (Measured Waist), del fascio 5 di luce di eccitazione pari a 5,95 sul campione di vetro lucidato e 1,45 sul campione dispersivo, rispetto ad uno stesso valore teorico della cintura, T. W. (Theroetical Waiste) di 5,7. Inoltre gli inventori hanno eseguito lo stesso esperimento al variare dell’apertura numerica NA dell’apparato, regolando il diametro D del diaframma. La figura 2d mostra la dimensione in micrometri (�m) della cintura del fascio 5 sul campione di vetro lucidato e sul campione dispersivo in funzione del diametro D del diaframma e sono confrontati con i valori teorici attesi (linea continua). E’ evidente che le dimensioni del fuoco di luce sul campione dispersivo è indipendente dall’apertura numerica NA.

Alla fine della fase di ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda, si ottiene un’immagine finale F<fin >(IPN<max>) con un massimo locale di emissione di fluorescenza per il pixel bersaglio PN contenuto nell’area di interesse, dove IPN<max >è proprio l’intensità massima nel pixel bersaglio PN ottenuta alla fine della fase di ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda, grazie alla configurazione del fronte d’onda determinata al termine dell’ottimizzazione.

Successivamente, il metodo prosegue con una fase di sottrazione dell’immagine di background FB, precedentemente ottenuta con il fascio di luce di eccitazione non modulato, opzionalmente demagnificato, dall’immagine finale F<fin >(IPN<max>) ottenuta dalla fase di ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda, in modo da ottenere una immagine Fspeckle(PN) contenente solo luce generata (i.e. contenente esclusivamente segnali di fluorescenza provenienti) da un grano di speckle soggiacente, cioè contenuto nel pixel [xN, yN], con intensità IPN<speckle>. In altre parole si ottiene un’immagine del campione in cui è presente un singolo spot illuminato, corrispondente ad uno speckle ottimizzato, cioè uno speckle con intensità maggiore rispetto alle intensità di speckle circostanti. Il grano di speckle soggiacente appare sull’unità 45 di formazione dell’immagine con una dimensione maggiore della sua reale estensione dovuta alla limitata risoluzione ottica dell’ottica di raccolta che fa una convoluzione (si veda l’immagine di figura 3a).

Quindi, successivamente, il grano di speckle viene superlocalizzato, cioè le coordinate ( XN, YN) in un piano xy e l’intensità IN del fuoco di luce corrispondente finale sono ottimizzate in una fase di localizzazione, mediante un fit con una funzione Gaussiana con coordinate di centro libere. Al termine della fase di localizzazione viene ricostruita una immagine FN contenente una distribuzione Gaussiana di intensità con coordinate di centro (XfN, YfN), intensità IfN e waist uguale alla dimensione media S del grano di speckle a risoluzione ottimizzata nel campione. Quindi, la conoscenza della dimensione S di un grano di speckle di un campione dispersivo è necessaria per ottenere l’immagine finale ad alta risoluzione del metodo secondo l’invenzione. Tale dimensione può essere derivata dalla formula S= λ/n oppure può essere calcolata sperimentalmente, ad esempio dall’autocorrelazione dell’intensità di G immagini acquisite di grani di speckle in funzione della distanza (come verrà descritto più avanti in relazione alla figura 6).

Le fasi di ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda, di sottrazione, e di localizzazione e ricostruzione sono poi ripetute per ognuno degli M pixel bersaglio appartenenti all’area selezionata.

La figura 3 mostra le immagini risultanti dalle fasi del metodo sopradescritto. Le figure (c1) (con una porzione di dettaglio mostrata in (a)), (c2), e (c3) mostrano immagini del campione dispersivo con tre differenti massimi locali, ottenuti con la fase di ottimizzazione della configurazione del fronte d’onda della preferita forma di realizzazione del metodo, per tre differenti pixel bersaglio. Le figure (d1) (con una porzione di dettaglio mostrata in (b)), (d2), e (d3) mostrano immagini ricostruite dalle fasi di sottrazione dell’immagine di background dalle corrispondenti immagini (c1), (c2), e (c3) e di localizzazione mediante un fit gaussiano. Le fasi del metodo fin qui descritte sono figurativamente riassunte nello schema centrale della figura 3, in cui l’asse ortogonale al piano xy rappresenta l’indice N del pixel bersaglio PN. L’immagine finale (f) ad alta risoluzione del campione dispersivo è ottenuta nell’ultima fase del metodo in cui tutte le informazioni ottenute dalle N immagini ricostruite sono riportate in un’unica immagine. Per confronto viene anche riportata l’immagine (e) ottenuta sommando le immagini dei fuochi di luce ottimizzati con differenti configurazioni dell’unità 10 di modulazione, ma non superlocalizzati, nonché i profili di intensità (g) ed (h) delle immagini (e) ed (f) lungo una linea.

Nella preferita forma di realizzazione del metodo vengono eseguite la fase di ottimizzazione, sottrazione e localizzazione in successione per ogni pixel N. In altre forme di realizzazione, possono essere eseguite le fasi di ottimizzazione per ogni pixel N, poi la fase di sottrazione e localizzazione su ogni immagine uscente dalle fasi di ottimizzazione, oppure le fasi di sottrazione su ogni immagine uscente dalle fasi di ottimizzazione e successivamente le fasi di localizzazione per ogni immagine risultante dalle fasi di sottrazione.

Gli inventori della presente invenzione hanno eseguito esperimenti che hanno dimostrato l’affidabilità della preferita forma di realizzazione del metodo descritto in relazione alla figura 3, utilizzando l’apparato di figura 1. In Figura 4 sono riportati i risultati di un primo esperimento su un campione di uno strato di diossido di titanio (utilizzato nell’esperimento precedentemente descritto con riferimento alla figura 2) su cui sono posizionati due grani fluorescenti commerciali (0.5 μm di diametro, Spherotech FP-00556-2). La Figura 4a mostra una prima immagine acquisita con una bassa apertura numerica NA e bassa risoluzione ottica r pari a circa 1,3 μm senza applicare il metodo secondo l’invenzione dei due grani bell’apparato. La Figura 4b mostra la corrispondente immagine ricostruita ottenuta applicando il metodo secondo la presente invenzione con la stessa apertura numerica NA dell’obiettivo. Nell’immagine di figura 4a i due grani fluorescenti appaiono come una singola struttura allungata, mentre nell’immagine ricostruita di figura 4b i due grani fluorescenti appaiono separati e chiaramente distinti. In figura 4c sono riportati i profili di intensità su una stessa linea tratteggiata l lungo i due grani fluorescenti delle immagini 4a e 4b. Dalle figure 4b, 4c si calcola una risoluzione delle immagini ottenute con il metodo secondo l’invenzione pari a circa 150 nm che risulta essere consistente con la dimensione attesa del grano di speckle nel campione dispersivo di diossido di titanio.

Diminuendo l’apertura numerica NA dell’obiettivo e la risoluzione ottica r (chiudendo il diaframma la risoluzione ottica r diventa prima circa 1,7 μm e poi di circa 2,2 μm) i due grani fluorescenti rimangono chiaramente distinguibili eseguendo il metodo secondo l’invenzione come mostrato dalle immagini di figura 4e e 4h e dai relativi profili di intensità sulla linea tratteggiata l riportati nelle figure 4f e 4i. Per confronto, le immagini acquisite con le stesse aperture numeriche senza l’applicazione del metodo sono mostrate nelle figure 4d e 4g ed i relativi profili sulla stessa linea tratteggiata l sono riportati nelle figure 4f e 4i.

Per dimostrare la fattibilità del metodo secondo la presente invenzione su sistemi biologici semi-trasparenti standard, gli inventori hanno eseguito un secondo esperimento su fette di cervello derivate da un topo affetto dalla malattia di Alzheimer (3xTg-AD) per rilevare la presenza di placche di Amyloid Beta, il cui segnale è stato rivelato mediante un anticorpo secondario coniugato con Nile red. I campioni di origine animale sono stati ottenuti in conformità con la direttiva europea 2010/63/UE e con il relativo Decreto legislativo italiano n. 26 del 04.03.2014 di attuazione. Le immagini acquisite ad alta risoluzione (ottenuta con una NA dell’obiettivo di 0,75) e a bassa risoluzione (ottenuta riducendo NA a 0,21), e l’immagine ricostruita con l’esecuzione del metodo a bassa risoluzione (cioè NA pari a 0,21), sono riportate rispettivamente nella Figura 5l, 5m e 5n. Gli inventori hanno calcolato una risoluzione di 200 nm (coerente con la dimensione S del grano di speckle misurata nel campione), corrispondente ad un incremento di sei volte rispetto alla risoluzione teorica data dalle ottiche di collezione. Negli esperimenti i cui risultati sono stati riportati nelle figure 4 e 5, sono stati utilizzati valori calcolati della dimensione S di un grano di speckle dei campioni dispersivi. Gli inventori hanno collezionato G=100 immagini di grani di speckle per uno strato di TiO2 (identico a quello mostrato nelle immagini di Figura 4) ed una fetta di 250�m di cervello di topo affetto dalla malattia di Alzheimer (identico a quella mostrata nelle immagini di Figura 5). Hanno calcolato le autocorrelazioni delle intensità in funzione della distanza, i cui grafici sono riportati in figura 6a e 6b rispettivamente. Tramite un fit Gaussiano dei massimi centrali delle funzioni di autocorrelazione sono stati ottenuti i valori delle dimensioni S dei grani di speckle rispettivamente uguali a STiO2 = 146 ± 3 nm e Scervello =195 ± 7 nm.

In quel che precede sono state descritte le preferite forme di realizzazione e sono state suggerite delle varianti della presente invenzione, ma è da intendersi che gli esperti del ramo potranno apportare modificazioni e cambiamenti senza con ciò uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni allegate.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Metodo di microscopia a fluorescenza comprendente le seguenti fasi: A. illuminare un campione dispersivo includente uno o più emettitori fluorescenti con un fascio (5) di luce di eccitazione coerente con un fronte d’onda avente una prima configurazione iniziale C<1 >per eccitare detti uno o più emettitori fluorescenti presenti nel campione dispersivo; B. acquisire una prima immagine iniziale F<1 >corrispondente ad un’immagine di background F<1>=FB del campione dispersivo mediante un’unità (45) di formazione di immagini a pixel ottenendo un’immagine a grani di speckle; C. selezionare M pixel bersaglio PN, con N = 1,…,M, di coordinate [xN, yN] appartenenti ad un’area della prima immagine iniziale F<1 >contenente segnali di fluorescenza di almeno un emettitore fluorescente, ognuno degli M pixel bersaglio PN avendo una prima intensità iniziale IPN<1>; D. ottimizzare la prima configurazione iniziale del fronte d’onda per ognuno degli M pixel bersaglio PN per diminuire le dimensioni dei grani di speckle della prima immagine iniziale F<1 >ed ottenere un’immagine finale F<fin>(IPN<max>) del campione dispersivo con un massimo locale IPN<max >di segnale di fluorescenza corrispondente ad un’intensità massima nel pixel bersaglio PN; E. sottrarre la prima immagine iniziale FB di background ottenuta nella fase B dall’immagine finale F<fin>(IPN<max>) ottenuta nella fase D per ognuno degli M pixel bersaglio PN ottenendo un’immagine Fspeckle(PN) contenente solo segnali di fluorescenza provenienti da un grano di speckle posizionato nel pixel [xN, yN] con intensità IPN<speckle >per ognuno degli M pixel bersaglio PN; F. eseguire un fit dell’immagine Fspeckle(PN), ottenuta nella fase E, con una funzione Gaussiana con coordinate di centro libere per ognuno degli M pixel bersaglio PN ottenendo coordinate ( XN, YN) ed intensità IN in un piano xy; G. ricostruire un’immagine FN contenente una distribuzione Gaussiana centrata nelle coordinate ( XN, YN) e con intensità IN ottenute nella fase F e con una cintura uguale ad una dimensione media S del grano di speckle del campione dispersivo per ognuno degli M pixel bersaglio PN; H. ricostruire un’immagine finale del campione sommando le M immagini FN ottenute nella fase G per ognuno degli M pixel bersaglio PN.
2. Metodo di microscopia secondo la rivendicazione 1, in cui la fase D comprende, per ognuno degli M pixel bersaglio PN, le seguenti sotto-fasi: D.1 – porre la prima configurazione iniziale C<1 >del fronte d’onda come configurazione di riferimento C<1 >= C<ref >del fronte d’onda, la prima immagine iniziale F<1 >come immagine di riferimento F<1 >= F<ref>, , e una prima intensità IPN<1 >nel pixel bersaglio PN della prima immagine iniziale F<1 >come intensità di riferimento IPN<1>= IPN<ref >nel pixel bersaglio PN; D.2 – ripetere per T volte, con T>1, il seguente ciclo di sottofasi: D.2.1 - variare la configurazione di riferimento C<ref >del fronte d’onda mediante un’unità (10) di modulazione di ampiezza e/o fase per ottenere una i-esima configurazione Cdel fronte d’onda; D.2.2 - acquisire una i-esima immagine Fcon un’i-esima intensità IPNnel pixel bersaglio PN; D.2.3 – verificare se il valore dell’i-esima intensità IPNnel pixel bersaglio PN è maggiore dell’intensità di riferimento IPN<ref >per cui: se IPN> IPN<ref>, la i-esima configurazione Cdel fronte d’onda ottenuta nella fase D.2.1 è accettata come configurazione di riferimento C<ref >del fronte d’onda, i.e. C<ref >= C, e si pone F<ref>= Fe IPN<ref>= IPN, altrimenti se IPN< IPN<ref >la i-esima configurazione Cdel fronte d’onda ottenuta nella fase D.2.1 non è accettata e si ripristina la configurazione C<ref >della configurazione del fronte d’onda precedente alla variazione eseguita nella fase D.2.1; D.3 – porre l’immagine di riferimento F<ref >come immagine finale F<ref>=F<fin>(IPN<max>) e l’intensità di riferimento IPN<ref >come massimo locale IPN<max >di segnale di fluorescenza nel pixel bersaglio PN.
3. Metodo di microscopia secondo la rivendicazione 2, in cui l’unità (10) di modulazione di ampiezza e/o fase è un dispositivo (10) digitale a microspecchi contenente una matrice p x q di microspecchi e la fase D.2.1 è ottenuta variando l’orientazione di Q ≥ 1 microspecchi del dispositivo (10) digitale a microspecchi, per cui Q ≤ p x q, in cui ogni microspecchio può assumere V > 2 orientazioni, per cui T = V x Q.
4. Metodo di microscopia secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui la dimensione media S del grano di speckle del campione dispersivo è posta uguale λ/2n, dove λ è una lunghezza d’onda della luce di eccitazione ed n è un indice di rifrazione del campione.
5. Metodo di microscopia secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni da 1 a 3, in cui la dimensione media S del grano di speckle del campione dispersivo è calcolata da misure di autocorrelazione di intensità di immagini del campione in funzione della distanza.
6. Metodo di microscopia secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, comprendente una fase di demagnificazione del fascio (5) di luce di eccitazione coerente prima della fase A.
7. Apparato (100) di microscopia a fluorescenza comprendente un’unità (10) di modulazione di fronte d’onda, configurata per ricevere e modulare in ampiezza e/o fase un fascio (5) di luce coerente di eccitazione, l’apparato (100) essendo configurato per illuminare un campione (20) con il fascio di luce coerente di eccitazione modulato dall’unità (10) di modulazione di fronte d’onda, in cui l’apparato (100) comprende altresì un’unità (45) di formazione dell’immagine configurata per ricevere ed acquisire un fascio fluorescente emesso dal campione (20) ed un’unità (60) di controllo collegata all’unità (10) di modulazione di fronte d’onda ed all’unità (45) di formazione dell’immagine, in cui l’apparato (100) è configurato per eseguire il metodo di microscopia a fluorescenza secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, per cui l’unità (60) di controllo è configurata per controllare secondo la fase D l’unità (10) di modulazione di fronte d’onda in funzione del fascio fluorescente acquisito dall’unità (45) di formazione dell’immagine.
8. Apparato (100) di microscopia a fluorescenza secondo la rivendicazione 7, in cui l’unità (10) di modulazione di fronte d’onda è un dispositivo digitale a microspecchi (DMD Digital Micromirror Device).
9. Apparato (100) di microscopia a fluorescenza secondo la rivendicazione 7 o 8 configurato per eseguire il metodo secondo la rivendicazione 6 comprendente un’unità di demagnificazione del fascio (5) di luce coerente di eccitazione.