CN204439547U - 一种对荧光物质进行成像的超分辨显微镜 - Google Patents
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Abstract
本案公开了一种对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,包括:第一光路,其光线波长选择为适于激发荧光物质产生荧光粒子的波长;第二光路,其设有相位板,以使第二光路的照射面形成为环形光斑;双光楔光程补偿装置,其设在第二光路中,由折射率大于空气折射率的透光材料制成,包括两个含斜边的光楔,两个光楔的斜边彼此可滑动移动地贴合,第二光路中的光线穿过两个光楔的贴合部分。本案采用双光楔调节损耗光的光程,结构简单,光程补偿精度更高,操作更加快速简便;采用超连续谱脉冲光源同时作为激发光光源和损耗光光源,简化了仪器结构,减小了光照对荧光物质的漂白影响。
Description
技术领域
本实用新型涉及显微成像领域,特别涉及一种在医用生物领域对荧光物质进行成像的超分辨显微镜。
背景技术
细胞作为生命活动的基本单元,是深入研究生命过程的关键。了解各种大分子在活细胞中构象改变和精确定位,揭示生物分子相互作用关系,对于研究疾病机理、促进生物医药科学和相关产业的发展具有重大意义。而实现这些的关键在于细胞的观察及检测。
目前,激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy)是细胞原位观察的重要工具,然而,受到光学衍射限制,激光扫描共聚焦显微镜的成像分辨率在200~300nm,随着观察和原位检测的深入,需要对尺寸在20~200nm的病毒、单链或双链DNA实现观察和检测,在这些情况下,共聚焦显微镜就无法分辨。为了突破光学衍射极限,近年来涌现出了不少超分辨光学显微成像方法,如光激活定位法(Photoactivation Localization Microscopy,PALM)、随机光学重构法(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,STORM)、结构光照明法(Structured Illumination Microscopy,SIM)以及受激发射损耗法(Stimulated Emission Depletion,STED)等。相比其他的方法,STED方法是一种更为直观的方法,它以传统共聚焦显微光学技术为基础,通过把被激发的荧光物质限制在小于衍射极限的范围内,从 而实现超高分辨率,其成像方式无需复杂的后期图像处理,因此STED技术被认为是下一代显微光学发展的核心技术,是光学最前沿理论与技术实践的结合。
STED显微成像系统有多种实现方法,但大部分STED系统十分复杂,这些STED系统多采用两组激光光源,且该类系统通过增加反射镜的数量来增加光行进的距离,这带来两方面的问题,一是系统裝校过程十分复杂,每个反射镜在每次使用时都必须精确调校,耗时费力,即使是对从事STED显微镜系统开发的科研人员来说也是一项十分具有挑战性的工作;二是系统的可靠性非常低,用户在使用时经常遇到系统需要重新校准,这在很大程度上限制了STED超分辨显微镜的推广应用。
实用新型内容
为减小STED系统的复杂性,本实用新型采用超连续谱脉冲光源同时作为激发光光源和损耗光光源,此外,为使得激发光和损耗光在时间上保持严格的同步关系,本实用新型在损耗光路中采用双光楔对光程进行补偿,使得激发光和损耗光先后进入物镜,两路光在时间上保持几皮秒的延时,以获得对荧光最佳的损耗效果。同时,采用脉冲光作为激发光和损耗光也减小了光照对荧光物质的漂白。
为了实现上述目的,本实用新型采用以下技术方案:
一种对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,它包括:第一光路,其中的光线的波长选择为适于激发该待成像的荧光物质产生处于激发态的荧光粒子的波长;
第二光路,其中设置有相位板,以使所述第二光路的照射面形成为环形光斑,且所述第二光路中光线的波长选择为不能激发该待成像的荧光物质产 生处于激发态的荧光粒子的波长;
双光楔光程补偿装置,其设置在所述第二光路中,所述双光楔光程补偿装置由折射率大于空气折射率的透光材料制成,且所述光程调节器包括两个含斜边的光楔,两个光楔的斜边彼此可滑动移动地贴合,所述第二光路中的光线穿过两个光楔的贴合部分。
优选的是,所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,包括:
光源,其为超连续谱脉冲激光源,用于发射波长范围较宽的脉冲光;
第一二色镜,其用于将所述波长范围较宽的脉冲光分解为长波长和短波长两路光,其中短波长光波行进的光路为激发光光路,长波长光波行进的光路为损耗光光路;
第一滤光片,其位于所述激发光光路上,且只允许一个特定波长的激光透射,该透射出的特定波长的激光为激发光;
第二滤光片,其位于所述损耗光光路上,且只允许一个特定波长的激光透射,该透射出的特定波长的激光为损耗光;
所述激发光和损耗光均垂直照射于荧光物质上的同一位置;
相位板,其位于所述损耗光的光路上,具有0~2π的涡旋相位分布,用于将所述损耗光的照射面由实心的光斑转变为中间无光周圈有光的圆环空心光斑;
双光楔光程补偿装置,其位于所述损耗光的光路上,由折射率大于空气折射率的透光材料组成,当损耗光穿过所述双光楔光程补偿装置时,损耗光的传播速度小于它在空气中的传播速度,从而使得所述激发光和损耗光产生一个时间差先后到达荧光物质,且激发光先于损耗光到达荧光物质,所述双 光楔光程补偿装置通过自由调节损耗光在双光楔光程补偿装置中的传播距离,来控制所述时间差的大小;
荧光探测系统,其用于检测荧光及其强度;
分析控制系统,其与所述荧光探测系统电连接,用于记录和分析荧光强度,并最终实现显微成像;
其中,通过调节所述双光楔光程补偿装置来改变时间差的大小,以使得所述激发光先照射荧光物质,待荧光物质中的荧光粒子从基态跃迁至激发态之后,且在该处于激发态的荧光粒子发出荧光之前,损耗光刚好照射到荧光物质,使荧光物质受激辐射,以迫使已经处于激发态的荧光粒子跃迁至其他能级,从而通过后续光学器件以滤除损耗区域的荧光信号。
优选的是,所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,所述光楔呈直角梯形或直角三角形。
优选的是,所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,还包括:
三维纳米位移台,其与所述分析控制系统电连接,用于承载荧光物质,并在X、Y、Z方向自由地进行以纳米为单位的移动;
物镜,其位于荧光物质上方,用于聚焦激发光和损耗光,并收集由荧光物质发出的荧光;
第三滤光片,其位于荧光光路上,用于滤除干扰光,透射荧光;
透镜,其位于所述第三滤光片和荧光探测系统之间,用于聚焦荧光;
针孔,其位于所述透镜和荧光探测系统之间,用于滤除干扰光。
优选的是,所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,还包括:
反射镜,其位于所述第二滤光片和相位板之间,用于反射损耗光;
第二二色镜,其位于所述第三滤光片和物镜之间,用于反射所述激发光和透射荧光;
第三二色镜,其位于所述第二二色镜和物镜之间,用于反射所述损耗光,透射激发光和荧光。
优选的是,所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,所述激发光从所述光源出发,依次经过第一二色镜、第一滤光片、第二二色镜、第三二色镜和物镜,最终到达荧光物质。
优选的是,所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,所述损耗光从所述光源出发,依次经过第一二色镜、第二滤光片、反射镜、相位板、双光楔光程补偿装置、第三二色镜和物镜,最终到达荧光物质。
优选的是,所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,所述荧光物质发出的荧光依次经过物镜、第三二色镜、第二二色镜、第三滤光片、透镜和针孔,最终到达荧光探测系统。
本实用新型的有益效果是:本实用新型采用双光楔调节损耗光的光程,结构简单,光程补偿精度更高,操作更加快速简便;采用超连续谱脉冲光源同时作为激发光光源和损耗光光源,简化了仪器结构,减小了光照对荧光物质的漂白影响。
附图说明
图1为本实用新型所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜的结构示意图。
图2为激发光和损耗光从光源出发,在进入第一二色镜时的波列示意图, 图中此时激发光和损耗光波列行进的光程相同。
图3为损耗光在进过双光楔光程补偿装置后,与激发光波列所形成光程差的示意图。
图4为本实用新型所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜中双光楔光程补偿装置的工作原理示意图。
图5为激发光和损耗光的转变示意图,阴影部分表示有光,空白处表示无光,其中,(a)表示损耗光未经过相位板时的光斑图,和激发光一样,为实心光斑;(b)表示损耗光经过相位板后,由实心光斑变为中间无光周圈有光的同心环光斑;(c)表示激发光将荧光物质激发后,处于激发态的荧光粒子即将形成的荧光实心光斑;(d)表示损耗光照射荧光粒子产生受激辐射后,所形成的较小的荧光实心光斑;(I)代表(a)经相位板转变为(b)的过程;(II)代表(b)与(c)反应转变为(d)的过程。
具体实施方式
下面结合附图对本实用新型做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
如图1所示,本案涉及一种对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,它包括以下构件:光源1、第一二色镜2、第一滤光片3、第二滤光片4、反射镜5、第二二色镜6、第三二色镜7、相位板8、双光楔光程补偿装置(第一光楔9和第二光楔10)、物镜11、三维纳米位移台12、第三滤光片13、透镜14、针孔15、荧光探测系统(光电倍增管16)和分析控制系统17。
其中,每个构件的功能分别是:
光源1,其为超连续谱脉冲激光源,用于发射波长范围较宽的脉冲光。
第一二色镜2,位于光源1的光路上,用于将光源1发出的波长范围较宽的脉冲光分解为长波长和短波长两路光,其中短波长光波行进的光路为激发光光路,长波长光波行进的光路为损耗光光路;第一二色镜2能够透射短波长光波,反射长波长光波。
第一滤光片3,其位于激发光光路上,且只允许一个特定波长的激光透射,该透射出的特定波长的激光称为激发光,激发光用于激发荧光物质,使荧光物质中的荧光粒子由基态跃迁至激发态,并发出荧光。
第二滤光片4,其位于损耗光光路上,且也只允许一个特定波长的激光透射,该透射出的特定波长的激光称为损耗光,损耗光用于将处于激发态的荧光粒子退激发,不再产生荧光。
反射镜5,其位于第二滤光片4和相位板8之间,用于反射损耗光;
第二二色镜6,其位于第三滤光片13和物镜11之间,用于反射激发光和透射荧光;
第三二色镜7,其位于第二二色镜6和物镜11之间,用于反射损耗光,透射激发光和荧光;
激发光和损耗光均优选垂直照射于荧光物质上的同一位置。(如图1所示)
相位板8,其在损耗光的光路上,位于反射镜5和第一光楔9之间,相位板8具有0~2π的涡旋相位分布,用于将损耗光的照射面由实心的光斑转变为中间无光周圈有光的空心圆环光斑。(如图5(I)所示)
双光楔光程补偿装置,其位于损耗光的光路上,由折射率大于空气折射率的第一光楔9和第二光楔10组成,当损耗光穿过双光楔光程补偿装置时, 损耗光的传播速度小于它在空气中的传播速度(若换算成光在真空下传播的距离,则相当于损耗光在双光楔光程补偿装置里的光程变长),从而使得激发光和损耗光产生一个时间差并先后到达荧光物质,且因激发光一直在空气中传播(空气的折射率n为1),它将先于损耗光到达荧光物质,双光楔光程补偿装置通过自由调节损耗光在双光楔光程补偿装置中的传播距离,来控制时间差的大小;双光楔光程补偿装置所含的两个光楔均各自优选含有一条斜边,且两个光楔的斜边能够彼此贴合可滑动的移动,光穿过两个光楔的贴合部分,通过滑动来调节激光在两个光楔中的传播距离。更优选的是,第一光楔9和第二光楔10呈直角梯形或直角三角形。
三维纳米位移台12,其与分析控制系统17电连接,用于承载荧光物质,并在X、Y、Z方向自由地进行以纳米为单位的移动,移动精度最高可达1nm。
物镜11,其位于荧光物质上方,三维纳米位移台12和第三二色镜7之间,用于聚焦激发光和损耗光,并收集由荧光物质发出的荧光;
第三滤光片13,其位于荧光光路上,第二二色镜6和透镜14之间用于滤除残留的激发光和损耗光等干扰光,并透射荧光;
透镜14,其位于第三滤光片13和荧光探测系统之间,用于聚焦荧光;
针孔15,其位于透镜14和荧光探测系统之间,用于滤除干扰光。
荧光探测系统,其为一个光电倍增管16,用于检测荧光及其强度。
分析控制系统17,其与荧光探测系统电连接,用于记录和分析荧光强度,并最终实现显微成像。
其中,通过调节双光楔光程补偿装置来改变时间差的大小,以使得激发光先照射荧光物质,待荧光物质中的荧光粒子从基态跃迁至激发态之后,且 在该处于激发态的荧光粒子发出荧光之前,损耗光刚好照射到荧光物质,使荧光物质受激辐射,以迫使已经处于激发态的荧光粒子立刻回到基态,从而失去发射荧光的能力,因而,损耗光又被称作耗损光;呈中间无光周圈有光的同心环光斑的损耗光使荧光物质受激辐射后,荧光物质中剩余的还处于激发态的荧光粒子只能从损耗光中中间无光区域发射出荧光;也就是说,剩下的可发射的荧光被限制在小于衍射极限区域内,从而获得了一个小于衍射极限的发光点,提高了成像分辨率。(如图5(II)所示)
此外,激发光和损耗光到达荧光物质的时间差约比光源发出的单个光脉冲的持续时间多几个皮秒。
该超分辨显微镜中各构件的位置关系为:
激发光从光源1出发,依次经过第一二色镜2、第一滤光片3、第二二色镜6、第三二色镜7和物镜11,最终到达荧光物质。
损耗光从光源1出发,依次经过第一二色镜2、第二滤光片4、反射镜5、相位板8、双光楔光程补偿装置(第一光楔9和第二光楔10)、第三二色镜7和物镜11,最终到达样本荧光物质。
荧光物质发出的荧光依次经过物镜11、第三二色镜7、第二二色镜6、第三滤光片13、透镜14和针孔15,最终到达荧光探测系统(光电倍增管16)。
该超分辨显微镜的工作流程为:
见图1,光源1发出宽波段的脉冲激光,经第一二色镜2分解为长波长和短波长两条光路,其中,短波长光波从第一二色镜2透射出去,长波长光波从第一二色镜2反射出去,短波长光波经第一滤光片3后得到激发光,随后激发光经第二二色镜6反射、第三二色镜7透射、物镜11聚焦后照射到位 于三维纳米位移台上的荧光物质上的某一点,并激发该点上的荧光粒子,使其从基态跃迁至激发态;长波长光波经第二滤光片4后得到损耗光,随后损耗光经反射镜5反射、相位板8后,原本的实心光斑转变成圆环状光斑,圆环的内圆区域没有光,之后损耗光经由双光楔组成的双光楔光程补偿装置后,传播速度得到降低,从而可以使得激发光先激发荧光物质,损耗光最后经第三二色镜7反射、物镜11聚焦后,照射到荧光物质上的同一点,使已经处于激发态的荧光粒子回到基态,丧失发射荧光的能力,而没有被损耗光照射到的区域,即损耗光的光斑中圆环内圆没有光的区域,处于激发态的荧光粒子可以从这个区域内发射出荧光。发出的荧光经物镜11收集聚焦、第三二色镜7透射、第二二色镜6透射、第三滤光片13过滤杂光、透镜14聚焦、针孔15过滤杂光后,被光电倍增管16所接收,通过分析控制系统17控制三维纳米位移台12的移动,可对荧光物质的每一个点进行激发和探测,从而得到每一个点的荧光光强参数,综合这些参数可最终生成荧光物质的荧光图像,实现显微成像的目的。
通过双光楔光程补偿装置来精密地调整损耗光的光程,以保证激发光和损耗光光程差满足预期要求。激发光和损耗光的波长不是随意选择的,而是要根据荧光物质的特性进行选择,不同的荧光物质,其能够使它激发的激发光的波长和能够使它损耗的损耗光的波长均不同,而激发光和损耗光的选择可根据所要成像的荧光物质去查阅已有文献。例如,当荧光物质为市售的型号为Alexa Fluor 488的荧光染料产品时,激发光的波长须为488nm,损耗光的波长须为592nm,所发出的荧光的波长为519nm,所用光源的波长范围为400~1700nm。
激发光和损耗光光程补偿原理说明(参见图2和图3):这里所说的光程指光波从光源出射到进入物镜光束行进的距离换算为其在真空中行进的距离,由于激发光和损耗光均从同一个光源发出,刚从光源出射时,激发光波列和损耗光波列行进了相同的光程,是并列的(如图2所示),STED系统要求激发光先进入物镜,之后间隔几个皮秒损耗光脉冲才能进入物镜,因而损耗光的光程要比激发光的光程长(或者说,要让损耗光传播的速度慢一点),为此,本案采用的手段是增加一个双光楔光程补偿装置,参见图3,光程差为wt=w0+w1,w1为激发光波列的长度,w0为两个波列的空间间隔,约为几个皮秒对应的光程,激发光波列的长度为w1=t×c,t为光源脉冲的持续时间,c为真空中的光速。
双光楔调节光程的原理说明:参见图4,假设两个光楔材料的折射率为n,光轴和光楔斜面的夹角为α,初始位置光束在光楔中传播的距离为l0,则光束传播的光程为n×l0(此处光程已等效换算成光在真空中行进的距离),当采用双光楔调节光程时,光楔1相对于光楔2沿斜面滑动了距离d,为简便起见,假定第二光楔10不动,第一光楔9沿斜面滑动了距离d,此时光束在光楔中传播的距离为l1,对应光束传播的光程为n×l1,则调节前后光束在光楔中传播的距离变化为l1-l0=d×cosα,光程变化量为(n-1)×(l1-l0)=d×cosα×(n-1),空气中的折射率为1。
尽管本实用新型的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本实用新型的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本实用新型并不限于特定的细节和这里示 出与描述的图例。
Claims (8)
1.一种对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,其特征在于,包括:
第一光路,其中的光线的波长选择为适于激发待成像的荧光物质产生处于激发态的荧光粒子的波长;
第二光路,其中设置有相位板,以使所述第二光路的照射面形成为环形光斑,且所述第二光路中光线的波长选择为不能激发该待成像的荧光物质产生处于激发态的荧光粒子的波长;
双光楔光程补偿装置,其设置在所述第二光路中,所述双光楔光程补偿装置由折射率大于空气折射率的透光材料制成,且所述双光楔光程补偿装置包括两个含斜边的光楔,两个光楔的斜边彼此可滑动移动地贴合,所述第二光路中的光线穿过两个光楔的贴合部分。
2.如权利要求1所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,其特征在于,包括:
光源,其为超连续谱脉冲激光源,发出宽波长的脉冲光;
第一二色镜,其位于所述光源的光路上,用于将所述宽波长的脉冲光分解为长波长和短波长两路光,其中,短波长光波行进的光路为激发光光路,长波长光波行进的光路为损耗光光路;
第一滤光片,其位于所述激发光光路上,且只允许一个特定波长的激光透射,该透射出的特定波长的激光为激发光;
第二滤光片,其位于所述损耗光光路上,且只允许一个特定波长的激光透射,该透射出的特定波长的激光为损耗光;
荧光探测系统,其用于检测荧光及其强度;
分析控制系统,其与所述荧光探测系统电连接,用于记录和分析荧光强度,并最终实现显微成像,以及三维纳米位移台的控制;
其中,所述相位板具有0~2π的涡旋相位分布,用于将所述损耗光光束调制为空心光束。
3.如权利要求1所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,其特征在于,所述光楔呈直角梯形或直角三角形。
4.如权利要求2所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,其特征在于,还包括:
三维纳米位移台,其与所述分析控制系统电连接,用于承载荧光物质,并在X、Y、Z方向自由移动;
物镜,其位于荧光物质上方,用于聚焦激发光和损耗光,并收集由荧光物质发出的荧光;
第三滤光片,其位于荧光光路上,用于滤除干扰光,透射荧光;
透镜,其位于所述第三滤光片和荧光探测系统之间,用于聚焦荧光;
针孔,其位于所述透镜和荧光探测系统之间,用于滤除干扰光。
5.如权利要求4所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,其特征在于,还包括:
反射镜,其位于所述第二滤光片和相位板之间,用于反射损耗光;
第二二色镜,其位于所述第三滤光片和物镜之间,用于反射所述激发光和透射荧光;
第三二色镜,其位于所述第二二色镜和物镜之间,用于反射所述损耗光,透射激发光和荧光。
6.如权利要求5所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,其特征在于,所述激发光从所述光源出发,依次经过第一二色镜、第一滤光片、第二二色镜、第三二色镜和物镜,最终到达荧光物质。
7.根据权利要求5所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,其特征在于,所述损耗光从所述光源出发,依次经过第一二色镜、第二滤光片、反射镜、相位板、双光楔光程补偿装置、第三二色镜和物镜,最终到达荧光物质。
8.根据权利要求5所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜,其特征在于,所述荧光物质发出的荧光依次经过物镜、第三二色镜、第二二色镜、第三滤光片、透镜和针孔,最终到达荧光探测系统。
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