JP3757854B2 - 複数の蛍光物質を含む試料の分析方法及び装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に存在する複数の蛍光物質を略同時に励起する方法に関する。生体中のタンパク質等の物質の多くは蛍光物質であるため、この方法を用いることにより、生体に含まれる複数のタンパク質等の動き、作用等を同時に且つ独立に追跡することができるようになる。
【０００２】
【従来の技術】
フェムト秒（10-15秒）オーダーの超短光パルスを空間的にも収束して物質に照射すると、その点におけるエネルギ密度は非常に高いものとなり、超短光パルスとその物質との間で線形及び非線形相互作用が生じる。その結果、各種の現象が生じるが、その一つに白色連続スペクトル光の発生がある。この白色連続スペクトル光は、原パルスと同様の超短パルスでありながら白色連続スペクトルを有するため、様々な用途が考えられている。
【０００３】
その一つに、情報変調パルスの生成がある（Jonathan P. Heritage, Andrew M. Weiner, "Shaping Optical Pulses by Amplitude and Phase Masking", U.S. Patent No. 4,655,547, April 7, 1987、Andrew M. Weiner, "Research Projects - Femtosecond Pulse Shaping and Processing", http://purcell.ecn.purdue.edu/~fsoptics/PulseShaping.html）。図１に示すように、超短光パルスから生成される白色連続スペクトル光１１を分光器１２により分光し、各波長毎に異なる透過度又は位相シフタを有するマスク１３を通過させる。その後、レンズ及び分光器１４により再度１つのパルスに統合すると、マスク１３のフーリエ変換のパターンを有するパルス１５が得られる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記方法はマスクに形成された空間情報をパルスの時間情報に変換する方法であり、情報伝送に関する技術として考えられたものである。また、入力（空間情報）と出力（時間情報）とは上記の通りフーリエ変換の関係となっているため、その変換関係が複雑である。
そこで本発明は、超短光パルスから得られる白色連続スペクトル光パルスを、単純な方法で試料（特に生体試料）の分析に利用する方法及び装置を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために成された本発明に係る方法は、
a)超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光器により分光し、
b)分光された各波長中の複数の目的波長光のみを選択し、
c)選択された複数の目的波長光を逆分光器で合成することにより、各目的波長光を含有する合成光パルスを生成し、
d)生成された合成光パルスを試料に照射することにより、上記複数の目的波長光に対応する試料中の複数の目的蛍光物質のみを励起する、
ことを特徴とする。
【０００６】
また、より改良された方法として、上記選択された複数の目的波長光に対して互いに異なる光路長を与えることにより、合成光パルス中において各目的波長光に対応する成分光パルスが互いに時間ズレを有して含有されるようにする方法を挙げることができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
予め、励起したい複数の蛍光物質を定めておき、それら蛍光物質を励起させるための波長を調べておく。本発明では、励起光は超短光パルスより生成されるため、２光子励起や３光子励起等の多光子励起が生じる。従って、励起波長はそれらを考慮した値としておく。
【０００８】
白色連続スペクトル光パルスを分光した後のスペクトルから、これら複数の励起波長（目的波長）のみを選択する。その方法としては、各目的波長の箇所のみにそれぞれ反射鏡を配置する方法、反射鏡の各目的波長箇所以外の箇所に吸収マスクをカバーする方法、各目的波長の箇所のみを透過させるマスクを用いる方法等、種々考えることができる。
【０００９】
こうして選択された目的波長光のみを逆分光器で合成することにより、合成光パルスを生成する。ここにおける逆分光器は、上記スペクトルを生成するための分光器とは別に設けてもよいし、その分光器をそのまま逆分光器として用いてもよい。
【００１０】
こうして生成された合成光パルスには、目的とする蛍光物質に対応する励起光パルスのみが含まれるため、試料中に多種存在する蛍光物質のうち目的とする複数の蛍光物質のみを励起することができる。そして、本発明に係る方法では、生成される合成光パルスが原超短光パルスと同じく超短光パルスであるため、試料中の蛍光物質を２光子励起、３光子励起等の多光子励起モードで励起する。通常の線形の吸収による励起（線形の励起）では光の通る全ての部分で吸収が起こるが、本発明のように多光子励起とすることにより、焦点の部分のみで非線形吸収を起こすことができ、焦点付近のみの情報を得ることができる。この焦点位置を２次元・３次元的に走査すれば、２次元・３次元の分析映像が得られる。また、時間的に追跡することにより、その動き等を観察することもできる。
【００１１】
ただ、上記方法では、逆分光器で生成された合成光パルス内で各成分光が互いに干渉し、非線形効果により差周波数成分光が発生する可能性がある。このような差周波数成分光は、目的とするもの以外の蛍光物質を励起して分析のノイズとなる可能性がある。そこで、本発明の改良された方法では、複数の目的波長光が合成される前に、各目的波長光の光路長を互いに異なるようにしておく。これにより、合成光パルスにおいて各成分光パルスが分離して含まれるようになるため、差周波数成分光の生成が防止され、上記ノイズの発生が抑制される。
【００１２】
上記の「光路長」は光学的なものである。各目的波長光の光路長を異ならせる方法は、一つには、各目的波長の箇所に小反射鏡を配置し、それら小反射鏡の光路方向の位置を互いにずらせる方法がある。また、別の方法として、各目的波長の光路中に厚さ（光路方向の寸法）の異なる透明光学媒体（屈折率の大きい物質が望ましい）をそれぞれ配置する方法をとることもできる。
【００１３】
また、各分光成分に対してチャープ（分散）を与えることにより、合成パルスに含まれる各波長成分のピークパワーを調整することができる。これにより、目的蛍光物質における線形吸収と非線形吸収（多光子吸収）との間の任意のレベルで吸収を制御することが可能となる。
【００１４】
本発明に係る方法を実施するための装置の一例を図２に示す。Erドープ・ファイバレーザ、モードロックTi:サファイアレーザあるいはモードロックCr:フォルステライトレーザ（特開平11-284260）等の光源２１で生成された超短光パルスは、第１光学系２２により水、水晶等の適宜の透明物質２３中の１点に集光される。この集光点において、物質２３と超短光パルスとの非線形相互作用により白色連続スペクトル光パルスが生成される。生成された白色連続スペクトル光パルスは第２光学系２４（レンズ、反射鏡等を含む）により分光器２５に照射され、そこで分光される。分光された光はコリメート光学系２６により波長選択手段２７に送られる。図２において、２７ａは小反射鏡を目的波長箇所に配置した波長選択手段を示し、２７ｂは目的波長以外の箇所に吸光部を設けた反射鏡による波長選択手段を示す。
【００１５】
選択された波長の光はコリメート光学系２６により分光器２５に戻り、そこで１つの超短光パルスに合成される。これを試料２８に照射することにより複数の目的物質のみが励起され、検出器２９によりその蛍光が検出される。
【００１６】
各分光の光路長を異ならせるための装置の例を図３及び図４に示す。図３は各波長箇所に配置した小反射鏡３７の光路方向の位置を異ならせたものであり、図４は波長を選択するためのマスク付反射鏡と、各波長光の光路に配置した異なる厚さの透明光学媒体との組み合わせ４７で構成したものである。
【００１７】
図５は、図３の装置の各小反射鏡（一部の小反射鏡のみでもよい）５７に１次元の曲率を与えた例を示すものである。これにより、当該成分パルスに分散（チャープ）を与え、ピークをシフトすることができる。なお、小反射鏡の背面に加える負圧の大きさを変化させることにより、その曲率を調整するという方法をとることもできる。
【００１８】
【発明の効果】
本発明に係る方法では、白色連続スペクトル光パルスを超短光パルスから生成するため、その光源は理想的な点光源となり、高分解能の光学系を設計することができる。また、光源として非常に明るいため、ノイズの少ない分析を行うことができる。
【００１９】
本発明に係る方法は、特に生体試料等を分析するのに適している。すなわち、生体物質の多くは蛍光性を有するため、本発明に係る方法を使用することにより、複数のタンパク質等の生体物質をほぼ同時に、且つリアルタイムに検出することができる。この方法を２次元・３次元的走査手段と組み合わせることにより、試料の２次元・３次元の分析映像も得ることができる。更に、時間的に追跡することにより、それらの動き等を観察することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ワイナー（Weiner）によるフーリエ変換光学回路図。
【図２】 本発明の一実施態様である複数蛍光物質分析用合成光パルス生成回路の構成図。
【図３】 各成分光を分離した合成光パルスを生成するための一構成例を示す光パルス生成回路の構成図。
【図４】 各成分光を分離した合成光パルスを生成するための他の構成例を示す光パルス生成回路の構成図。
【図５】 各成分光パルスにチャープを与えるための光パルス生成回路の主要部の構成図。
【符号の説明】
１１…白色連続スペクトル光パルス
１２…分光器
１３…マスク
１４…分光器
１５…フーリエ変換パルス
２１…超短光パルス光源
２２…第１光学系
２３…白色連続スペクトル光パルス生成用透明物質
２４…第２光学系
２５…分光器
２６…コリメート光学系
２７ａ、２７ｂ…波長選択手段
３７、４７…波長選択・光路長変更手段
５７…波長選択・光路長変更・チャープ付与手段
２８…試料
２９…蛍光検出器
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に存在する複数の蛍光物質を略同時に励起する方法に関する。生体中のタンパク質等の物質の多くは蛍光物質であるため、この方法を用いることにより、生体に含まれる複数のタンパク質等の動き、作用等を同時に且つ独立に追跡することができるようになる。
【０００２】
【従来の技術】
フェムト秒（10-15秒）オーダーの超短光パルスを空間的にも収束して物質に照射すると、その点におけるエネルギ密度は非常に高いものとなり、超短光パルスとその物質との間で線形及び非線形相互作用が生じる。その結果、各種の現象が生じるが、その一つに白色連続スペクトル光の発生がある。この白色連続スペクトル光は、原パルスと同様の超短パルスでありながら白色連続スペクトルを有するため、様々な用途が考えられている。
【０００３】
その一つに、情報変調パルスの生成がある（Jonathan P. Heritage, Andrew M. Weiner, "Shaping Optical Pulses by Amplitude and Phase Masking", U.S. Patent No. 4,655,547, April 7, 1987、Andrew M. Weiner, "Research Projects - Femtosecond Pulse Shaping and Processing", http://purcell.ecn.purdue.edu/~fsoptics/PulseShaping.html）。図１に示すように、超短光パルスから生成される白色連続スペクトル光１１を分光器１２により分光し、各波長毎に異なる透過度又は位相シフタを有するマスク１３を通過させる。その後、レンズ及び分光器１４により再度１つのパルスに統合すると、マスク１３のフーリエ変換のパターンを有するパルス１５が得られる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記方法はマスクに形成された空間情報をパルスの時間情報に変換する方法であり、情報伝送に関する技術として考えられたものである。また、入力（空間情報）と出力（時間情報）とは上記の通りフーリエ変換の関係となっているため、その変換関係が複雑である。
そこで本発明は、超短光パルスから得られる白色連続スペクトル光パルスを、単純な方法で試料（特に生体試料）の分析に利用する方法及び装置を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために成された本発明に係る方法は、
a)超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光器により分光し、
b)分光された各波長中の複数の目的波長光のみを選択し、
c)選択された複数の目的波長光を逆分光器で合成することにより、各目的波長光を含有する合成光パルスを生成し、
d)生成された合成光パルスを試料に照射することにより、上記複数の目的波長光に対応する試料中の複数の目的蛍光物質のみを励起する、
ことを特徴とする。
【０００６】
また、より改良された方法として、上記選択された複数の目的波長光に対して互いに異なる光路長を与えることにより、合成光パルス中において各目的波長光に対応する成分光パルスが互いに時間ズレを有して含有されるようにする方法を挙げることができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
予め、励起したい複数の蛍光物質を定めておき、それら蛍光物質を励起させるための波長を調べておく。本発明では、励起光は超短光パルスより生成されるため、２光子励起や３光子励起等の多光子励起が生じる。従って、励起波長はそれらを考慮した値としておく。
【０００８】
白色連続スペクトル光パルスを分光した後のスペクトルから、これら複数の励起波長（目的波長）のみを選択する。その方法としては、各目的波長の箇所のみにそれぞれ反射鏡を配置する方法、反射鏡の各目的波長箇所以外の箇所に吸収マスクをカバーする方法、各目的波長の箇所のみを透過させるマスクを用いる方法等、種々考えることができる。
【０００９】
こうして選択された目的波長光のみを逆分光器で合成することにより、合成光パルスを生成する。ここにおける逆分光器は、上記スペクトルを生成するための分光器とは別に設けてもよいし、その分光器をそのまま逆分光器として用いてもよい。
【００１０】
こうして生成された合成光パルスには、目的とする蛍光物質に対応する励起光パルスのみが含まれるため、試料中に多種存在する蛍光物質のうち目的とする複数の蛍光物質のみを励起することができる。そして、本発明に係る方法では、生成される合成光パルスが原超短光パルスと同じく超短光パルスであるため、試料中の蛍光物質を２光子励起、３光子励起等の多光子励起モードで励起する。通常の線形の吸収による励起（線形の励起）では光の通る全ての部分で吸収が起こるが、本発明のように多光子励起とすることにより、焦点の部分のみで非線形吸収を起こすことができ、焦点付近のみの情報を得ることができる。この焦点位置を２次元・３次元的に走査すれば、２次元・３次元の分析映像が得られる。また、時間的に追跡することにより、その動き等を観察することもできる。
【００１１】
ただ、上記方法では、逆分光器で生成された合成光パルス内で各成分光が互いに干渉し、非線形効果により差周波数成分光が発生する可能性がある。このような差周波数成分光は、目的とするもの以外の蛍光物質を励起して分析のノイズとなる可能性がある。そこで、本発明の改良された方法では、複数の目的波長光が合成される前に、各目的波長光の光路長を互いに異なるようにしておく。これにより、合成光パルスにおいて各成分光パルスが分離して含まれるようになるため、差周波数成分光の生成が防止され、上記ノイズの発生が抑制される。
【００１２】
上記の「光路長」は光学的なものである。各目的波長光の光路長を異ならせる方法は、一つには、各目的波長の箇所に小反射鏡を配置し、それら小反射鏡の光路方向の位置を互いにずらせる方法がある。また、別の方法として、各目的波長の光路中に厚さ（光路方向の寸法）の異なる透明光学媒体（屈折率の大きい物質が望ましい）をそれぞれ配置する方法をとることもできる。
【００１３】
また、各分光成分に対してチャープ（分散）を与えることにより、合成パルスに含まれる各波長成分のピークパワーを調整することができる。これにより、目的蛍光物質における線形吸収と非線形吸収（多光子吸収）との間の任意のレベルで吸収を制御することが可能となる。
【００１４】
本発明に係る方法を実施するための装置の一例を図２に示す。Erドープ・ファイバレーザ、モードロックTi:サファイアレーザあるいはモードロックCr:フォルステライトレーザ（特開平11-284260）等の光源２１で生成された超短光パルスは、第１光学系２２により水、水晶等の適宜の透明物質２３中の１点に集光される。この集光点において、物質２３と超短光パルスとの非線形相互作用により白色連続スペクトル光パルスが生成される。生成された白色連続スペクトル光パルスは第２光学系２４（レンズ、反射鏡等を含む）により分光器２５に照射され、そこで分光される。分光された光はコリメート光学系２６により波長選択手段２７に送られる。図２において、２７ａは小反射鏡を目的波長箇所に配置した波長選択手段を示し、２７ｂは目的波長以外の箇所に吸光部を設けた反射鏡による波長選択手段を示す。
【００１５】
選択された波長の光はコリメート光学系２６により分光器２５に戻り、そこで１つの超短光パルスに合成される。これを試料２８に照射することにより複数の目的物質のみが励起され、検出器２９によりその蛍光が検出される。
【００１６】
各分光の光路長を異ならせるための装置の例を図３及び図４に示す。図３は各波長箇所に配置した小反射鏡３７の光路方向の位置を異ならせたものであり、図４は波長を選択するためのマスク付反射鏡と、各波長光の光路に配置した異なる厚さの透明光学媒体との組み合わせ４７で構成したものである。
【００１７】
図５は、図３の装置の各小反射鏡（一部の小反射鏡のみでもよい）５７に１次元の曲率を与えた例を示すものである。これにより、当該成分パルスに分散（チャープ）を与え、ピークをシフトすることができる。なお、小反射鏡の背面に加える負圧の大きさを変化させることにより、その曲率を調整するという方法をとることもできる。
【００１８】
【発明の効果】
本発明に係る方法では、白色連続スペクトル光パルスを超短光パルスから生成するため、その光源は理想的な点光源となり、高分解能の光学系を設計することができる。また、光源として非常に明るいため、ノイズの少ない分析を行うことができる。
【００１９】
本発明に係る方法は、特に生体試料等を分析するのに適している。すなわち、生体物質の多くは蛍光性を有するため、本発明に係る方法を使用することにより、複数のタンパク質等の生体物質をほぼ同時に、且つリアルタイムに検出することができる。この方法を２次元・３次元的走査手段と組み合わせることにより、試料の２次元・３次元の分析映像も得ることができる。更に、時間的に追跡することにより、それらの動き等を観察することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ワイナー（Weiner）によるフーリエ変換光学回路図。
【図２】 本発明の一実施態様である複数蛍光物質分析用合成光パルス生成回路の構成図。
【図３】 各成分光を分離した合成光パルスを生成するための一構成例を示す光パルス生成回路の構成図。
【図４】 各成分光を分離した合成光パルスを生成するための他の構成例を示す光パルス生成回路の構成図。
【図５】 各成分光パルスにチャープを与えるための光パルス生成回路の主要部の構成図。
【符号の説明】
１１…白色連続スペクトル光パルス
１２…分光器
１３…マスク
１４…分光器
１５…フーリエ変換パルス
２１…超短光パルス光源
２２…第１光学系
２３…白色連続スペクトル光パルス生成用透明物質
２４…第２光学系
２５…分光器
２６…コリメート光学系
２７ａ、２７ｂ…波長選択手段
３７、４７…波長選択・光路長変更手段
５７…波長選択・光路長変更・チャープ付与手段
２８…試料
２９…蛍光検出器
Claims (10)
- a)超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光器により分光し、
b)分光された各波長中の複数の目的波長光のみを選択し、
c)選択された複数の目的波長光を逆分光器で合成することにより、各目的波長光を含有する合成光パルスを生成し、
d)生成された合成光パルスを試料に照射することにより、上記複数の目的波長光に対応する試料中の複数の目的蛍光物質のみを励起する、
ことを特徴とし、
更に、上記選択された複数の目的波長光に対して互いに異なる光路長を与えることにより、合成光パルス中において各目的波長光に対応する成分光パルスが互いに時間ズレを有するようにすることを特徴とする複数の蛍光物質を含む試料の分析方法。 - 分光後の上記複数の目的波長光の各分光位置にそれぞれ反射鏡を置き、その反射鏡の光路方向の位置を異ならせることにより各目的波長に対して異なる光路長を与えることを特徴とする請求項１に記載の複数の蛍光物質を含む試料の分析方法。
- 分光後の上記複数の目的波長光の各分光位置にそれぞれ厚さの異なる透明光学媒体を置くことにより各目的波長に対して異なる光路長を与えることを特徴とする請求項１に記載の複数の蛍光物質を含む試料の分析方法。
- 複数の目的波長光の少なくとも１つに対してチャープを与えることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数の蛍光物質を含む試料の分析方法。
- a)超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光器により分光し、
b)分光された各波長中の複数の目的波長光のみを各目的波長以外の箇所を吸収マスクでカバーした反射鏡により選択し、
c)選択された複数の目的波長光を逆分光器で合成することにより、各目的波長光を含有する合成光パルスを生成し、
d)生成された合成光パルスを試料に照射することにより、上記複数の目的波長光に対応する試料中の複数の目的蛍光物質のみを励起する、
ことを特徴とする複数の蛍光物質を含む試料の分析方法。 - a)超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光する分光器と、
b)分光された各波長中の複数の目的波長光のみを選択する波長選択手段と、
c)分光後の複数の目的波長光の各分光位置にそれぞれ配置され、その光路方向の位置が異なるように置かれた複数の反射鏡と、
d)選択された複数の目的波長光を合成して合成光パルスを生成する逆分光器と、
e)生成された合成光パルスを試料に照射するための照射光学系と、
を備えることを特徴とする分析装置。 - 少なくとも１つの反射鏡の形状を非平面とすることにより、対応する目的波長光にチャープを与えることを特徴とする請求項６に記載の分析装置。
- a)超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光する分光器と、
b)分光された各波長中の複数の目的波長光のみを選択する波長選択手段と、
c)分光後の複数の目的波長光の各分光位置にそれぞれ配置された、互いに厚さの異なる透明光学媒体と、
d)選択された複数の目的波長光を合成して合成光パルスを生成する逆分光器と、
e)生成された合成光パルスを試料に照射するための照射光学系と、
を備えることを特徴とする分析装置。 - 少なくとも１つの透明光学媒体の端面形状を非平面とすることにより、対応する目的波長光にチャープを与えることを特徴とする請求項８に記載の分析装置。
- a)超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光する分光器と、
b)各目的波長以外の箇所を吸収マスクでカバーした反射鏡から成り、分光された各波長中の複数の目的波長光のみを選択する波長選択手段と、
c)選択された複数の目的波長光を合成して合成光パルスを生成する逆分光器と、
d)生成された合成光パルスを試料に照射するための照射光学系と、
を備えることを特徴とする分析装置。
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