CN102830102A

CN102830102A - 基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法和装置

Info

Publication number: CN102830102A
Application number: CN2012102971896A
Authority: CN
Inventors: 匡翠方; 郝翔; 李旸晖; 顾兆泰; 李帅; 刘旭
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-08-21
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2032-08-21
Also published as: CN102830102B

Abstract

本发明公开了一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，包括以下步骤：1)激光光束经位相编码后转换为圆偏振光；2)将所述圆偏振光通过显微物镜聚焦到待测样品上形成空心聚焦光斑并激发荧光；3)对所述待测样品的表面进行扫描并收集激发荧光，获取不同位置的光强度信息，并计算得到相应的显微图像。本发明还公开了一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微装置。本发明的显微方法和装置可以实现更高的系统极限分辨率；且系统改动小，结构简单；成像速度与原有共聚焦系统相当。

Description

基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法和装置

技术领域

本发明涉及显微镜领域，尤其涉及一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法和装置。

背景技术

与绝大部分光学成像一样，自从显微镜被发明以来，阿贝衍射极限也一直制约着显微系统分辨率的提高。早期的显微系统均为宽场成像系统，成像分辨能力有限。这一情况直到共聚焦显微系统(Confocal Microscope)发明后才得到一定的改善。

共聚焦显微的基本概念在1957年由M.Minsky等人提出【M.Minsky等Microscopy Apparatus，美国专利3013467】，但直到1978年该技术才真正得以仪器化【C.Cremer等Considerations on a laser-scanning-microscopewith high resolution and depth of field】。

激光共聚焦扫描显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

与传统的宽场显微系统相比，共聚焦显微系统采用扫描成像的方式，在与成像物面共轭的焦平面上放置一个针孔(Pinhole)对非成像点周围的杂散光进行遮挡，从而有效地限制了系统的有效点扩散函数。通过系统的光学传递函数分析可以证明，使用共聚焦方法，能够在系统的极限分辨率提高约1.4倍。

一般而言，常规的光束通过显微物镜聚焦后，将在焦平面上产生一个有限尺度的实心聚焦光斑，而聚焦光斑的大小将直接决定共聚集显微系统的分辨能力。受制于工作波长、数值孔径等因素的限制，共聚焦显微系统的极限分辨能力一般不超过150纳米。

发明内容

本发明提供了一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，以进一步改善共聚焦显微系统的分辨能力。

一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，包括以下步骤：

1)激光光束经位相编码后转换为圆偏振光；

2)将所述圆偏振光通过显微物镜聚焦到待测样品上形成聚焦光斑并激发荧光；

3)对所述待测样品的表面进行扫描并收集激发荧光，获取不同位置的光强度信息，并计算得到相应的显微图像。

作为优选，所述步骤1)中的位相编码为0～2π涡旋位相编码。

0～2π涡旋位相编码是指对于一个横截面中心对称的圆形入射光束，以光束中心点为圆心，对横截面内的光束产生0～2π的涡旋位相延迟，位相延迟量仅与截面内特定点的角向大小有关，而与该点到到圆心的距离无关。可用如下公式加以表示：

其中Δα为位相延迟量，为角向大小。

作为优选，所述显微物镜的数值孔径NA＝0.95～1.4。

作为优选，对所述步骤3)的光强度信息进行反卷积运算。反卷积运算是指信号处理中通过测量输出和已知输入重构未知输入的过程，可选用的具体运算方法包括Bussgang算法、似然估计算法、状态空间模型法等。

作为优选，所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

本发明还提供了一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微装置，包括激光器和放置待测样品的样品台，沿所述激光器的光路依次布置的位相编码器、偏振态转换器和用于将光束聚焦到所述待测样品上的显微物镜，所述待测样品发出的激发荧光被显微物镜收集；并设有探测所述显微物镜收集的激发荧光的光强度信息的探测成像系统。

其中，所述的激光器为能发射波长为380～780nm内任意波长的可见单色光的激光器，优选波长由所观察荧光样品的荧光吸收与发射光谱决定。激光器出射偏振态为线偏振，且为准直光。

其中，所述的位相编码器在现有技术条件下可以有多种选择，如位相板(Phase Plate，PP)、空间光调制器(Spatial Light Modulator，SLM)等，优选为位相板。

所述探测成像系统包括：

用于将所述显微物镜收集的激发荧光进行聚焦的凸透镜；

位于所述激发荧光聚焦的焦点处并用于遮挡理想焦点外荧光散射噪声的针孔；

用于感应穿过所述针孔光强度信号的光电感应器件；

用于集成控制并进行反卷积运算的计算机。

其中，显微物镜、凸透镜、针孔和光电感应器件位于同轴光路上，且所述显微物镜和凸透镜之间设有二色片；所述的二色片，对于荧光样品的荧光吸收光谱波长(即入射光束波长)起反射作用，而对于荧光样品的荧光发射光谱波长起透射作用。

其中，所述的凸透镜为100～400mm焦距的凸透镜，凸透镜的口径应大于所选大数值孔径显微物镜的出瞳。

其中，所述的光电感应器件在现有技术条件下可以有多种选择，如光电池、光电二极管、光电倍增管、雪崩式光电管、电子倍增式电荷耦合器件(Electron Multiplying Charge-Coupled Device，EM-CCD)等，为保证系统信嗓比，优选为光电倍增管或雪崩式光电管。

所述偏振态转换器由沿所述激光器的光路依次布置的二分之一玻片与四分之一玻片组成。

偏振态转换器在现有技术条件下可以有多种选择，优选为二分之一玻片与四分之一玻片组合而成，工作波长由入射光束中心波长决定。

所述显微物镜应为浸没式显微物镜，其浸没液为折射率为1.518的浸没油。

当数值孔径NA＞1时，所述的大数值孔径显微物镜应为浸没式，优选浸没液为折射率为1.518的浸没油。显微物镜放大率为60～100倍，优选为100倍。

所述样品台为二维移动平台，所述偏振态转换器与显微物镜之间设有二维扫描振镜。

二维移动平台和二维扫描振镜组成对待测样品进行扫描的扫描器，扫描器还可以单独采用二维移动平台或二维扫描振镜；为保证扫描速度，本发明采用二维移动平台和二维扫描振镜的组合结构。

本发明的工作原理如下：

对于孔径显微物镜来说，任意平行光入射后所得到的聚焦光斑都可以通过Debye公式进行精确计算。通常情况下所得到的聚焦光斑均为类高斯分布的实心弥散斑。但当经过0～2π涡旋位相编码的圆偏振光经过显微物镜聚焦后，其光能量会被从理想焦点挤压至周围区域，从而在焦平面上得到一个空心聚焦光斑。

对于共聚焦显微系统而言，系统的点扩散函数(Point Spread Function，PSF)可以由如下公式表示：

PSF = h_{e} \cdot (h_{f} &CircleTimes; P);

其中h_e和h_f分别为激发光和荧光发射的光强分布，而P为针孔的通带函数。当h_e为空心分布而其余两项不变时，系统的PSF也会变为与h_e类似的空心分布。由于系统PSF的傅里叶变换即为系统的光学传递函数(Optical Transfer Function，OTF)，而OTF的截止频率大小与系统的极限分辨率呈倒数相关。由于空心分布PSF所对应的OTF，其截止频率大于传统的实心分布PSF所对应的OTF，因此可以认为使用空心聚焦光斑激发后，系统的OTF得到扩展，从而能够获得比传统共聚焦显微系统更高的极限分辨能力。

但是，由于基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微系统所对应的PSF亦为空心分布，因此直接使用上述方法得到的图像也将呈现环状弥散，为了还原得到所需要的真实图像，还需要对直接得到的信息进行反卷积计算，最终即可得到与传统方法类似、但分辨率更高的荧光显微图像。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)更高的系统极限分辨率；

(2)系统改动小，结构简单；

(3)成像速度与原有共聚焦系统相当。

附图说明

图1为本发明的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微装置示意图。

图2为本发明的涡旋位相编码示意图。

图3为本发明的空心聚焦光斑和传统的实心聚集光斑光强分布图。

图4为本发明系统点扩散函数(PSF)一维曲线图。

图5为本发明系统光学扩展函数(OTF)一维曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示为本发明的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微装置，包括：

激光器1，位相编码器2，偏振态转换器3，显微物镜4，二色片5，凸透镜6，针孔7，光电感应器件8，计算机9，二维移动平台10，荧光样品11，二维扫描振镜12。

激光器1发出的激光，经过激光器1内部的线性起偏、光束准直和单色滤光后成为系统入射光束，光束中心波长由荧光样品11的荧光吸收光谱决定。入射光束经过位相编码器2后将被进行涡旋位相编码，如图2所示，即以光束中心点为圆心，对横截面内的光束产生0～2π的涡旋位相延迟，位相延迟量仅与截面内特定点的角向大小有关，可以用如下公式表示：

其中Δα为位相延迟量，

为角向大小。位相编码器2在现有技术条件下可以有多种选择，如位相板(Phase Plate，PP)、空间光调制器(Spatial LightModulator，SLM)等，考虑到整个系统搭建成本，优选为位相板。

经过位相编码的入射光束将进一步通过偏振态转换器3转变为圆偏振光。偏振态转换器3在现有技术条件下也可以有多种选择，其中最为简单的方式是依次通过一个二分之一玻片a和一个四分之一玻片b的组合方式。其中，二分之一玻片a的主要作用是对入射光束的偏振方向进行调节，使其与四分之一玻片b快轴方向呈45°夹角。四分之一玻片b的主要作用是将入射光束起偏并最终生成圆偏振光。

圆偏振光通过二色片5折转光路后，将通过一个显微物镜4聚焦在荧光样品11上。所述的显微物镜4的数值孔径NA＝0.95～1.4，优选为NA＝1.4。当数值孔径NA＞1时，本发明采用的显微物镜应为浸没式显微物镜，优选浸没液为折射率为1.518的浸没油。显微物镜放大率为60～100倍，优选为100倍。在该种情况下，需要考虑入射光束的性质，如偏振态、位相、光强分布等光束矢量特性对于最终聚焦光斑的影响，可以用Debye公式进行计算：

式中，

是以理想焦点位置为原点的柱坐标系，C为归一化常数，A₁为入射光束光强分布参数，A₂为显微物镜4结构参数，i为虚数单位，

是以理想焦点位置为原点的球坐标系，k为光波波数，n为系统物方折射率。由上述公式可以计算得出，经过0～2π涡旋位相编码的圆偏振光，其光能量会被从理想焦点挤压至周围区域，从而在焦平面上得到一个空心聚焦光斑，如图3所示。

该空心聚焦光斑照射在荧光样品11上后，将与传统的实心聚焦光斑(如图3所示)一样激发荧光，所得到的荧光信号将被显微物镜4收集后反向平行传输。将照射到二色片5上时，由于二色片5本身的光学性质，荧光信号将透射过二色片5并被凸透镜6聚焦到针孔7上。为保证荧光收集率，凸透镜6一般为100～400mm焦距的凸透镜，且凸透镜6的口径应大于显微物镜4的出瞳。针孔7有限的小孔尺度将对荧光信号产生滤波作用，遮挡理想焦点外荧光散射噪声对于成像质量的影响，最终使剩余的荧光信号被光电感应器件8转换为电信号。光电感应器件8在现有技术条件下可以有多种选择，如光电池、光电二极管、光电倍增管、雪崩式光电管、电子倍增式电荷耦合器件(Electron Multiplying Charge-Coupled Device，EM-CCD)等，为保证系统信嗓比，优选为光电倍增管或雪崩式光电管。至此，系统的点扩散函数(Point Spread Function，PSF)可以表示为：

PSF = h_{e} \cdot (h_{f} &CircleTimes; P);

其中h_e和h_f分别为激发光和荧光发射的光强分布，而P为针孔的通带函数。当h_e为空心分布而其余两项不变时，系统的PSF也会变为与h_e类似的空心分布。而系统PSF的傅里叶变换即为系统的光学传递函数(OpticalTransfer Function，OTF)，即

OTF＝∫PSF·e^i2πuxdx；

其中u为光学坐标，i为虚数单位。

由上述两式可根据图3中本发明的空心聚焦光斑和传统的实心聚集光斑光强分布图分别计算相应的系统PSF和OTF，所得结果分别如图4和图5所示。从图5可以看出，本发明最终所得的系统OTF，其截止频率将比传统的基于实心聚焦大约20％。而OTF的截止频率大小与系统的极限分辨率呈倒数相关。这意味着，使用空心聚焦光斑激发后，系统的OTF得到扩展，从而能够获得比传统共聚焦显微系统更高的极限分辨能力。传统的共聚焦显微系统的极限分辨率可以由经验公式

(式中λ为光波小长，NA为显微物镜4数值孔径)表示，因此，本发明所述的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法和装置，其极限分辨率可以表示为：

(式中λ为光波小长，NA为显微物镜4数值孔径)，比传统方式缩小约20％。

但是，由图4可以看出，本发明的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法和装置的系统PSF也为空心分布，因此直接使用上述方法得到的图像也将呈现环状弥散，为了还原得到所需要的真实图像，还需要使用计算机9对直接得到的信息进行反卷积计算，最终即可得到与传统方法类似、但分辨率更高的荧光显微图像。而由于共聚焦显微系统采用逐点扫描方式成像，为得到荧光样品11上相关区域的图像，需要在原有光路的基础上加入扫描器才可以使整套共聚焦显微系统具备完整的功能。扫描器在现有技术条件下可以有多种选择，可以为二维移动平台10或二维扫描振镜12，也可以为二者的组合结构，为保证扫描速度，优选为组合结构。二维移动平台10带动荧光样品11进行蛇形或者Z字形扫描；而二维扫描振镜12则位于偏振态转换器3和二色片5之间。

在上述基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微装置中，激光器1、位相编码器2和偏振态转换器3处于同一光轴上，显微物镜4、二色片5、凸透镜6、针孔7，光电感应器件8和荧光样品11位于同轴光路上，针孔7，光电感应器件8和所观察荧光样品11观察面处于光学共轭位置。

Claims

1.一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)激光光束经位相编码后转换为圆偏振光；

2)将所述圆偏振光通过显微物镜聚焦到待测样品上形成空心聚焦光斑并激发荧光；

2.如权利要求1所述的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，其特征在于，所述步骤1)中的位相编码为0～2π涡旋位相编码。

3.如权利要求2所述的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，其特征在于，所述显微物镜的数值孔径NA＝0.95～1.4。

4.如权利要求3所述的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，其特征在于，所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

5.如权利要求1所述的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，其特征在于，对所述步骤3)的光强度信息进行反卷积运算。

6.一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微装置，包括激光器和放置待测样品的样品台，其特征在于，还包括：沿所述激光器的光路依次布置的位相编码器、偏振态转换器和用于将光束聚焦到所述待测样品上的显微物镜，所述待测样品发出的激发荧光被显微物镜收集；并设有探测所述显微物镜收集的激发荧光的光强度信息的探测成像系统。

7.如权利要求6所述的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微装置，其特征在于，所述探测成像系统包括：

用于将所述显微物镜收集的激发荧光进行聚焦的凸透镜；

用于感应穿过所述针孔光强度信号的光电感应器件；

用于集成控制并进行反卷积运算的计算机。

8.如权利要求7所述的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微装置，其特征在于，所述偏振态转换器由沿所述激光器的光路依次布置的二分之一玻片和四分之一玻片组成。

9.如权利要求7所述的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微装置，其特征在于，所述显微物镜应为浸没式显微物镜，其浸没液为折射率为1.518的浸没油。

10.如权利要求7所述的基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微装置，其特征在于，所述样品台为二维移动平台，所述偏振态转换器与显微物镜之间设有二维扫描振镜。