CN102902056B - 基于量子统计的高精度光学成像装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于量子统计的光学成像装置，包括激光共聚焦显微装置(1)、单光子计数统计装置(2)和主控装置(3)，其中，激光共聚焦显微装置(1)用于激发样品并收集样品发射的荧光，并将该荧光导入所述单光子计数统计装置(2)；单光子计数统计装置(2)用于接收来自激光共聚焦显微装置(1)的荧光信号，产生多个单光子计数信号和多光子符合计数信号，并向主控装置(3)输出多个单光子计数信号和多光子符合计数信号；主控装置(3)分别连接于所述激光共聚焦显微装置(1)和单光子计数统计装置(2)，用于产生控制信号并分别输出给激光共聚焦显微装置(1)和单光子计数统计装置(2)，以控制激光共聚焦显微装置(1)的共聚焦扫描与单光子计数统计装置(2)的数据采集同步。本发明能提供相邻物体的高精度成像和分辨，其精度不受瑞利极限限制。

Description

基于量子统计的高精度光学成像装置与方法

技术领域

本发明属于光学成像和光学检测技术领域，具体涉及一种基于量子统计的光学成像装置与方法，该光学成像方法具有突破瑞利散射极限的高精度。

背景技术

利用光学方式分辨两个物体的精度受制于瑞利散射极限，其分辨本领与所用光的波长有关。如利用可见光作为探测光源，一般分辨精度在数百个纳米。而现阶段在各种研究和应用中，经常遇到尺度在100纳米以下的分辨。在这种情况下，普通光学探测方式已经无能为力。因此，一种解决方式是利用各种昂贵的实验仪器，如原子力显微镜，近场光学扫描显微镜或者扫描电子显微镜等。另外一种方式，就是利用处在不同位置的物体所辐射的光学信号在某些属性上的可分辨性实现成像和分辨，如受激发射损耗显微技术(stimulated emission depletion，STED)，光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy，PALM)，随机光学重构显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)和饱和结构照明显微技术(saturated structure illumination microscopy，SSIM)。然而，其精度往往受制于其探测光的某些光学属性的限制。如果不同点发射的光的属性完全相同或相近，以上各种方法就不能使用。同时以上各种方法都需要复杂的光学和电子学系统来支持。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是当前的光学成像方法受到探测光的光学属性的限制，不能达到100纳米以下的分辨率。

(二)技术方案

为解决上述技术问题，本发明提出一种基于量子统计的光学成像装置，包括激光共聚焦显微装置、单光子计数统计装置和主控装置，其中，激光共聚焦显微装置用于激发样品并收集样品发射的荧光，并将该荧光导入所述单光子计数统计装置；单光子计数统计装置用于接收来自激光共聚焦显微装置的荧光信号，产生多个单光子计数信号和多光子符合计数信号，并向主控装置输出多个单光子计数信号和多光子符合计数信号，所述多个单光子计数信号和多光子符合计数信号用于重构样品图像；主控装置分别连接于所述激光共聚焦显微装置和单光子计数统计装置，用于产生控制信号并分别输出给激光共聚焦显微装置和单光子计数统计装置，以控制激光共聚焦显微装置的共聚焦扫描与单光子计数统计装置的数据采集同步。

根据本发明的一种具体实施方式，所述单光子计数统计装置包括两个单光子探测器、一个延时器、一个光子符合计数装置和一个多通道分析仪，所述两个单光子探测器根据输入的荧光信号分别产生单光子计数信号；所述光子符合计数装置用于根据上述两个单光子计数信号产生双光子符合计数信号和时间幅度转换信号。

根据本发明的一种具体实施方式，所述光子符合计数装置包括两个输入端和两个输出端，两个输入端分别用于输入由所述光子探测器产生的单光子计数信号，其中一个输入端与所述光子探测器之间具有一个延时装置，两个输出端分别用于输出时间幅度转换信号和双光子符合计数信号。

根据本发明的一种具体实施方式，所述延时装置是加长的信号线。

根据本发明的一种具体实施方式，所述时间幅度信号输出到多通道分析仪，所述多通道分析仪用于对多个时间幅度转换信号进行统计，得到双光子符合计数信号的强度与所述两个单光子计数信号之间的时间间隔的关系，以确定双光子符合计数的零点位置。

本发明还提出一种基于量子统计的光学成像方法，包括如下步骤：将激光照射到样品上；对样品上发射的荧光进行单光子计数，产生多个单光子计数信号；根据所述多个单光子计数信号产生多光子符合计数信号；对多光子符合计数信号和多个单光子计数信号的强度图像进行处理，获得分辨率小于瑞利极限的样品图像。

根据本发明的一种具体实施方式，所述多光子符合计数信号包括：N个光子的符合计数信号、N-1个光子的符合计数信号、……、2个光子的符合计数信号，其中N为发光点的个数。

根据本发明的一种具体实施方式，使用公式来计算所述样品上两个点A、B的光强I_A和I_B，其中I₁为两个单光子计算信号强度之和，I₂为双光子符合计数信号强度。

根据本发明的一种具体实施方式，所述双光子符合计数的取样窗口宽度设置为小于荧光寿命的5倍。

根据本发明的一种具体实施方式，所述双光子符合计数的取样窗口宽度为2ns。

(三)有益效果

本发明基于量子统计的光学成像方法，提供相邻物体的高精度成像和分辨，其精度不受瑞利极限限制，原则上可以达到任意精度。即使不同物体所发的光学信号属性完全相同的情况下，也可以进行独立的光学成像和识别。该方法也适用于更广泛的光信号的识别，例如光信号的寿命、频率、偏振等其它自由度的识别。

附图说明

图1是本发明的光学成像装置的模块组成示意图；

图2是本发明的光学成像装置的激光共聚焦显微装置和单光子计数统计模块组成示意图；

图3是双光子强度与双光子之间时间间隔的二阶相关函数g⁽²⁾(t)的曲线图。

图4是本发明的主控装置在扫描过程中控制流程图；

图5是本发明的主控装置的控制信号示意图，用于完成图4的控制过程；

图6是现有技术的共聚焦成像图，图中显示了在金刚石中对氮-真空缺陷实现对单光子计数成像图；

图7是对两个离的很近的氮-真空缺陷实现对的单光子计数成像图(a)和双光子计数成像图(b)；

图8是利用算法使实施例1中图7中两个氮-真空缺陷成像分离而求得的图像，即实现两个重合点的识别；

图9是图8中两个氮-真空缺陷强度的三维分布图，从峰值可以看出两者基本重合；

图10是实施例2中实现图像分辨率提高的原理图；

图11是实施例2中实现的图像分辨率提高的效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明通过荧光显微镜收集待成像物体的荧光，荧光信号接入光子计数统计系统进行处理，利用光子的量子统计特性，可获取高阶光强信息，使用合适的算法重构出高分辨率的图像。利用测量更高阶的光子符合计数方式，可以实现更多发光物体的识别和分辨。

本发明可应用于具有多个发光点的物体成像，测量高阶的光子符合需要将荧光信号分成多路，并分别测量多个探测器之间的符合计数。假设对具有N个发光点的样品进行成像，本发明的成像方法包括如下步骤：

对样品进行逐点扫描，获得所需成像区域的N个发光点的荧光信号；

利用单光子探测器测得所述N个发光点的N个单光子计数信号；

利用光子符合设备测得N个单光子探测器之间的N个光子、N-1个光子、N-2个光子、……、2个光子符合计数信号；

根据所述N个发光点的单光子计数信号和N个光子、N-1个光子、N-2个光子、……、2个光子符合计数信号，重构多个发光点的样品的精确图像。

在下面的实施例中我们以两个发光点的双光子符合计数为例进行说明，下面也简称为符合计数。但是，本领域技术人员应当理解，应用本发明提出的量子统计原理，也可以实现多于两个发光点的多光子符合计数，从而实现多个发光点的样品的图像重构。

图1是本发明的光学成像装置的一个实施例的模块组成示意图，该实施例以金刚石材料中两个氮-真空色心的成像为例进行说明。如图1所示，本发明的光学成像装置包括激光共聚焦显微装置1、单光子计数统计装置2和主控装置3。

激光共聚焦显微装置1用于激发样品并收集样品发射的荧光，并将该荧光导入所述单光子计数统计装置2。

单光子计数统计装置2用于接收来自激光共聚焦显微装置1的荧光信号，产生单光子计数信号和双光子符合计数信号，并向主控装置3输出单光子计数信号和双光子符合计数信号。

主控装置3分别连接于激光共聚焦显微装置1和单光子计数统计装置2，用于产生控制信号并分别输出给激光共聚焦显微装置1和单光子计数统计装置2，以控制激光共聚焦显微装置1的共聚焦扫描与单光子计数统计装置2的数据采集同步。

主控装置3可由普通PC机搭配DAQ数据采集卡实现。数据采集卡只需要含有足够的可配置的计数器即可。根据本发明的具体实施方式，其至少包含四路计数器，以提供足够的计数器资源。在该实施例中，DAQ数据采集卡可以选择NI6351、NI6343，可方便使用NI的Labview配置。

图2是本发明的光学成像装置的激光共聚焦显微装置1和单光子计数统计装置2的模块组成图。如图2所示，激光共聚焦显微装置1包括荧光物镜O1、双色镜MD、长通滤波镜ML、透镜O2、小孔P和分束器BS。单光子计数统计装置2包括两个单光子探测器D1、D2、一个延时器DL、一个光子符合计数装置TAC和一个多通道分析仪MCA。

如图2所示，激光L经过双色镜MD反射进入荧光物镜O1，在待成像样品上聚焦，其中该待成像样品装载在样品台S上。激光L激发样品产生荧光，荧光物镜O1的焦点处的荧光被荧光物镜O1收集，并透过双色镜MD，经长通滤波镜ML滤波，滤除激发光，最后透镜O2将荧光聚焦到小孔P上，形成共聚焦光路。荧光在小孔P处被聚焦后，经过分束器BS进行均分，分别导入单光子计数统计装置2中的两个单光子探测器D1、D2。根据本发明，激光L、荧光物镜O1、双色镜MD、长通滤波镜ML可以直接使用现有的光学元件搭建，也可以直接使用成熟的荧光显微镜系统。小孔P的选择是多样的，可以使用高能小孔，也可以直接采用光纤。在该实施例中，小孔采用芯径为9μm的光纤。

根据本发明，样品台S可以由一个长量的普通程手动三维光学平移台和高精度的一个三维纳米压电平移台构成(分别用X、Y、Z表示三个维度，其中Z为物镜光轴方向)，利用该平移台可以实现大范围的调节和三维扫描；鉴于三维纳米压电台比较昂贵，也可以由以下方案替代：使用一个一维纳米平移台实现Z方向(物镜焦距方向)的移动，并在使用在荧光物镜O1后面加二维扫描振镜(可以使用Thorlabs公司GVS002)，实现X-Y平面扫描。在本实施例中，样品台S使用PI公司的611FS平移台，其控制器为E516，闭环控制的重复精度可以到10nm。

单光子探测器D1、D2根据输入的荧光信号分别产生单光子计数信号n₁、n₂，单光子探测器探测到一个光子就会输出一个例如宽度为40ns的TTL脉冲，所以计数信号n₁、n₂为TTL脉冲序列。

光子符合计数装置TAC包括两个输入端和两个输出端，输入端分别为start端和stop端，用于输入光子探测器D1、D2产生的单光子计数信号。输出端分别为时间幅度转换端TAC和符合计数输出端SCA，其分别用于输出时间幅度转换信号、符合计数信号。根据本发明，单光子计数信号n₁、n₂分别输入光子符合计数装置TAC中的start端和stop端。在stop端与光子探测器之间需要加一定延时，可以由延时器DL实现，延时长短由成像荧光物质的荧光寿命有关：不小于荧光寿命即可。在该实施例中，单光子探测器D1、D2可直接用Perklin的SPCM，延时器DL可直接通过加长D2与stop端间的信号线实现：1m电信号延时线，大约产生3.3ns延时。

光子符合计数装置TAC接收到单光子计数信号n₁、n₂，会在SCA端和TAC端分别输出双光子符合计数信号n_g和时间幅度转换信号。时间幅度转换信号是一个电压脉冲信号，其峰值电压是start端和stop端接收到单光子事件的时间间隔。

光子符合计数装置TAC输出端产生的时间幅度转换信号输出到多通道分析仪MCA中，由多通道分析仪MCA获得多个时间幅度转换信号的统计，从而获得双光子符合计数信号的强度与所述两个单光子计数信号之间的时间间隔的关系，即二阶相关函数g⁽²⁾(t)。g⁽²⁾(t)数据可以通过数据线连接至主控装置3，在PC终端显示g⁽²⁾(t)曲线。

图3是双光子符合计数信号的强度与所述两个单光子计数信号之间的时间间隔的二阶相关函数g⁽²⁾(t)的曲线图。通过单个发光源的g⁽²⁾(t)的曲线可以确定双光子符合计数的零点位置，如图3所示的谷底位置即同时刻发射的两个光子，经探测器和信号线后到达start和stop所产生的时间延时。通过此参数将符合计数输出端SCA取样窗口的位置设置在零点处。符合窗口的宽度，即符合计数输出端SCA取样窗口的宽度，设置为小于荧光寿命的5倍即可。在该实施例中选取2ns。如图3所示的灰色区域即为取样窗口。g⁽²⁾(t)的曲线的测量只是为了获取符合计数窗口的位置参数，一旦设置，后续测量无需再设置。如果光子到达start和stop时间延时确定，光子符合计数装置TAC可以由高速逻辑门配合延时器实现，或者通过配置FPGA实现。在该实施例中，光子符合计数装置TAC直接使用Ortec公司的TAC 567。

符合计数参数(符合窗口位置和宽度)，可通过g⁽²⁾(t)的曲线设置。符合计数参数设置完毕后即可进行成像的测量。成像时，单光子探测器D1、D2各自的计数信号n₁、n₂，以及符合计数信号n_g作为一组信号输入到主控装置3中。在该实施例中，控制装置3的DAQ数据采集卡中三个计数器分别对这三个信号进行计数。

成像过程中，主控装置3控制流程如图4所示。首先根据需要扫描的区域，生成扫描位置的序列，然后将控制主机3控制激光共聚焦显微装置1的扫描位置移动到初始位置，移动结束后开始计数，到达设定的计数时间，采集卡读出计数值，然后将扫面位置移动到下一个位置，移动完毕再计数。如此按照扫描位置列表的顺序进行移动，采集数据。当列表扫描完毕后，即完成一次扫描任务。由于扫描列表是主控装置3根据预定程序生成的一个数组，因此可以实现任意方式的扫描，例如只对某一维度进行扫描或者按照一定顺序实现三维扫描。预定程序的扫描参数主要包含扫描区域、步长和参与扫描的维度。例如在X＝10μm，Y＝10μm位置对Z轴10μm至15μm区域扫描，扫描步长为1μm，用(1，2，3)代表X＝1μm，Y＝2μm，Z＝3μm的位置，则生成的扫描数组类似于[(10，10，10)，(10，10，11)，(10，10，12)，(10，10，13)，(10，10，14)，(10，10，15)]。生成类似序列的程序的实现方式有多样，这里不再叙述。

图4是本发明的主控装置在扫描过程中控制流程图。控制过程可以由主控装置3的的预定控制程序实现，但是这种方式时间控制精度不高，只能到ms量级以上，因此导致扫描速率不高，为了获得高速的扫描方式，上述控制流程也可以通过硬件实现。控制装置3的DAQ数据采集卡中一个计数器配置为输出，作为其他三个计数器的采样触发信号和移动触发信号，即图1中主控装置3对激光共聚焦显微装置1和单光子计数统计装置2的控制信号；其余三个计数器配置为上升或者下降沿计数，对单光子计数统计装置2输出的单光子计数信号n₁、n₂、n_g的脉冲进行计数。控制信号的形式如图5所示，在下跳沿触发三个计数器进行数据采样，并且触发共聚焦扫描移向下一个位置，在低电平时三个计数器停止计数，移动结束后控制信号变为高电平，计数器才开始对新的位置进行计数。在该实施例中，利用Labview将控制信号配置为三个计数器的门控和采样信号即可实现上述功能。

激光共聚焦显微装置1的每次移动、采集数据，相当与获得一个像素的强度。不同于普通的显微镜只含有一阶光强信息，这个像素强度不仅包含一阶光强信息n₁、n₂，而且含有二阶光强信息n_g。由于该探测方法相比传统探测方法获得更多的信息，因此导致分辨率的提升。

下面根据一个上述实施例来说明根据本发明的光学成像装置进行光学成像的方法。

首先，将待成像样品放置样品台S上。在该实施例中，样品是个含有氮-真空缺陷的金刚石，缺陷的浓度很低，在1μm×1μm的区域内可以找到单个缺陷。由于金刚石中氮-真空缺陷的吸收峰在570nm附近，发射峰在650nm附近，因此选择激光L为532nm绿光激光，双色镜MD和长通滤波镜ML选择滤波波长在600nm。

打开激光L，调节样品台S，将样品调节至激光焦点附近，可以通过观察显微镜成像或者激光的反射光斑大小确定是否在焦点附近。

然后，主控装置3根据控制程序控制激光共聚焦显微装置1的激光L进行Z轴扫描，对Z轴荧光成像，如果单光子计数统计装置2可以探测到荧光，即单光子探测器D1、D2有荧光计数，则可以确定激光L确实已经激发样品；如果荧光随Z轴位置发生明显变化，则发生变化处即样品的表面。在该实施例中，假设测得的样品表面在Z轴等于30μm处，通过此参数，可进一步设置后面的扫描参数：例如，扫描样品表面以下10μm平面，X从10μm到20μm，Y从10μm到20μm的区域，步长为2μm，由于样品表面在Z＝30μm，因此表面以下10μm对应Z＝20μm，参数传入程序后生成的二维扫描列表如下：

(10，10，20)，(12，10，20)，(14，10，20)，(16，10，20)，(18，10，20)，(20，10，20)，

(10，12，20)，(12，12，20)，(14，12，20)，(16，12，20)，(18，12，20)，(20，12，20)，

(10，14，20)，(12，14，20)，(14，14，20)，(16，14，20)，(18，14，20)，(20，14，20)，

(10，16，20)，(12，16，20)，(14，16，20)，(16，16，20)，(18，16，20)，(20，16，20)，

(10，18，20)，(12，18，20)，(14，18，20)，(16，18，20)，(18，18，20)，(20，18，20)，

(10，20，20)，(12，20，20)，(14，20，20)，(16，20，20)，(18，20，20)，(20，20，20)

随后，在主控装置3的控制下，开始如图4所示的扫描过程，扫描完毕后，会获得对应位置的计数数据，对计数数据与位置数据作图即可得到图像。在该实施例中，步长为2μm只是为了方便说明，实际扫描步长可能会设置到几百纳米左右，这样生成的扫描列表就会很大，但工作原理与上述说明类似。图6是现有技术的共聚焦成像图，图中显示了在金刚石中对氮-真空缺陷实现对单光子计数成像图，即对单光子探测器D1输出的信号n₁计数信号的成像图，该图中X坐标从0μm到10μm，Y坐标从0μm到10μm，扫描步长为100nm，扫描计数时间为20ms，灰度标尺单位为每秒计数率。由于n₁为单光子计数，对应一阶光强，该图像n₁(x，y)就是现有技术中的共聚焦成像(单光子计数与位置x、y的函数)。图6中的亮斑即氮-真空缺陷，S2亮斑为单个缺陷，如果对其g⁽²⁾(t)进行测量，就会得到如图3的曲线，通过谷底位置和半峰宽可以设置符合计数的窗口位置和宽度参数。

g⁽²⁾(t)曲线的测量步骤如下：获得图6后，将共焦显微镜焦点移动到图6上某个亮斑所在位置，假设移动到S2处，并将焦点固定在此处，此时n₁和n₂都会探测到S2的荧光，光子符合计数装置TAC就会产生单光子计数信号n₁、n₂的光子符合计数信号，光子符合计数信号输入多通道分析仪MCA进行统计处理，经过一段时间测量后会获得一条曲线，即为g⁽²⁾(t)，如图3所示。

图6中间亮斑S1含有两个色心，这可以通过g⁽²⁾(t)曲线g⁽²⁾(0)＝0.5确定。以该亮斑为中心，附近0.8μm×0.8μm区域扫描成像，扫描步长为50nm，计数时间为100s，所获得的单光子计数(一阶光强)和双光子计数(二阶光强)成像如图7(a)、(b)，注意这里单光子计数值是两探测器单光子计数之和，即n₁+n₂。灰度图标尺表示每秒的计数率。由于单光子计数比双光子率高，所以在相同的探测时间内，双光子图像的噪音比较大。设置更长的计数时间可以降噪，但会导致探测时间变长；另一个方法就是提高共聚焦系统的收集效率，由于双光子计数与收集效率平方成正比，如果收集效率变为原来的两倍，则双光子计数率是原先的四倍，提升非常显著。实例中探测时间较长，主要也因为金刚石的折射率比较大，金刚石中含氮-真空缺陷的荧光，在金刚石与空气的表面大部分荧光被全反射进入金刚石，只有很少一部分，大约3％投射被物镜收集。如果在折射率比较小的介质中，例如空气，收集效率可以到28％，对应计数时间只需1.2s就可以达到金钢石中100s一样的效果。

获得一阶光强和二阶光强图像后，可以通过这些数据通过一定算法实现超分辨，下面用两种数据处理算法举例说明：

数据处理实施例1

如果两个单光子光源物体(本例中为两个含氮-真空缺陷)距离非常近，远小于荧光波长，例如只有几十纳米甚至几纳米，由于光学衍射利用传统的方法无法分辨两点。如果将这两个物体标记为A、B，每个物体在位置(x，y)处光强分别I_A(x，y)和I_B(x，y)(对应单光子计数为n_A(x，y)+n_B(x，y))。如果只存在A或者只存在B时，现有技术的成像方法就只会测量到I_A(x，y)或者I_B(x，y)，由于光学衍射I_A(x，y)或者I_B(x，y)成为具有一定半峰宽的峰，半峰宽的宽度即为分辨率。实施例中使用532nm激光，物镜OL1数值孔径为0.9时，分辨率大约300nm。若两个物体同时存在并且发光无关联，传统成像方法测到的光强为两个物体光强的和：

I₁(x，y)＝I_A(x，y)+I_B(x，y)            (1)

如果A，B之间的距离大于光学分辨率，在I₁(x，y)上仍然可以看到A，B各自的峰值，通过I₁(x，y)即可分辨两个物体；相反则I_A(x，y)和I_B(x，y)相互重叠，通过I₁(x，y)便不可以分辨两个物体。

另一方面如果能得到I_A(x，y)、I_B(x，y)各自的光强，也相当于完全分辨两点，即使这两点完全重合。但不幸的是，从公式(1)中的I₁(x，y)无法得到I_A(x，y)，I_A(x，y)。所以只用现有技术的方法是无法分辨两点的。

对于一般的量子光源，如单原子、单量子、单分子、金刚石材料中的单个氮-真空缺陷等，每个物体每次只能发出一个光子，相应的双光子光强(对应双光子计数或者符合计数为n₂(x，y))为：

I₂(x，y)＝h(1+K)I_A(x，y)I_B(x，y)                    (2)

其中h与测量系统有关的参数，实施例中h＝2n₁n₂t_w/[(n₁+n₂)²]，n₁、n₂即前面所说两个单光子探测器D1，D2的计数率，t_w表示双光子符合探测时的符合窗口的时间宽度，即SCA取样窗口宽度。K描述的是光子的量子不可区分性。通常情况下，K＝0。

因此，利用(1)和(2)式，可以计算得到独立的I_A(x，y)与I_B(x，y)：

$I_{A,B}=\frac{I_1\±\sqrt{I_1^2-{4I}_2/h}}{2}---\left(3\right)$

所以需要对测得数据做如下处理：

$n_{A,B}=\frac{{(n_1+n_2)}^2}{2}(1\±\sqrt{1-\frac{{2n}_g}{n_1{n}_2{t}_w}})---\left(4\right)$

得到两点各自的光强I_A(x，y)、I_B(x，y)，即n_A(x，y)、n_B(x，y)。图8是对图7数据按照公式(4)求得的图像，两幅图像(a)、(b)分别是A、B两个氮-真空缺陷各自的图像，即I_A(x，y)、I_B(x，y)。两图像中亮斑中心就是个两氮-真空缺陷所在位置，可以通过拟合I_A(x，y)、I_B(x，y)获得。图中二者位置分别用“+”标记出，易得两者距离为9.0±2.5nm，远远小于瑞利极限。图9是两个氮-真空缺陷三维分布图，可以发现两个氮-真空缺陷几乎完全重叠。该方法的分辨精度不受瑞利极限限制，仅仅与所收集的光子数与装置的精度有关，原则上可以达到任意精度，即使它们之间是完全重合。

数据处理实施例2

第一种数据处理方法虽然分辨率很高，但只能针对有限点的识别。实际成像过程中不能预知所含单光子光源的个数，所以需要一种算法可以实现对整体分辨率有提高而不依赖于单光子光源的多少。由于荧光物质组成的基本单位是单光子光源，无论是单原子、单分子还是单量子点。因此探测的光强就是这些单光子源光强的和。由于光学衍射每个单光子源光强分布有一定半峰宽，这个半峰宽就对应分辨率，如果对单光子源光强进行n次方运算(n＞1)，获得的新的峰的半峰宽会相应减少，相对应的分辨率也就提升。如图10所示，简便起见以两个点为例，实际对任意多点都合适。普通探测I(x)＝<I₁(x)>+<I₂(x)>，这里<I₁>、<I₂>分别代表S1，S2两个单光子光源的光强分布。<I₁(x)>、<I₂(x)>具有一定半峰宽并且离的比较近，I(x)只有一个峰，即不能分辨图10中S1、S2两点，如果采用下面的参数I⁽⁴⁾(x)＝<I₁(x)>⁴+<I₂(x)>⁴，即对各个单光子源强度分布取四次方再求和，由于取四次方使半峰宽变窄，从I⁽⁴⁾(x)图像上可以分辨两点。对应以I⁽ⁿ⁾(x)表示n次方求和参数，n越大半峰宽越窄，分辨率越高。获得I⁽ⁿ⁾(x)也需要测量高阶光强，同样以n＝2为例，用上面测量的n₁、n₂、n_g为参数，I⁽²⁾(x)可以表示为：

$I^{\left(2\right)}={(n_1+n_2)}^2(1-\frac{n_g}{n_1{n}_2{t}_w})---\left(5\right)$

图11(a)、(b)分别是测得的单光子和双光子成像，分别对应n₁+n₂和n_g，(c)为按照公式(5)获得的I⁽²⁾像。在(a)中只能看到多个点组成的一条亮带，而在I⁽²⁾中可以清晰的分辨(a)中无法分辨的的两点。(a)中靠下面的暗点在I⁽²⁾中基本消失，这是因为光强取平方后计数比较低的单光子光源数值会更低，所以只有具有相同性质计数比较高的单光子源才能有效成像，相当于压制了其他单光子源对成像的影响。(d)是(a)与(c)的比较，即传成像和I⁽²⁾成像的比较，数据分别取自(a)、(c)黑线方向，可以得到I⁽²⁾分辨率是现有技术的1.4倍。

由上可知，本发明的基于量子统计特性的光学成像方法，分辨精度不受瑞利极限限制，仅仅与所收集光子数与实验装置精度有关，使用实施例1分辨两点时，原则上可以达到任意精度。同时，本发明所需的装置简单，几乎所有有关微纳光学成像的物理，化学，材料以及生物研究及应用单位都具有相关的检测和成像设备。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于量子统计的光学成像装置，其特征在于，包括激光共聚焦显微装置(1)、单光子计数统计装置(2)和主控装置(3)，其中，

激光共聚焦显微装置(1)用于激发样品并收集样品发射的荧光，并将该荧光导入所述单光子计数统计装置(2)；

单光子计数统计装置(2)用于接收来自激光共聚焦显微装置(1)的荧光信号，产生多个单光子计数信号和多光子符合计数信号，并向主控装置(3)输出多个单光子计数信号和多光子符合计数信号，所述多个单光子计数信号和多光子符合计数信号用于重构样品图像；

主控装置(3)分别连接于所述激光共聚焦显微装置(1)和单光子计数统计装置(2)，用于产生控制信号并分别输出给激光共聚焦显微装置(1)和单光子计数统计装置(2)，以控制激光共聚焦显微装置(1)的共聚焦扫描与单光子计数统计装置(2)的数据采集同步。

2.如权利要求1所述的基于量子统计的光学成像装置，其特征在于，所述单光子计数统计装置(2)包括两个单光子探测器(D1、D2)、一个延时器(DL)、一个光子符合计数装置(TAC)和一个多通道分析仪(MCA)，

所述两个单光子探测器(D1、D2)根据输入的荧光信号分别产生两个单光子计数信号；

所述光子符合计数装置(TAC)用于根据上述两个单光子计数信号产生双光子符合计数信号和时间幅度转换信号。

3.如权利要求2所述的基于量子统计的光学成像装置，其特征在于，所述光子符合计数装置(TAC)包括两个输入端和两个输出端，两个输入端分别用于输入由所述两个单光子探测器(D1、D2)产生的单光子计数信号，其中一个输入端与所述单光子探测器之间具有一个延时装置(DL)，两个输出端分别用于输出时间幅度转换信号和双光子符合计数信号。

4.如权利要求3所述的基于量子统计的光学成像装置，其特征在于，所述延时装置(DL)是加长的信号线。

5.如权利要求2所述的基于量子统计的光学成像装置，其特征在于，所述时间幅度转换信号输出到多通道分析仪(MCA)中，所述多通道分析仪(MCA)用于对多个时间幅度转换信号进行统计，得到双光子符合计数信号的强度与所述两个单光子计数信号之间的时间间隔的关系，以确定双光子符合计数的零点位置。

6.一种基于量子统计的光学成像方法，其特征在于，包括如下步骤：

将激光照射到样品上；

对样品上发射的荧光进行单光子计数，产生多个单光子计数信号；

根据所述多个单光子计数信号产生多光子符合计数信号；

对多光子符合计数信号和多个单光子计数信号的强度图像进行处理，获得分辨率小于瑞利极限的样品图像。

7.如权利要求6所述的基于量子统计的光学成像方法，其特征在于，所述多光子符合计数信号包括：N个光子的符合计数信号、N-1个光子的符合计数信号、……、2个光子的符合计数信号，其中N为发光点的个数。

8.如权利要求6所述的基于量子统计的光学成像方法，其特征在于，

使用公式来计算所述样品上两个点A、B的光强I_A和I_B，其中I₁为两个单光子计算信号强度之和，I₂为双光子符合计数信号强度。

9.如权利要求6所述的基于量子统计的光学成像方法，其特征在于，所述多光子符合计数的取样窗口宽度设置为小于荧光寿命的5倍。

10.如权利要求9所述的基于量子统计的光学成像方法，其特征在于，所述多光子符合计数的取样窗口宽度为2ns。