DE19930532C2 - Anordnung zur Optimierung der Pulsform in einem Laser-Scanning-Mikroskop - Google Patents

Abstract

Vorrichtung zur Einkopplung eines Kurzpulslasers in einen mikroskopischen Strahlengang, wobei die spektralen Komponenten der Laserstrahlung mit Hilfe eines dispersiven Elementes räumlich separiert, die einzelnen spektralen Komponenten manipuliert und anschließend wieder mit Hilfe eines weiteren dispersiven Elementes räumlich überlagert werden.

Description

In der Mikroskopie zur Untersuchung von z. B. biologischen Präparaten werden heutzutage immer häufiger nichtlineare Kontraste, wie die Zwei-Photonen Absorption oder die Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) eingesetzt. Um die zur Anregung von nichtlinearen Effekten nötige Energie bereitzustellen, ist es vorteilhaft Kurzpulslaser einzusetzen. Dabei sollte die Pulsspitzenleistung möglichst groß und damit die Pulslänge am Ort der Probe möglichst klein sein, um eine gleichzeitiger Schädigung der Präparate zu verhindern. Kurzpulslaser liefern beispielsweise Lichtimpulse mit einer Pulslänge von einigen 10 fs bei einer Repetitionsrate von mehreren 10 MHz. Sie haben dadurch den Vorteil äußerst hohe Pulsspitzenenergien bei gleichzeitig geringer mittlerer Leistung zu emittieren. Nachteilig ist, daß sich die kurzen Pulse auf dem Weg durch das Mikroskop zur Probe durch die Gruppengeschwindigkeitsdispersion (GVD) verändern - im Normalfall werden sie länger.

In EP 0916981 A1 wird ein Hadamard Spektrometer beschrieben, bei dem zur Beleuchtung der Probe ein räumlicher Lichtmodulator (LCD, DMD) zur selektiven (sannenden) Anregung eines Objektes vorgesehen ist.

DE 42 21 063 betrifft ein Auflicht-Fluoreszenzmikroskop mit voneinander unabhängig auf die Probe einstellbaren anregenden Strahlbündeln, die dieselbe Region des Objektes beleuchten, um Fluoreszenzlicht unterschiedlicher Wellenlängen unterschiedlicher Farbstoffe quantitativ zu messen.

Zur Kompensation der Pulsverlängerung wurden entsprechende Anordnungen (Prechirp-Einrichtungen) vorgeschlagen (DE 196 22 359 A1).

In DE 197 33 193 A1 sind weiterhin adaptive Optiken vorgesehen.

Die Prechirp-Einrichtungen sind zur Kompensation der Dispersion 2. Ordnung geeignet.

In den z. B. biologischen Präparaten ist jedoch mit nicht vorher bestimmbaren Dispersionen höherer Ordnungen zu rechnen. Weiterhin treten in den optischen Komponenten in einem Mikroskop Dispersionen höherer Ordnung auf. Somit ist es mit den herkömmlichen Techniken nicht möglich, optimale Bedingungen zur Anregung der nichtlinearen Kontraste zu schaffen.

In der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie werden verschiedene Farbstoffe zur spezifischen Markierung von biologischen Präparaten eingesetzt. Diese Farbstoffe werden anschließend mit unterschiedlichen Lichtwellenlängen angeregt. Durch den Einsatz der Multiphotonen-Anregung erfolgt bei solchen Präparaten meist eine simultane Anregung der verschiedenen Farbstoffe. Dies ist einerseits ein Vorteil, da man nur noch eine Lichtwellenlänge zur Anregung benötigt. Andererseits ist es von Nachteil, wenn sich die Emissionswellenlängenbänder der einzelnen Farbstoffe überlagern, da die Farbstoffe dann nicht mehr spektral getrennt werden können.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Pulsfänge am Ort der Probe so zu beeinflussen, daß ein maximales Meßsignal erreicht werden kann.

Anordnung

Ein Blockschaltbild eines bevorzugten Aufbaus ist in Fig. 1 dargestellt. Ausgehend vom Kurzpulslaser KL gelangen die Lichtimpulse in den Pulsformer PF. Dieser ist schematisch in Fig. 2a gezeigt. Im Pulsformer PF wird der einfallende Strahl (beam in) in einem ersten dispersiven Element (1), bestehend z. B. aus einem Gitter oder Prismen in die spektralen Komponenten der Lichtpulse räumlich aufgespalten. Anschließend wird mit Hilfe einer achromatisch korrigierten Linse oder Linsengruppe L1 (Fig. 2) eine Fourierebene erzeugt.

Diese Ebene (Brennebene) zeichnet sich dadurch aus, daß hier die einzelnen Spektralanteile der Lichtpulse räumlich separiert sind. Die Transformation in diese Ebene entspricht mathematisch gesehen einer Fouriertransformation. In diese Ebene wird ein räumlicher Licht-Modulator (2) (spatial light modulator - SLM) in Transmission eingesetzt. Dieser besteht im allgemeinen aus einer Matrix von helixartig oder parallel angeordneten, nematischen Flüssigkeitskristallen (z. B. SLM-S160/h, Firma: Jenoptik LOS). Durch eine entsprechende elektronische Beschaltung der einzelnen Punkte der Matrix kann die Transmission bzw. Phasenverschiebung der entsprechenden spektralen Komponente eingestellt werden. Anschließend wird die räumliche Trennung der spektralen Komponenten der Lichtpulse durch eine zweite identische Linse L2 und ein zweites zu dem ersten identisches dispersives Element (3) aufgehoben (beam out). Dieser Vorgang entspricht der Rücktransformation in den Zeitbereich. Mit Hilfe der Phasen- bzw. Amplitudenmodulation kann somit das zeitliche Verhalten der Lichtimpulse gesteuert werden. Die Anordnung aus 2 Gittern und 2 Linsen ist in der Literatur unter der Bezeichnung 4f - Anordnung bekannt.

Eine vereinfachte Anordnung für den Pulsformer ist in Fig. 2b aufgeführt. Hier ist gleich nach dem Modulator (2) ein Spiegel S angeordnet, so daß die Strahlung in sich zurück mit einem kleinen Höhenversatz oder unter einem kleinem Winkel in sich zurück läuft. Diese Anordnung kommt zum einen mit weniger optischen Komponenten aus, zum anderen durchlaufen die Lichtpulse hier zweimal den Modulator (2), so daß sich die Größe der Phasen-/Amplitudenmodulation verdoppelt.

In Fig. 3 ist die dispersive Aufspaltung und Zusammenführung eines roten Anteils r und eines blauen Anteils b unter Passieren des Manipulators 2 sowie der Wellenlängenverlauf entlang einer Richtung X auf dem Manipulator 2 schematisch dargestellt

Nachdem im Pulsformer das zeitliche Verhalten verändert werden kann gelangen die Lichtpulse über entsprechende optische Komponenten über das Mikroskop M und das Objektiv O in die Probe P. In der Probe P wird aufgrund der starken Fokussierung durch das Objektiv und der hohen Pulsspitzenleistung der Lichtpulse ein nichtlinearer Effekt angeregt. Dieser wird vom Detektor (4) registriert. Somit steht ein entsprechendes Meßsignal zur Verfügung, das durch die elektronische Ansteuerung des Pulsformers mittels der Regelung R optimiert werden kann.

Die Wirkungsweise der Regelung soll nun beispielhaft anhand der Erzeugung eines Zwei-Photonen-Fluoreszenzsignales beschrieben werden.

Das Zwei-Photonen-Fluoreszenzsignal (S) kann wie folgt beschrieben werden:

wobei P_avg die mittlere Leistung und τ die Pulslänge der Lichtpulse am Ort der Probe sind. A steht für den Strahlquerschnitt am Ort der Probenwechselwirkung.

Aus der obigen Gleichung ist ersichtlich, daß das Zweiphotonen-Fluoreszenzsignal mit kleiner werdender Pulslänge und Strahlquerschnitt und größer werdender mittlerer Leistung wächst. In einem Mikroskop wird die Pulslänge durch folgende Faktoren beeinflußt, d. h. meist verlängert:

• - Durch die Glasmaterialien aus denen die optischen Elemente im Mikroskop gefertigt sind. Eine Kompensation kann hier stationär erfolgen.
• - Durch das Präparat an sich. Die Pulsverlängerung ist hier abhängig von der Eindringtiefe in das Präparat. Weiterhin wird die Pulsverbreiterung durch Dispersionen höherer Ordnung erzeugt. Deshalb muß hier die Kompensation für jede spektrale Komponente einzeln und in Echtzeit erfolgen.
• - Durch die Änderung der Wellenlänge
• - Durch die Änderung der mittleren Leistung.

Der Pulsformer PF und damit das zeitliche Verhalten der Lichtpulse wird deshalb in Abhängigkeit von den o. g. Größen durch die Regelung in Echtzeit eingestellt, wobei als Meßgröße das Zweiphotonen-Fluoreszenzsignal fungiert. Durch den Pulsformer wird im wesentlichen die Pulslänge und die mittlere Leistung am Ort der Probenwechselwirkung optimiert.

Weiterhin sind die Wechselwirkungsquerschnitte der verwendeten Farbstoffe abhängig von dem zeitlichen Verhalten der Lichtpulse. Somit ist es möglich das Fluoreszenzsignal für einzelne Farbstoffe zu optimieren, wobei die Fluoreszenz anderer Farbstoffe gleichzeitig unterdrückt wird. Dies ist in der Literatur unter dem Begriff der kohärenten Kontrolle bekannt. Man hat also die Möglichkeit durch die Rückkopplung der Meßgröße (hier das Zweiphotonen-Fluoreszenzsignal) das zeitliche Verhalten der Lichtpulse durch Phasen- oder Amplitudenmodulation so einzustellen, daß die entsprechende Meßgröße optimiert wird.

Vorteilhaft wird die Erfindung in einem Laser-Scanning Mikroskop eingesetzt. Besonders vorteilhafte Ausgestaltungen bestehen darin, daß das Mikroskop zur Untersuchung von nichtlinearen Kontrastverfahren eingesetzt wird. Der Manipulator (2) kann eine Amplitudenmodulation der spektralen Komponenten oder eine Phasenmodulation der spektralen Komponenten erzeugen.

Als Manipulator (2) wird ein räumlicher Lichtmodulator (spatial light modulator - SLM) in der Fourierebene verwendet.

Durch die Rückkopplung mit dem Meßsignal kann die Phasenmodulation im Modulator (2) zur Kompensation der Dispersion höherer Ordnung eingesetzt werden.

Durch die Rückkopplung wird vorteilhaft die Phasenmodulation im Modulator (2) in Abhängigkeit von der Mittenwellenlänge des Kurzpulslasers (6) oder vom verwendeten Objektiv oder von der verwendeten mittleren Leistung optimiert.

Durch die Rückkopplung kann die Phasenmodulation im Modulator (2) in Abhängigkeit von der Eindringtiefe (5) in ein zu untersuchendes Präparat eingestellt und damit ein nichtlinear angeregtes Fluoreszenzsignal optimiert werden.

Mit Hilfe eines adaptiven Elementes AO kann zusätzlich die Pulsfront und die sphärischen Aberrationen optimiert werden

Durch die Rückkopplung kann die Phasenmodulation im Modulator (2) in Abhängigkeit von dem verwendeten Objektiv optimiert werden. Mittels Phasen- und Amplitudenmodulation kann im Modulator (2) ein gezieltes Anregen von Fluoreszenzfarbstoffen oder ein gezieltes Auslösen von Reaktionen (FRET, Uncaging) in Fluoreszenzfarbstoffen oder ein gezieltes Bleichen von Farbstoffen erfolgen.

Claims (6)

1. Anordnung zur Einstellung der Pulsform eines Kurzpulslasers am Ort der Probenwechselwirkung in einem Laserscanmikroskop,
mit einer den Laserpuls des Kurzpulslasers in seine spektralen Bestandteile dispersiv aufspaltenden und diese Bestandteile wieder zusammen führenden, dispersiven Einheit,
dadurch gekennzeichnet,
dass die dispersive Einheit eine Abbildungsoptik aufweist, welche die spektralen Bestandteile des Kurzpulslasers in eine Brennebene innerhalb der dispersiven Einheit abbildet und hier räumlich voneinander trennt
und in der Brennebene ein die voneinander getrennten spektralen Bestandteile des Kurzpulslasers separat beeinflussender Lichtmanipulator angeordnet ist, der diese in ihrer Phase oder Amplitude ändert und hierdurch die Einstellung der Pulsform gewährleistet.

2. Anordnung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass ein Spiegel vorgesehen ist, der mit einem dispersiven Element der dispersiven Einheit zusammenwirkt, wobei das dispersive Element insgesamt zweimal durchlaufen wird.

3. Anordnung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass ein erstes und ein zweites dispersives Element vor und nach der Abbildungsoptik vorgesehen ist.

4. Anordnung nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das dispersive Element als Prisma oder Gitter ausgebildet ist.

5. Anordnung nach einem der Ansprüche 1-4, gekennzeichnet dadurch, dass die Einkopplung in das Laserscan Mikroskop über eine vorzugsweise polarisationserhaltende Monomodefaser erfolgt.

6. Anordnung nach einem der Ansprüche 1-5, gekennzeichnet dadurch, dass über das Meßsignal eine Rückkopplung auf den Licht Manipulator erfolgt, bis das Meßsignal maximal ist.