JP7233437B2 - 散乱を利用した超局在顕微鏡法およびその関連装置 - Google Patents
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Description
Betzig, E.らの論文「ナノメートル分解能での細胞内の蛍光蛋白質の画像化」、Science 313, 1642-1645 (2006)、
Hell, S.とWichmann, N.らの「誘導放出による回析分解能の限界の突破:誘導放出-空乏化蛍光顕微鏡法」、Optics letters 19, 780-782 (1994)
Schermelleh, L.らの「超解像蛍光顕微鏡の手引き」、The Journal of cell biology 190, 165-175 (2010)
Leung, B. O.やChou, K. C.の「生物学における超解像蛍光顕微鏡のレビュー」、Applied spectroscopy 65, 967-980 (2011)、
Pawley, N. B.の「共焦点顕微鏡の基本的な限界」、20-42 (Handbook of Biological Confocal Microscopy, Third Edition, edited by James B. Pawley, Springer Science+Business Media, LLC, New York, 2006)、
Betzig, E.やTrautman, N. K.の「近接場光学:回析限界を超える顕微鏡、分光および表面改質」、Science 257, 189-196 (1992)、
Gustafsson, M. G.の「構造化照明顕微鏡法を用いて、横方向の解像限界を倍化させる"、Journal of microscopy 198, 82-87 (2000)。
D.2.1- 振幅/位相変調ユニット(10)を介して波面の参考構成Crefを変化させることで、波面のi番目の構成Cを取得し、
D.2.2- 目標ピクセルPNにおいてi番目の強度IPN iをもつi番目の画像Fiを取得し、
D.2.3- 目標ピクセルPNにおけるi番目の強度IPN iの値が、参考強度IPN refより大きいかどうかをチェックし、それによって、
IPN i>IPN refである場合には、ステップD.2.1で得られた波面のi番目の構成Cは、波面の参考構成Crefとして受け入れられる。すなわち、Cref=Ci、Fref=Fi、およびIPN ref=IPN iが設定される。
IPN i<IPN refである場合には、ステップD.2.1で得られた波面のi番目の構成Cは受け入れられず、ステップD.2.1の実行で変化する前の波面の参考構成Crefが復元される。
これにより、散乱サンプルのより深い回析分解能を有利に実現でき、理論的な回折限界の最大6倍までの分解能にすることができる。
比較のために、本方法を実施せずに同じ開口数で得られた画像を図4dおよび図4gに示し、同じ破線l上の相対プロファイルを図4fおよび図4iに示す。
動物起源のサンプルは、欧州指令2010/63/EUおよび関連するイタリアの法的施行規則n.26 of 04.03.2014に従って入手した。高解像度(0.75 NA対物レンズで取得)および低解像度(NAを0.21に低減し取得)の画像と、低解像度(すなわち、NAは0.21)に本方法を実施して再構成された画像を、図5l、図5m、および図5nにそれぞれ示す。
Claims (9)
- 蛍光顕微鏡法であって、
A. 第1の初期構成C1をもつ波面を有するコヒーレント励起光線(5)を備え、1つ以上の蛍光発光体を含む散乱サンプルを照らすことで、当該散乱サンプルに含まれる1つ以上の蛍光発光体を励起するステップと、
B. 画素撮像ユニット(45)を介して、散乱サンプルの背景画像F1=FBに対応する第1の初期画像F1を取得し、スペックル粒子画像を得るステップと、
C. 少なくとも1つの蛍光発光体の蛍光シグナルをもつ第1の初期画像F1の領域に属するN=1…M個の座標[xN,yN]を有し、それぞれが第1の初期強度IPN 1をもつM個の目標ピクセルPNを選択するステップと、
D. M個の目標ピクセルPNのそれぞれについて波面の第1の初期構成を最適化することで、第1の初期画像F1のスペックル粒子サイズを減少させ、目標ピクセルPNの最大強度に対応する蛍光シグナルの局所最大IPN maxを有する散乱サンプルの最終画像Ffin(IPN max)を取得するステップと、
E. ステップBで取得されたバックグラウンドの第1の初期画像FBを、ステップDで取得された最終画像Ffin(IPN max)から減算することで、M個の目標ピクセルPNのそれぞれについて、強度IPN SPECKLEで画素[xN,yN]に位置する1つのスペックル粒子から来る蛍光シグナルのみを有する画像Fspeckle(PN)をそれぞれ取得するステップと、
F. 自由中心座標をもつガウス関数で、ステップEで得られた画像Fspeckle(PN)をフィッティングすることで、M個の目標ピクセルPNのそれぞれについて、xy平面での座標(XN,YN)と強度INを得るステップと、
G. M個の目標ピクセルPNのそれぞれについて、ステップFで得られた強度INと、散乱サンプルのスペックル粒子の平均サイズSに等しいクビレをもち、座標(XN,YN)を中心とするガウス分布を含む画像FNを生成するステップと、
H. M個の目標ピクセルPNのそれぞれについて、ステップGで得られたM個の画像FNを足し合わせてサンプルの最終画像を生成するステップと、を含む、
ことを特徴とする蛍光顕微鏡法。 - 請求項1に記載の蛍光顕微鏡法であって、
前記ステップDは、M個の目標ピクセルPNのそれぞれについて、以下のサブステップを含み、
D.1- 波面の第1の初期構成C1を波面の参考構成C1=Crefとして設定し、第1の初期画像F1を参考画像F1=Frefとして設定し、第1の初期画像F1の目標ピクセルPNにおける第1強度IPN 1を目標ピクセルPNにおける参考強度IPN 1=IPN refとして設定するステップと、
D.2- 次のサブステップのサイクルをT>1となるようT回繰り返すステップと、
D.2.1- 振幅/位相変調ユニット(10)を介して波面の参考構成Crefを変化させることで、波面のi番目の構成Cを取得し、
D.2.2- 目標ピクセルPNにおいてi番目の強度IPN iをもつi番目の画像Fiを取得し、
D.2.3- 目標ピクセルPNにおけるi番目の強度IPN iの値が、参考強度IPN refより大きいかどうかをチェックし、それによって、
IPN i>IPN refである場合には、前記ステップD.2.1で得られた波面のi番目の構成Cは、波面の参考構成Crefとして受け入れられ、すなわち、Cref=Ci、Fref=Fi、およびIPN ref=IPN iが設定され、
IPN i<IPN refである場合には、前記ステップD.2.1で得られた波面のi番目の構成Cは受け入れられず、前記ステップD.2.1の実行で変化する前の波面の参考構成Crefが復元され、
D.3- 参考画像Frefを最終画像Fref=Ffin(IPN max)として設定し、参考強度IPN refを目標ピクセルP N での蛍光シグナルの局所最大IPN maxとして設定するステップと、を含む、
ことを特徴とする蛍光顕微鏡法。 - 請求項2に記載の蛍光顕微鏡法であって、
前記振幅/位相変調ユニット(10)は、マイクロミラーのp×q行列を備えるデジタルマイクロミラーデバイス(10)であり、
前記ステップD.2.1は前記デジタルマイクロミラーデバイス(10)のQ≧1個のマイクロミラーの向きを変化させることによって実行され、当該実行によってQ≦p×qとなって、各マイクロミラーはV>2の向きをとることができ、T=V×Qとなることを特徴とする蛍光顕微鏡法。 - 請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡法であって、
散乱サンプルのスペックル粒子の平均サイズSは、λ/2nと等しくなるように設定され、λは励起光の波長であり、nはサンプルの屈折率であることを特徴とする蛍光顕微鏡法。 - 請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡法であって、
散乱サンプルのスペックル粒子の平均サイズSは、距離の関数として、サンプル画像の強度の自己相関を測定することによって計算されることを特徴とする蛍光顕微鏡法。 - 請求項1から請求項5のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡法であって、
前記ステップAの前に、前記コヒーレント励起光線(5)を縮小するステップを含むことを特徴とする蛍光顕微鏡法。 - 蛍光顕微鏡装置(100)であって、
励起光線を受け取り、振幅/位相変調するように構成された波面変調ユニット(10)を備え、
前記波面変調ユニット(10)によって変調された励起光線(5)によってサンプル(20)を照らすように構成され、
前記サンプル(20)から発せられた蛍光ビームを受け取って取得する撮像ユニット(45)と、
前記波面変調ユニット(10)及び前記撮像ユニット(45)に接続される制御部(60)とを、さらに備え、
請求項1から請求項6のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡法を実施するように構成され、
前記制御部(60)は、前記撮像ユニット(45)によって取得された蛍光ビームに基づいて、ステップDのように前記波面変調ユニット(10)を制御するように構成される、
ことを特徴とする蛍光顕微鏡装置。 - 請求項7に記載の蛍光顕微鏡装置(100)であって、
前記波面変調ユニット(10)は、デジタルマイクロミラーデバイス(DMD)であることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。 - 請求項7または請求項8に記載の蛍光顕微鏡装置(100)であって、
コヒーレント励起光線(5)縮小ユニットを備え、請求項6に記載の蛍光顕微鏡法を実施するように構成されることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
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