CN1619293A - 扫描激光显微镜 - Google Patents
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Abstract
一种扫描激光显微镜，包括：a)光源，其用于采用超短光脉冲产生连续光谱白光脉冲；b)色散元件，其将超短光脉冲产生色散为光谱；c)波长选择装置，其只选择出所述色散光中包括的多个目标波长分量；d)反向色散元件，该反向色散元件将所述选择出的多个目标波长分量混合为复合光脉冲；和e)扫描光学系统，其用于将复合光脉冲扫描至样本上。
Description
本申请是2002年12月6日提交的申请号为02154529.4(题目：分析包含多种荧光物质的样本的方法和系统)的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种通过同时激发样本中包括的多种荧光物质对样本进行分析的方法和荧光物质分析器。本发明能够对活体中包括的多种蛋白质等的运动和/或活动进行同时和独立的跟踪，因为活体中包括的许多蛋白质和其他物质天然地具有荧光性，或者可以使用荧光探针使其发出荧光。
背景技术
当飞秒(10-15秒)级的超短光脉冲在空间中会聚并照射在物质上时，照射点的能量密度变得非常高，从而导致光脉冲与物质之间发生线性和非线性的相互作用。这种相互作用产生了许多现象，其中之一就是产生了具有连续光谱的白光脉冲(下面称作“连续光谱白光脉冲”)。连续光谱白光脉冲具有连续光谱，同时是与原始脉冲相似的超短脉冲。由于具有这种特性，连续光谱白光脉冲具有很多用途。
数个可能用途中的一个实施例就是能够产生调制脉冲用于信息传输(美国专利No.4,655,547，Jonathan P.Heritage和Andrew M.Weiner，“Shaping Optical Pulses by Amplitude and Phase Masking”；Andrew M.Weiner，“Research Project- Femtosecond Pulse Shaping and Processing”，http：//purcell.ecn.purdue.edu/～fsoptics/PulseShaping.html)。如图1所示，从超短光脉冲产生的连续光谱白光11由色散元件12进行色散，并且色散光通过具有不同透射率的遮光件13或用于不同波长分量的移相器。随后，透镜和色散元件14将来自遮光件13的光混合为一个脉冲。因此，获得了具有遮光件13的傅里叶变换图形的脉冲15。
上述方法将由遮光件表示的空间信息转换为由脉冲表示的时间信息，其又被用于信息传输的技术。并且，如上所述，因为其是傅里叶变换，输入(空间信息)与输出(时间信息)之间的关系非常复杂。
因此，本发明的目的是提供一种用于分析荧光样本(尤其是生物样本)的方法和系统，其中以较简单的方式使用从超短光脉冲产生的连续光谱白光。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于分析样本的方法，该方法包括：
a)使用色散元件将从超短光脉冲产生的连续光谱白光脉冲色散为光谱的步骤；
b)从色散光中只选择出多个目标波长分量的步骤；
c)使用反向色散元件将所述多个目标波长分量混合为包括目标波长分量的复合光脉冲的步骤；和
d)将复合光脉冲照射在样本上以激发对应于多个目标波长分量的多种目标荧光物质的步骤。
在本发明的改进方法中，所述选择出的多个目标波长分量具有不同光路长度，使复合光脉冲包括其对应于具有时差的目标波长分量的分量光脉冲。
并且，本发明提供了一种荧光物质分析器，包括：
a)色散元件，该色散元件将从超短光脉冲产生的连续光谱白光脉冲色散为光谱；
b)波长选择装置，其用于只选择出色散光中包括的多个目标波长分量；
c)反向色散元件，该反向色散元件将所述选择出的多个目标波长分量混合为复合光脉冲；和
d)照射光学系统，其将复合光脉冲照射在样本上。
在根据本发明的分析中，使用者应当首先确定激发所研究的所述多种荧光物质需要的频率。根据本发明，由于激发光是从超短光脉冲产生，会发生多光子激发(例如两光子或三光子激发)。在选择激发频率时应当考虑到这个事实。
激发光或者连续光谱白光脉冲被色散为光谱，只从中选择出所述多个激发波长分量(或目标波长分量)。选择目标波长分量方法的实施例包括：只在与目标波长分量相对应的位置上放置反射镜；除了反射目标波长分量的部分之外使用覆盖有吸收涂层的反射镜；使用遮光件只允许色散光在对应于目标波长分量的部分通过。
使用反向色散元件将选择出的目标波长分量混合以产生复合光脉冲。除了用于产生光谱的色散元件，还可以再设置反向色散元件，或者色散元件也可以被用作反向色散元件。
这样产生的复合光脉冲只包括能够激发目标物质的波长分量脉冲。因此，对于样本中包括的各种物质，只有期望的荧光物质被复合光脉冲激发。并且，通过本发明，复合光脉冲以多光子激发模式(例如两光子或三光子激发)激发样本中的荧光物质，这是因为它是与原始光脉冲相似的超短光脉冲。在由光子的线性吸收产生的常态激发中，在光通过的所有部分都产生光吸收。在另一方面，在多光子激发中，吸收只在焦点周围非线性地发生，因此能够获得焦点周围有关样本的信息。焦点的两维或三维扫描将提供两维或三维的分析图象。另外，随着时间对图象进行描绘将能够观察到目标物质的运动等。
在上述方法中，由反向色散元件产生的复合光脉冲的分量有可能互相干扰，由于非线性效应产生不同频率的光分量。如此产生的这些不同频率分量可能激发目标荧光物质之外的荧光物质，这会在分析中产生噪声。因此，在本发明的改进方案中，在目标波长分量被混合在一起之前，目标波长分量的光路长度制作得彼此不同。使用这种方法，分量光脉冲被单独地包含在复合光脉冲中，因此可以防止不同频率的分量和上述噪声。
使光路长度中产生差异的一个方法是沿光路在不同位置上在目标波长分量的光路上放置小反射镜。另一个方法是在目标波长分量的光路上放置透明光学介质，每种光学介质都具有不同的厚度(即光路方向上的尺寸)。所述光学介质优选地由具有大折射率的材料制成。
色散光的分量可以是线性调频的，因而复合光脉冲中包括的波长分量的峰值功率可以改变。这种方法能够在目标荧光物质中在线性吸收与非线性(或多光子)吸收之间以任意级别控制光的吸收。
图2显示了用于使用根据本发明的方法进行分析的荧光物质分析器的实施例。在图2中，光源21例如可以是铒掺杂的纤维激光器、锁模钛:蓝宝石激光器或锁模铬:镁橄榄石激光器(参看美国专利No.6,154,310)，其能够产生超短光脉冲。所述超短光脉冲被第一光学系统22会聚在透明物质23(例如水或石英晶体)中的一个点上，透明物质23例如可以形成光纤。在此会聚点，物质23与超短光脉冲之间发生非线性相互作用，产生连续光谱白光脉冲。所述连续光谱白光脉冲进入包括透镜、反射镜等的第二光学系统24。第二光学系统24将脉冲照射至色散元件25上，色散元件25又将脉冲色散为光谱。色散光进入准直仪26，准直仪26将光送入波长选择装置27。图2显示了两种类型的波长选择装置：第一种类型27a包括放置在目标波长分量的光路上的小反射镜，第二种类型27b包括在与除了目标波长之外的波长对应的位置上设置有光吸收部分的反射镜。
随后，准直仪26将选择出的波长分量发送回色散元件25，色散元件25又将波长分量混合为超短光脉冲。超短光脉冲被照射在样本28上，以激发所述多个目标物质。荧光由检测器29检测。
图3和图4显示了用于为色散光分量提供不同光路长度的系统的实施例。图3中的系统包括小反射镜37，小反射镜37沿光路的不同位置放置在目标波长分量的光路上。图4显示了复合系统47，该系统包括屏蔽反射镜，用于选择目标波长分量和透明光学介质，每个都具有不同的厚度，设置在目标波长分量的光路上。如图1至图4所示的这些光学系统还能用于扫描激光显微镜。
图5显示了图3所示系统的改进实施例，其中小反射镜57的全部和部分一维地弯曲。小反射镜57的曲度产生相应脉冲分量的偏转(或线性调频脉冲)和其峰值的移位。该系统还可以包括用于对小反射镜背面施加负压和用于通过改变负压控制曲度的机构。
通过根据本发明的方法，可以从超短光脉冲产生连续光谱白光脉冲。这种方法提供了一种理想的点光源，可以设计出具有高分辨率的光学系统。并且，这种方法还提供了一种能够以很小的噪声进行分析的非常亮的光源。
根据本发明的方法特别适用于对生物样本的分析。即根据本发明的方法能够对多种生物物质(例如蛋白质)进行几乎是同时和实时的检测，这是因为许多生物材料是荧光性的或者可以使用荧光探针进行标记。例如，这种方法与两维或三维显微镜扫描系统的结合将产生两维或三维解析图象，并且随着时间对图象的描绘将能够对目标物质的运动等进行观察。另外，通过用荧光物质标志材料中的蛋白质等，使用根据本发明的方法或荧光物质分析器也能检测到不具有荧光性的目标生物材料。
在根据本发明的荧光物质分析器中，除了如上所述用于任意选择目标波长的机构之外，还希望能设置用于容易地改变目标波长的机构。例如，在开发新荧光物质中，可能需要找到荧光物质的最佳激发波长。最佳激发波长可以通过接连地测试一些可能的激发频率来寻找。但是，如果所述激发波长不容易改变，这个过程将占用很长的时间。当用不同的荧光物质标志的物质混合在样本中时会产生另一个问题。在这种情况下，如果所有荧光物质的激发波长同时照射在样本上，将很难精确地定位每个目标物质。
考虑到上述问题，根据本发明第一模式的荧光物质分析器还包括位于波长选择装置与反向色散元件之间的光闸，其用于使由波长选择装置选出的目标波长分量通过或停止，并且反向色散元件通过将通过光闸的目标波长分量混合产生复合光脉冲。
在根据本发明第二模式的荧光物质分析器中，所述波长选择装置包括一个或多个波长选择元件，它们用于只分别选择出色散光的目标波长分量，和开/关机构，其用于启动或禁止每个波长选择元件；并且反向色散元件通过将由启动的波长选择元件选择的目标波长分量混合产生复合光脉冲。
在根据本发明第三模式的荧光物质分析器中，所述波长选择机构包括多个波长选择元件，它们用于只选择出色散光的目标波长分量，和转换机构，其用于选择性地转换所述多个波长选择元件，并且反向色散元件通过将由转换机构选择的波长选择元件选择的目标波长分量混合产生复合光脉冲。
采用荧光物质分析器第一模式的分析如下进行。在开始分析之前，使用者应当找出应该选择什么频率来激发一个或多个所研究的荧光物质。根据本发明，由于激发光由超短光脉冲产生，因此会发生多光子激发，例如两光子或三光子激发。在选择激发频率时应考虑到这个事实。
激发光或连续光谱白光的脉冲被色散为光谱，波长选择装置从所述光谱中只选出一个或多个激发波长(目标波长)的光。波长选择装置的实例包括反射镜阵列，其包括多个放置在目标波长光路上的反射镜，和反射镜，其在反射目标波长分量的部分之外的部分覆盖有吸收涂层。
对于所选择的所有目标波长分量，只有实际上会照射在样本上的一个或多个目标波长分量被允许通过光闸，而在那时不会照射到样本上的其他目标波长分量被光闸阻止。
光闸的一个实施例是机械光闸，例如具有槽口的转盘光闸，或者照相机中使用的平面光闸。也可以使用液晶光闸。
被允许通过光闸的目标波长分量被发送至反向色散元件，其从光中产生复合光脉冲。反向色散元件可以与用于产生光谱的色散元件分别设置，或者色散元件也可以用作反向色散元件。
如上所述产生的复合光脉冲只包括对应于目标荧光物质的激发光脉冲。因此，对于样本中全部荧光物质，只有目标荧光物质被复合光脉冲所激发。另外，采用荧光物质分析器的第一种模式，通过适当改变每个光闸的通过/停止状态，只有在当时必须的荧光物质被激发。通过使用光闸，可以非常方便和迅速地转换目标波长。因此，很容易找到新荧光物质的最佳激发波长，或者单独检测混合在样本中的多种荧光物质中的每一个，并研究每种荧光物质的分布或特性。
在荧光物质分析器的第二种模式中，波长选择装置包括一个或多个波长选择元件(例如反射镜)，其用于只分别选择色散光的目标波长分量，和开/关机构，其用于启动或禁止每个波长选择元件。当波长选择元件被启动时，与波长选择元件相对应的波长被发送至反向色散元件，其产生包含被选出的波长的复合光脉冲。在另一方面，当波长选择元件被禁止时，与波长选择元件相对应的波长不被发送至反向色散元件，因而复合光脉冲不包含所述波长。因此，使用所述开/关机构，可以控制波长选择装置来任意改变复合光脉冲中包含的波长分量的组合。
在荧光物质分析器的第三种模式中，波长选择装置包括多个波长选择元件，它们用于只选择色散光的目标波长分量，和转换机构，其用于选择性地转换波长选择元件。这种结构可以任意地并方便地对复合光脉冲中包含的波长组合进行改变。
根据本发明第一至第三模式荧光物质分析器可以任意地并方便地对复合光脉冲中包含的波长组合进行改变。这种特性提供了以下优越的效果。
(1)在开发新荧光物质中，通过连续测试可能的激发波长，可以在短时间内找到最佳激发波长。
(2)即使当用荧光物质标志的物质混合在样本中，通过连续选择荧光物质的激发波长就可以精确定位每个荧光物质，从而每种荧光位置能够单独被激发。
(3)当多个激发波长分量照射至样本上时，不同的波长分量互相干扰，产生不同的频率分量。该不同频率分量可以激发除了目标荧光物质之外的荧光物质，这导致在分析中产生噪声。使用根据本发明第一至第三模式中的任何一个的荧光物质分析器都能够解决这个问题，方法如下：选择性地接连激发荧光物质，针对每个激发观察荧光性，并最终组合所有观察结果。通过这种方法，由于干扰而产生的光的不同频率分量得到消除，因此能够以很小的噪声只观察到目标荧光物质。
根据本发明的方法和荧光物质分析器必须进一步解决下述问题。即，荧光物质的激发波长不是单波长，其由某个小范围的激发波长所激发。因此，与目标波长不同的波长的光会导致激发。如上所述，当多个波长分量照射至样本上，选择出的目标波长分量不仅会导致目标荧光物质的两光子或三光子激发，还会导致目标荧光物质之外的荧光物质的线性激发。在这种情况下，当使用检测器检测时，由选择出的目标波长分量之外的光造成的激发产生的荧光性将成为噪声。
因此，需要改善根据本发明的方法或荧光物质分析器，能够以更高的精度和更小的噪声进行分析。
考虑到上述目标，根据本发明第四模式的方法包括以下步骤：
对在步骤b)中选出的所述多个目标波长分量的强度以不同的频率进行调制，并且经过调制的所述多个目标波长分量被发送至步骤c)；
在步骤d)中通过目标荧光物质的激发由样本发射的荧光光线对于每个目标波长被色散并检测；
每个荧光光线的检测信号在与荧光性相对应的目标波长分量的强度受到调制的频率上被同步整流。
另外，根据本发明第五实施方案的荧光物质分析器还包括：
强度调制器，用于以不同的频率对由波长选择装置选出的所述多个目标波长分量的强度进行调制；
荧光色散元件，用于使用照射光学系统通过复合光脉冲的照射对由样本发射的荧光性色散光线进行色散；
检测器，用于对于每个目标波长分量探测由荧光色散元件色散的荧光光线；
同步整流器，用于在与荧光性相对应的目标波长分量的强度调制中使用的频率上对由检测器检测到的每个荧光光线的检测信号进行同步整流。
在使用根据本发明第四模式的方法或根据本发明第五模式的荧光物质分析器的分析中，使用者应当首先找出选择什么频率来激发被研究的所述多种荧光物质。根据本发明，由于激发光从超短光脉冲产生，因此会发生多光子激发(例如两光子或三光子激发)。在选择激发频率时应考虑到这个事实。
超短光脉冲反复地产生，由此产生一系列连续光谱白光脉冲。连续光谱白光脉冲被色散为光谱，由此只选择出所述多个激发波长分量(或目标波长分量)。选择目标波长分量的方法的实施例包括：只在与目标波长相对应的位置上放置反射镜；使用除了反射目标波长分量的部分之外覆盖有吸收涂层的反射镜；使用遮光件只允许色散光在对应于目标波长分量的部分通过。
当超短光脉冲(即连续光谱白光脉冲)反复产生时，在不同的频率对按照上述方法选择的目标波长分量的强度进行调制。强度经过调制的所述多个目标波长分量通过反向色散元件混合为一系列复合光脉冲，其被照射在样本上。
当所述复合光脉冲照射至样本上时，样本中与目标波长分量相对应的荧光物质被激发，并且每个荧光物质产生荧光光线。样本同时发射出包含所述多个目标波长的所有荧光光线。
如上所述，当一系列复合光脉冲被照射在样本上时，样本相应地发射出一系列荧光脉冲。所述荧光脉冲对于每个目标波长受到色散，并且色散光的强度被检测。荧光脉冲的检测信号在对具有与荧光脉冲相对应的波长的激发光的强度调制中使用的频率下受到同步整流。荧光的每个波长分量的强度在与相应于波长分量的激发光的强度调制中使用的频率相同的频率变化。因此，当检测信号在所述频率被同步整流时，目标信号被从检测信号中提取出来，否则噪声被提取出来。这样就分别将信号分量和噪声分量分别从检测信号中提取出来。
因此，通过根据本发明第四模式的方法或根据本发明第五模式的荧光物质分析器，目标激发光受到调制，并且荧光在调制频率被同步整流。通过这样的过程，可以分别获得由目标激发光激发产生的目标荧光(信号的目标分量)和由其他激发光激发产生的其他荧光(信号的噪声分量)。
根据本发明的方法和荧光物质分析器尤其适用于生物样本分析，特别是用于显微镜。即，根据本发明的方法能够对多个生物物质(例如蛋白质)进行几乎是同时和实时的检测，因为许多生物物质具有荧光性。尤其是当用于显微镜中时，此方法与两维或三维扫描系统的结合将产生样本两维或三维的分析图像，并且随着时间对图像进行描绘将能够观察到目标物质的运动等。另外，通过用荧光物质对材料的蛋白质等进行标志，使用根据本发明的方法或荧光物质分析器能够检测到不具有荧光性的目标生物材料。
结果，不仅能够精确地确定用荧光物质进行标志的物质的位置和分布，而且还能基于荧光强度以很高的精度对标志的物质进行定量分析。将本方法或荧光物质分析器与图像分析技术结合使用将能够精确地发现样本中的标志的物质的反应的数量和速度等。
附图说明
图1说明了根据Weiner的傅里叶变换系统的结构；
图2说明了根据本发明用于产生复合光脉冲并用来对多种荧光物质进行分析的光学系统的结构；
图3说明了用于产生光分量分离的复合光脉冲的光脉冲产生系统的实施例的结构；
图4说明了用于产生光分量分离的复合光脉冲的光脉冲产生系统的另一实施例的结构；
图5说明了用于为分量光脉冲进行线性调频的光脉冲产生系统的主要部分的结构；
图6说明了作为根据本发明第一模式的系统的实施方案的荧光物质分析器的一般结构；
图7说明了图6中的荧光物质分析器在包括放置于其后的准直仪和其他元件的部分的结构；
图8说明了作为本发明第二模式的实施方案的荧光物质分析器在包括放置于其后的准直仪和其他元件的部分的结构；
图9说明了作为本发明第三模式的实施方案的荧光物质分析器在包括放置于其后的准直仪和其他元件的部分的结构；
图10说明了第一模式的实施方案的第一修改例；
图11说明了第一模式的实施方案的第二修改例；
图12说明了作为本发明第五模式的实施方案的荧光物质分析器的结构；
图13说明了在图12的荧光物质分析器中使用的中性密度(ND)滤波器，并且图表代表旋转角与光学衰减系数之间的关系；
图14为说明了激发波长分量λ1、λ2和λ3的强度调制状态的图表；
图15说明了荧光检测系统的结构。
具体实施方式
图6说明了作为本发明第一模式的实施方案的荧光物质分析器。在图12中，光源111例如可以是铒掺杂的纤维激光器、锁模钛:蓝宝石激光器或锁模铬:镁橄榄石激光器，其能够产生超短光脉冲。所述超短光脉冲被第一光学系统112会聚在透明物质113(例如水或石英晶体)中的一个点上。在此会聚点，在物质113与超短光脉冲之间发生非线性相互作用，产生连续光谱白光脉冲。所述连续光谱白光脉冲进入包括透镜、反射镜等的第二光学系统114。第二光学系统114将脉冲照射至色散元件115上，色散元件115又将脉冲色散为光谱。色散光进入准直仪116，准直仪116将光送入波长选择装置117。
图6显示了两种类型的波长选择装置：第一种类型117a包括放置在目标波长分量的光路上的小反射镜，第二种类型117b包括在与除了目标波长分量之外的波长分量对应的位置上设置有光吸收部分的反射镜。
光闸121设置在准直仪116与波长选择装置117之间。如图7所示，光闸121包括放置在波长选择装置117b的小反射镜之前或波长选择装置117b的反射部分之前的旋转光闸单元122。每个旋转光闸单元都可以通过在操作单元123上的按键操作任意地旋转，所述操作单元123设置在使用者容易接触到的地方。旋转光闸的旋转转换沿与旋转光闸相对应的光路传播的光的通过与停止。操作单元123可以用简单转换构成。否则，用于控制荧光物质分析器全面运转的控制器(通常为个人计算机)可以用作操作单元123。
只有由波长选择装置117选择并允许通过光闸121的波长分量通过准直仪116返回至色散元件115，色散元件115将波长分量混合为超短光脉冲。该超短光脉冲照射在样本118上，以激发多个目标物质。由激发产生的荧光由检测器119检测。
因而，使用本实施方案的荧光物质分析器，通过操作使用者能方便地接触到的操作单元123，使用者能够很简单地改变照射在样本118上的复合光脉冲中包含的波长分量。
当多个波长分量被选择通过光闸121时，照射至样本上的复合光脉冲包含选出的多个波长分量。在这种情况下，复合光脉冲的分量有可能互相干扰，由于非线性效应而产生不同的频率分量。如此产生的不同频率分量可能激发目标荧光物质之外的荧光物质，其成为分析中的噪声。考虑到这一点，优选地将目标波长分量的光路长度制作得彼此不同。通过这种结构，由光闸121选出的分量光脉冲包含在具有时差的复合光脉冲中，因此防止了不同的频率分量和上述噪声。
图10和图11说明了上述结构的实施例。图10中说明的实施例包括小反射镜117，其沿光路放置在目标波长分量光路的不同位置上，使光路长度不同。图11中说明的实施例包括透明光介质117d，其放置在目标波长分量的光路上，所述目标波长分量由波长选择装置117b的选择性镜子类型限定。所述光介质具有不同厚度(即在光路方向上的尺寸)，以光学地改变光路长度。所述光介质优选地由具有大折射率的材料制成。在任一种情况下，旋转光闸122放置在每个光路上以构成光闸121。
下面将说明作为本发明第二模式的实施方案的荧光物质分析器。图6说明了所述分析器的一般结构，图8说明了包括准直仪116和放置在其后的其他元件的分析器的一部分。波长选择装置131包括许多小镜子132，它们与色散光波长的光路相对应放置。一旦从操作单元133接收到命令信号，波长选择装置131将小镜子132伸入相应的光路。在小镜子132伸入的光路中，具有相应波长的光被小镜子132反射回准直仪116，并且色散元件115将反射光混合为超短光脉冲。在其他光路中，光不被反射回色散元件115，因此复合光脉冲不包含与这些光路相对应的波长分量。这样，使用本实施方案的系统，通过操作单元133给出适当的指令，能够任意选择照射至样本118上的复合光脉冲中包含的波长分量。
下面将说明作为本发明第三模式的实施方案的荧光物质分析器。图6说明了所述分析器的一般结构，图9说明了包括准直仪116和放置在其后的其他元件的分析器的一部分。本实施方案中的分析器具有多个波长选择装置142和转换机构141，所述转换机构141用于选择性地转换波长选择装置142。每个波长选择装置142具有光吸收部分和反射部分，如图6中所示的波长选择装置117b一样制成。图9中的转换机构141为旋转机构，用于选择性地将波长选择装置142放置在光路上。平行移动机构也可以用于构成转换机构141。用于转换操作的指令是通过操作单元143给出的。
图12说明了作为本发明第五模式的实施方案的荧光物质分析器。在图12中，光源211例如可以是铒掺杂的纤维激光器、锁模钛:蓝宝石激光器或锁模铬:镁橄榄石激光器，所述激光器能够周期性地以大体上规则地时间间隔产生一系列超短光脉冲。如上所述，超短光脉冲的宽度为飞秒(10-15秒)级，脉冲产生的频率大约是80至100MHz。
由光源211产生的超短光脉冲由第一光学系统212会聚在透明介质213(例如水或石英晶体)的一点上。在此会聚点，介质213与超短光脉冲之间发生非线性相互作用，产生一系列连续光谱白光脉冲。连续光谱白光脉冲进入第二光学系统214，所述第二光学系统214包括透镜、反射镜等。第二光学系统214将所述光脉冲照射在色散元件215上，并进而将脉冲色散为光谱。准直仪216将色散光发送至波长选择装置217，其选出多个激发波长分量(λ1、λ2和λ3)用于激发目标荧光物质。
在经过波长选择装置217之后，选出的激发波长分量λ1、λ2和λ3进入强度调制器218，所述强度调制器218以不同的频率f1、f2和f3对激发波长分量的强度进行调制。所述强度调制器218包括为每个波长分量设置的转盘型中性密度(ND)滤光器。每个中性密度滤光器设计得其光学衰减系数随着旋转角度变化，如图13所示。中性密度滤光器以不同得旋转速度旋转，从而激发波长分量的强度在与中性密度滤光器旋转速度相对应的不同频率f1、f2和f3被调制。波长λ1的激发光的强度在频率f1调制，其可以防止强度在频率f1正弦变化。同样，波长λ2和λ3的激发光的强度分别在频率f2和f3调制。
激发波长分量λ1、λ2和λ3由会聚光学系统219照射至色散元件220上，所述色散元件220将波长分量混合为超短光脉冲。所述超短光脉冲照射至样本221上。
如上所述，光源211在频率80至100MHz产生超短光脉冲。因此，照射在样本上的复合光脉冲以相同的频率产生。在样本221中，复合光脉冲中包含的所述多个激发波长分量激发多种荧光物质，每个所述荧光物质发射出荧光光线。由荧光物质产生的荧光光线同时从样本211上发射出来，并由荧光检测系统222检测。
下面将参照附图15对荧光检测系统222的运转进行说明。样本221发射出的荧光由荧光色散装置223色散为目标荧光波长分量η1、η2和η3。色散的荧光分量η1、η2和η3的强度由检测器224检测。
检测器224输出与荧光分量η1、η2和η3对应的检测信号，并且检测信号分别在激发波长分量的强度调制频率f1、f2和f3进行同步整流。同步整流由整流器阵列225进行。在图15中，使用了三个调制频率f1、f2和f3，这是因为具有三个激发波长(和荧光波长)η1、η2和η3。因此采用了9个整流器c11-c33。
例如，波长η1的荧光检测信号被发送至整流器c11、c12和c13，所述整流器对信号在频率f1、f2和f3分别进行同步整流。由于波长η1的荧光由激发波长分量λ1产生，而激发波长分量λ1的强度在频率f1进行调制，波长η1的荧光检测信号代表在频率f1的周期性强度变化。因此，在频率f1进行同步整流的整流器c11的输出信号s11只包含关于从目标荧光物质发射出来的荧光的信息。在另一方面，在频率f2和f3分别进行同步整流的另外两个整流器c12和c13的输出信号s12和s13只包含关于由与频率f2和f3相对应的激发波长分量λ1和λ2产生的其他荧光的信息。因此，从同一荧光中，目标输出信号s11和被认为是噪声的其他输出信号s12和s13是分别产生的。
对于波长η2的荧光，在频率f2进行同步整流的整流器c22输出目标信号s22，并且在频率f1和f3分别进行同步整流的另外两个整流器c21和c23输出噪声信号s21和s23。波长η2的荧光的情况解释与之相同。
如上所述，本实施方案的荧光物质分析器能只检测由与目标荧光物质相对应的激发波长分量造成的激发产生的目标荧光，同时能清除由其他激发波长分量造成的不需要的荧光的检测信号。
Claims (8)
1.一种扫描激光显微镜，包括：
a)光源，其用于采用超短光脉冲产生连续光谱白光脉冲；
b)色散元件，其将超短光脉冲产生色散为光谱；
c)波长选择装置，其只选择出所述色散光中包括的多个目标波长分量；
d)反向色散元件，该反向色散元件将所述选择出的多个目标波长分量混合为复合光脉冲；和
e)扫描光学系统，其用于将复合光脉冲扫描至样本上。
2.根据权利要求1所述的扫描激光显微镜，还包括沿光路在不同位置上在色散光的多个目标波长分量的光路上放置的多个镜子。
3.根据权利要求2所述的扫描激光显微镜，其中至少一个镜子具有非平面的反射表面，以对与镜子对应的目标波长分量进行线性调频。
4.根据权利要求1所述的扫描激光显微镜，还包括多个透明光学介质，每个透明光学介质具有不同的厚度，其放置在色散光的所述多个目标波长分量的光路上。
5.根据权利要求4所述的扫描激光显微镜，其中至少一个介质具有非平面的端面，以对与介质对应的目标波长分量进行线性调频。
6.根据权利要求1所述的扫描激光显微镜，还包括光闸，该光闸用于任意地使由波长选择装置选出的目标波长分量通过或停止，其中反向色散元件通过将通过光闸的目标波长分量混合产生复合光脉冲。
7.根据权利要求1所述的扫描激光显微镜，其中：
所述波长选择装置包括一个或多个波长选择元件，其用于只分别选择出色散光的目标波长分量，和开/关机构，其用于启动或禁止每个波长选择元件；和
所述反向色散元件通过将由启动的波长选择元件选择的目标波长分量混合而产生复合光脉冲。
8.根据权利要求1所述的扫描激光显微镜，其中：
所述波长选择机构包括多个波长选择元件，它们用于只选择出色散光的目标波长分量，和转换机构，其用于选择性地转换所述多个波长选择元件；和
所述反向色散元件通过将由转换机构选择的波长选择元件所选择的目标波长分量混合而产生复合光脉冲。
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