JP6444869B2 - 誘導放出抑制顕微鏡検査 - Google Patents
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Description
(a)励起光路(excitation light path)と抑制光路中の第1の光変調器とを有する誘導放出抑制顕微鏡から蛍光画像を取得することと、
(b)前記蛍光画像の画像輝度(image brightness)の尺度と画像鮮鋭度(image sharpness)の尺度とを組み合わせる測定基準(metric)を計算することと、
(c)前記第1の光変調器上のパターンを調整することと、
前記測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減し且つ/又は前記抑制光路を前記励起光路と位置合わせするために(a)、(b)、及び(c)を繰り返すこととを含み、
前記光変調器は、空間光変調器又は変形可能ミラー(deformable mirror)である、誘導放出抑制顕微鏡検査の方法が提供される。
同期化された抑制ビーム及び励起ビームであって、前記抑制ビームが前記励起ビームよりも長い波長を有する、同期化された抑制ビーム及び励起ビームを形成することと、
前記励起ビームを前記励起光路に沿って対物レンズ(objective)を通して試料上に向けて、蛍光を発生させることと、
前記抑制ビームを抑制光変調器上に向け、前記抑制光変調器からの前記抑制ビームを前記対物レンズを通して前記試料上に向けて、中心から離れた前記蛍光を脱励起(de-excite)するように前記中心で最小値を有する点広がり関数を有する抑制ビームを形成することと、
前記中心からの前記蛍光を取得することと、
前記試料に対する前記中心を複数の位置に移動させて、蛍光画像を構築することと、
画像輝度の尺度及び画像鮮鋭度の尺度を含む前記蛍光画像の測定基準を決定することと、
前記測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減するために前記抑制光変調器上のパターンを調整することと、
を含む誘導放出抑制顕微鏡検査の方法が提供される。
(a)励起光路と抑制光路中の第1の光変調器とを有する誘導放出抑制顕微鏡から蛍光画像を取得することと、
(b)異なる増強効果を有するように前記第1の光変調器上の異なるパターンを使用して(a)を繰り返すことと、
前記蛍光画像を組み合わせることと、
を含む誘導放出抑制顕微鏡検査の方法が提供される。
4 ファラデーアイソレータ
6 半波長板
8 グランレーザ偏光子
10 透過ビーム、抑制ビーム路、抑制路
12 励起ビーム路、励起路
14 ガラスブロック
16 遅延ステージ
18 音響光学変調器
20 偏光保持単一モードファイバ
22 空間光変調器、SLM
26 フォトニック結晶ファイバ
28 音響光学波長可変フィルタ、AOTF
30 偏光保持単一モードファイバ
32 空間光変調器、SLM
40 半波長板
42 半波長板
44 1/4波長板
46 偏光ビーム分割器キューブ
48 ダイクロイックミラー
50 ダイクロイックミラー
52 油浸対物レンズ
54 圧電ステージ
56 試料
60 帯域通過フィルタ
62 多モードファイバ
64 アバランシェフォトダイオード
66 アバランシェフォトダイオード
68 ソフトウェア
70 計器用PC
100 単純なミラー
102 変形可能ミラー
Claims (23)
- 適応光学を使用する誘導放出抑制顕微鏡検査の方法であって、
(a)励起光路と抑制光路中の第1の光変調器とを有する誘導放出抑制顕微鏡から蛍光画像を取得することと、
(b)前記蛍光画像の画像輝度の尺度と画像鮮鋭度の尺度とを組み合わせる測定基準を計算することとを含み、前記画像輝度の尺度は、前記画像鮮鋭度の尺度がより低いときに縮小され、
(c)前記第1の光変調器上のパターンを調整することと、
前記測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減し且つ/又は前記抑制光路を前記励起光路と位置合わせするために(a)、(b)、及び(c)を繰り返すこととをさらに含み、
前記第1の光変調器は、空間光変調器又は変形可能ミラーである、誘導放出抑制顕微鏡検査の方法。 - (a)前記蛍光画像を取得することは、
同期化された抑制ビーム及び励起ビームであって、前記抑制ビームが前記励起ビームよりも長い波長を有する、同期化された抑制ビーム及び励起ビームを形成することと、
前記励起ビームを前記励起光路に沿って対物レンズを通して試料上に向けて、蛍光を発生させることと、
前記抑制ビームを前記抑制光路に沿って抑制光変調器上に向け、前記抑制光変調器からの前記抑制ビームを前記対物レンズを通して前記試料上に向けて、中心から離れた前記蛍光を脱励起するように前記中心で最小値を有する点広がり関数を有する抑制ビームを形成することと、
前記中心からの前記蛍光を取得することと、
前記試料に対する前記中心を複数の位置に移動させて、前記蛍光画像を構築することと、を含む請求項1に記載の誘導放出抑制顕微鏡検査の方法。 - 前記方法は更に、
前記励起ビームを励起光変調器上に向け、前記励起光変調器からの前記励起ビームを前記対物レンズを通して前記試料上に向けて、蛍光を発生させることと、
第2の測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減するために前記励起光変調器上のパターンを適応させることとを含み、
前記第2の測定基準は、画像輝度の尺度Bである、請求項2に記載の方法。 - 前記試料から検出器までの経路は放出光路であり、前記方法は更に、
前記試料からの前記光を前記対物レンズを通して第2の光変調器上に、次いで前記検出器上に向けることと、
更なる測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減するために前記第2の光変調器上のパターンを適応させることとを含み、
前記更なる測定基準は、画像輝度の尺度B、画像鮮鋭度の尺度S、又は両者を組み合わせる測定基準である、請求項2又は3に記載の方法。 - 前記第2の光変調器もまた、前記励起光路中にあり、
更なる測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減するために前記第2の光変調器上の前記パターンを適応させることは、前記励起光路及び前記放出光路の両方での光学収差を低減するために前記第2の光変調器上の前記パターンを適応させることを含む、請求項4に記載の方法。 - 前記第2の光変調器は、前記放出光路及び前記励起光路に加え前記抑制光路中にあり、
更なる測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減するために前記第2の光変調器上の前記パターンを適応させることは、前記抑制光路、前記励起光路、及び前記放出光路の各々での光学収差を低減するために前記第2の光変調器上の前記パターンを適応させることを含む、請求項5に記載の方法。 - 複数の光学収差モードを補正することを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抑制光変調器上の前記パターンは、点広がり関数を有する前記抑制ビームとして非ゼロ次の回折ピークを試料上に向けるように構成されたパターンである、請求項2に記載の方法。
- 前記測定基準Mは、
- 前記測定基準Mは、
- 画像輝度の前記尺度は、画像での画素値の合計として計算される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 画像鮮鋭度の前記尺度は、画像フーリエ変換(FT)の二次モーメントとして定義され、
- (d)蛍光画像を前記誘導放出抑制顕微鏡から取得するステップと、
(e)前記蛍光画像の画像輝度、画像鮮鋭度、又は両方を測定する測定基準を計算するステップと、
(f)前記光変調器上のパターンを調整するステップと、
を繰り返すことにより前記抑制光ビーム路、前記励起光ビーム路、及び前記放出ビーム路の1つ以上の精細な位置合わせを提供するように精細な位置合わせ手順を実行することを更に含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記光変調器は、変形可能ミラーである、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- (a)励起路に沿った励起ビームと、抑制ビームの抑制光路内の空間光変調器と、を有する誘導放出抑制顕微鏡から蛍光画像を取得し、
(b)前記蛍光画像の画像輝度の尺度と画像鮮鋭度の尺度とを組み合わせる測定基準を計算し、
(c)前記空間光変調器上のパターンを調整し、
前記測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減し又は前記抑制ビームと前記励起ビームとを位置合わせするために(a)、(b)、及び(c)を繰り返し、前記測定基準は、画像鮮鋭度の尺度を画像輝度の尺度と組み合わせ、前記画像輝度の尺度は、前記画像鮮鋭度の尺度がより低いときに縮小される、
ように構成されたコンピュータプログラム製品。 - 前記取得される画像を前記誘導放出抑制顕微鏡から取得するように構成され、前記顕微鏡が更に第2の空間光変調器を備え、
前記コンピュータプログラム製品は、前記第1及び前記第2の両方の空間光変調器上のパターンを調整するように構成されている、請求項15に記載のコンピュータプログラム製品。 - 前記測定基準Mは、
- 画像鮮鋭度の前記尺度Sは、画像フーリエ変換(FT)の二次モーメントとして定義され、
- 光源と、
前記光源からの光を抑制光路及び励起光路中に分割する分割器と、
前記励起光路を通過する前記光を対象上に向ける対物レンズと、
前記抑制光路を通って進む光の周波数をより低い周波数にシフトさせる音響光学変調器と、
前記抑制光路を通って進む前記光を前記対物レンズを通して前記試料上に、中心から離れた蛍光を脱励起するように前記中心で最小値を有する点広がり関数と共に向けるように構成された光変調器と、
前記中心からの蛍光光を取得するセンサと、
複数の中心で検知される光から前記試料の蛍光画像を構築し、画像輝度の尺度及び画像鮮鋭度の尺度を含む測定基準を測定し、前記測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減し又は前記抑制光路と前記励起光路とを位置合わせするために前記光変調器上のパターンを適応させ、前記測定基準は、画像鮮鋭度の尺度を画像輝度の尺度と組み合わせ、前記画像輝度の尺度は、前記画像鮮鋭度の尺度がより低いときに縮小される、コントローラと、
を備える誘導放出抑制顕微鏡。 - 前記励起光路中に第2の光変調器を更に備える、請求項19に記載の誘導放出抑制顕微鏡。
- 前記第2の光変調器は、前記抑制光路、前記励起光路、及び放出光路の各々での変形可能ミラーであり、前記放出光路は、前記試料と前記センサとの間の光路である、請求項20に記載の誘導放出抑制顕微鏡。
- 前記第1の光変調器は、非ゼロ次の回折ピークを前記試料上に点広がり関数と共に向ける回折パターンを表示するように構成されている、請求項19、20、又は21に記載の誘導放出抑制顕微鏡。
- 前記測定基準Mは、
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