WO2022241672A1 - 共聚焦扫描式暗场显微成像方法与装置 - Google Patents
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Abstract
一种共聚焦扫描式暗场显微成像方法与装置，将激光器发出的激光光束的相位调制成0-2nπ涡旋相位，其中n＞3；将调制后的光束与共聚焦扫描显微镜的物镜入瞳共轭，使得物镜的聚焦光斑为空心光斑，且空心光斑内环半径大于不进行相位调制时的实心光斑半径；使共聚焦扫描显微镜工作，实现暗场显微成像。通过采用共聚焦设计，在探测器前放置一个小孔，小孔所在平面与物面共轭，阻挡了离焦信号进入探测器，提高了成像的信噪比和分辨率，使暗场显微成像具有良好的层析能力。
Description
本发明涉及光学显微成像领域，具体地说，涉及一种共聚焦扫描式暗场显微成像方法与装置。
暗场显微镜是一种基于光学丁达尔效应的显微技术。照明光通过装载环形光阑的聚光镜，形成中空环形光锥。因为物镜的数值孔径小于聚光镜的数值孔径，样品的透射光无法通过物镜，只有小角度的散射光被物镜收集。由此形成了暗视野下亮物体的像，提高了成像对比度。在生命科学领域，暗场显微镜用于观察未染色的透明样品；在化学、材料科学领域，使用光谱仪分析暗场显微镜收集的散射光研究材料的散射光谱。
发明内容
本发明提供了一种共聚焦扫描式暗场显微成像方法与装置，本发明与传统的宽场暗场显微镜相比，共聚焦式的设计具有低背景噪声、优秀的层析能力等特点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明一方面提供了一种共聚焦扫描式暗场显微成像方法，该方法包括：
通过调制器将激光器发出的激光光束的相位调制成0-2nπ涡旋相位，其中n＞3；
将调制后的光束与共聚焦扫描显微镜的物镜入瞳共轭，使得物镜的聚焦光斑为空心光斑，且空心光斑内环半径大于不进行相位调制时的实心光斑半径；
使共聚焦扫描显微镜工作，实现暗场显微成像；
所述共聚焦扫描显微镜的工作过程具体为：控制扫描机构使得空心光斑在样品表面扫描；扫描机构可以为扫描振镜或电控移动样品台；样品的反射光经过透镜聚焦在与物共轭的小孔上，反射光被探测器接收，获得暗场照明下的光 强度分布；
所述共聚焦扫描显微镜的点扩散函数PSF
c(x,y)等于由激光器和调制器构成的照明系统的点扩散函数PSF
e(x,y)和由扫描机构、管镜和物镜构成的成像系统的点扩散函数PSF
f(x,y)的乘积与小孔孔阑函数p(x,y)的卷积，公式如下：
对于涡旋光束照明的照明系统，照明系统的点扩散函数为空心光斑，且涡旋光阶数越高，空心光斑的内环半径越大；而成像系统的点扩散函数由物镜的孔阑决定，是实心光斑；对高于3阶的涡旋光照明，空心光斑内环半径大于实心光斑半径，两光斑相互错开，实现了暗场的照明条件。
进一步地，调制相位的具体方法为：
将激光器发出的激光光束准直后用起偏器转为P分量的线偏光入射到液晶空间光调制器；当外加电场超过阈值时，液晶分子出现电控双折射效应，因此，液晶空间光调制器只调制一个方向的线偏光；
调节液晶空间光调制器出射平面与扫描显微镜的物镜入瞳共轭；在液晶空间光调制器上加载0-2nπ涡旋相位。
进一步地，在起偏器后设置二分之一波片，激光光束通过起偏器后再通过一个二分之一波片转为P分量的线偏光，使液晶空间光调制器对该偏振光作纯相位调制；
所述P分量的线偏光入射液晶空间光调制器前使用一个D形镜转折光路，以减小入射角，改善液晶空间光调制器的性能。
进一步地，所述液晶空间光调制器使用泽尼克多项式校正像差，从而改善空心光斑的质量。
进一步地，在物镜前设置四分之一波片，将光束用四分之一波片转为圆偏光后入射到物镜，提高用于扫描样品的空心光斑质量。
本发明另一方面提供了一种共聚焦扫描式暗场显微成像装置，该装置包括激光器、调制器、4f系统和扫描成像模块；所述扫描成像模块包括扫描机构、管镜、物镜、透镜、小孔和探测器；
所述激光器发出的激光光束通过调制器将相位调制成0-2nπ涡旋相位，其中n＞3；
所述4f系统调节调制器的出射平面与物镜入瞳共轭，使得物镜的聚焦光斑为空心光斑，且空心光斑内环半径大于不进行相位调制时的实心光斑半径；
所述扫描机构使得空心光斑在样品表面扫描，样品的反射光经过透镜聚焦在与物共轭的小孔上，反射光被探测器接收，获得暗场照明下的光强度分布；
所述共聚焦扫描式暗场显微成像装置的点扩散函数PSF
c(x,y)等于由激光器、调制器和4f系统构成的照明系统的点扩散函数PSF
e(x,y)和由扫描机构、管镜和物镜构成的成像系统的点扩散函数PSF
f(x,y)的乘积与小孔孔阑函数p(x,y)的卷积，公式如下：
对高于3阶的涡旋光照明，空心光斑内环半径大于实心光斑半径，两光斑相互错开，实现了暗场的照明条件。
进一步地，所述调制器由起偏器和液晶空间光调制器组成；
所述激光器发出的激光光束准直后用起偏器转为P分量的线偏光入射到液晶空间光调制器；
所述4f系统调节液晶空间光调制器的出射平面与物镜入瞳共轭，所述液晶空间光调制器上加载0-2nπ涡旋相位。
进一步地，所述4f系统由透镜1与透镜2组成，透镜1的前焦面与调制器的出射平面重合，透镜1的后焦面与透镜2的前焦面重合，透镜2的后焦面与物镜入瞳共轭。
进一步地，所述扫描机构为扫描振镜，透镜2的后焦面与两面振镜中心连线的中点重合，所述中点与物镜入瞳共轭。
进一步地，所述扫描机构前设置二分之一波片和偏振分束棱镜，通过二分之一波片将光束转为P光，P光完全透过偏振分束棱镜后作为扫描机构入射光；在物镜前设置四分之一波片，通过四分之一波片将P光转为圆偏光后入射物镜，并将样品的反射光转为S光，反射光被偏振分束棱镜反射后聚焦在小孔上。
进一步地，所述小孔用于消除离焦杂散光，采用针孔或多模光纤实现。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：本发明采用了共聚焦的设计，在探测器前放置一个小孔，小孔所在平面与物面共轭，阻挡了离焦信号进入探测器。这种设计提高了成像的信噪比和分辨率，使暗场显微成像具有良好的层析能力。
图1为本发明实施例提供的共聚焦扫描式暗场显微成像方法实现原理图；
图2为本发明实施例提供的共聚焦扫描式暗场显微成像装置示意图；
图3为产生高阶涡旋光束的相位掩膜示意图。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
如图1所示，本发明提供的一种共聚焦扫描式暗场显微成像方法，包括：
通过调制器将激光器发出的激光光束的相位调制成0-2nπ涡旋相位，其中n＞3；
将调制后的光束与共聚焦扫描显微镜的物镜入瞳共轭，使得物镜的聚焦光斑为空心光斑，且空心光斑内环半径大于不进行相位调制时的实心光斑半径；
使共聚焦扫描显微镜工作，实现暗场显微成像；
所述共聚焦扫描显微镜的工作过程具体为：控制扫描机构使得空心光斑在样品表面扫描；扫描机构可以为扫描振镜或电控移动样品台；样品的反射光经过透镜聚焦在与物共轭的小孔上，反射光被探测器接收，获得暗场照明下的光强度分布；
所述共聚焦扫描显微镜的点扩散函数PSF
c(x,y)等于由激光器和调制器构成 的照明系统的点扩散函数PSF
e(x,y)和由扫描机构、管镜和物镜构成的成像系统的点扩散函数PSF
f(x,y)的乘积与小孔孔阑函数p(x,y)的卷积，公式如下：
对于涡旋光束照明的照明系统，照明系统的点扩散函数为空心光斑，且涡旋光阶数越高，空心光斑的内环半径越大；而成像系统的点扩散函数由物镜的孔阑决定，是实心光斑；对高于3阶的涡旋光照明，空心光斑内环半径大于实心光斑半径，两光斑相互错开，实现了暗场的照明条件。
进一步地，调制相位的具体方法为：
将激光器发出的激光光束准直后用起偏器转为P分量的线偏光入射到液晶空间光调制器；当外加电场超过阈值时，液晶分子出现电控双折射效应，因此，液晶空间光调制器只调制一个方向的线偏光；
调节液晶空间光调制器出射平面与扫描显微镜的物镜入瞳共轭；在液晶空间光调制器上加载0-2nπ涡旋相位。
进一步地，在起偏器后设置二分之一波片，激光光束通过起偏器后再通过一个二分之一波片转为P分量的线偏光，使液晶空间光调制器对该偏振光作纯相位调制；
所述P分量的线偏光入射液晶空间光调制器前使用一个D形镜转折光路，以减小入射角，改善液晶空间光调制器的性能。
进一步地，所述液晶空间光调制器使用泽尼克多项式校正像差，从而改善空心光斑的质量。
进一步地，在物镜前设置四分之一波片，将光束用四分之一波片转为圆偏光后入射到物镜，提高用于扫描样品的空心光斑质量。
为实现上述方法，本发明提供的共聚焦扫描式暗场显微成像装置包括：激光器、调制器、4f系统和扫描成像模块；所述扫描成像模块包括扫描机构、管镜、物镜、透镜、小孔和探测器；
所述激光器发出的激光光束通过调制器将相位调制成0-2nπ涡旋相位，其中n＞3；
所述4f系统调节调制器的出射平面与物镜入瞳共轭，使得物镜的聚焦光斑为空心光斑，且空心光斑内环半径大于不进行相位调制时的实心光斑半径；
所述扫描机构使得空心光斑在样品表面扫描，样品的反射光经过透镜聚焦在与物共轭的小孔上，反射光被探测器接收，获得暗场照明下的光强度分布；
所述共聚焦扫描式暗场显微成像装置的点扩散函数PSF
c(x,y)等于由激光器、调制器和4f系统构成的照明系统的点扩散函数PSF
e(x,y)和由扫描机构、管镜和物镜构成的成像系统的点扩散函数PSF
f(x,y)的乘积与小孔孔阑函数p(x,y)的卷积，公式如下：
对高于3阶的涡旋光照明，空心光斑内环半径大于实心光斑半径，两光斑相互错开，实现了暗场的照明条件。
进一步地，所述调制器由起偏器和液晶空间光调制器组成；
所述激光器发出的激光光束准直后用起偏器转为P分量的线偏光入射到液晶空间光调制器；
所述4f系统调节液晶空间光调制器的出射平面与物镜入瞳共轭，所述液晶空间光调制器上加载0-2nπ涡旋相位。
进一步地，所述4f系统由透镜1与透镜2组成，透镜1的前焦面与调制器的出射平面重合，透镜1的后焦面与透镜2的前焦面重合，透镜2的后焦面与物镜入瞳共轭。
进一步地，所述扫描机构为扫描振镜，透镜2的后焦面与两面振镜中心连线的中点重合，所述中点与物镜入瞳共轭。
进一步地，所述扫描机构前设置二分之一波片和偏振分束棱镜，通过二分之一波片将光束转为P光，P光完全透过偏振分束棱镜后作为扫描机构的入射光；在物镜前设置四分之一波片，通过四分之一波片将P光转为圆偏光后入射物镜，并将样品的反射光转为S光，反射光被偏振分束棱镜反射后聚焦在小孔上。小孔用于消除离焦杂散光，采用针孔或多模光纤实现。
以下给出本发明的一个具体实现示例，但不限于此。本示例的共聚焦扫描 式暗场显微成像装置结构如图2所示，包括激光发生和准直装置1、第一D形镜2、起偏器3、第一半波片4、液晶空间光调制器5、第一透镜6、第一反射镜7、第二透镜8、第三透镜9、第四透镜10、第二半波片11、偏振分束棱镜12、第二D形镜13、扫描振镜模块14、第二反射镜15、扫描透镜16、管镜17、1/4波片18、物镜19、样品台20、第三反射镜21、第五透镜22和雪崩二极管23。产生高阶涡旋光束的相位掩膜如图3所示。
装置工作时，激光发生和准直装置1经过第一D形镜2，经过起偏器3后成为线偏光，经过第一半波片4成为P光到达液晶空间光调制器5将线偏光调制成高阶涡旋光。液晶空间光调制器5的出射光依次经过第一透镜6与第二透镜8组成的4f系统，第三透镜9与第四透镜10组成的4f系统，经过第二半波片11成为P光透过偏振分束棱镜12，经过第二D形镜13进入扫描振镜模块14，其中两面振镜中心连线的中点与空间光调制器的出射平面共轭。经过第二反射镜15、扫描透镜16、管镜17，被1/4波片18调成圆偏光，经过物镜19，在样品表面扫描。反射光经过物镜19，被1/4波片18调成S光。反射光依次经过管镜17、扫描透镜16、第二反射镜15、扫描振镜模块14、第二D形镜13，在偏振分束棱镜12处被反射，经过第三反射镜21、第五透镜22聚焦在小孔处，小孔后的雪崩二极管23收集光信号。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何的简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (8)
- 一种共聚焦扫描式暗场显微成像方法，其特征在于，该方法包括：通过调制器将激光器发出的激光光束的相位调制成0-2nπ涡旋相位，其中n＞3；将调制后的光束与共聚焦扫描显微镜的物镜入瞳共轭，使得物镜的聚焦光斑为空心光斑，且空心光斑内环半径大于不进行相位调制时的实心光斑半径；使共聚焦扫描显微镜工作，实现暗场显微成像；所述共聚焦扫描显微镜的工作过程具体为：控制扫描机构使得空心光斑在样品表面扫描；样品的反射光经过透镜聚焦在与物共轭的小孔上，反射光被探测器接收，获得暗场照明下的光强度分布；所述共聚焦扫描显微镜的点扩散函数PSF c(x,y)等于由激光器和调制器构成的照明系统的点扩散函数PSF e(x,y)和由扫描机构、管镜和物镜构成的成像系统的点扩散函数PSF f(x,y)的乘积与小孔孔阑函数p(x,y)的卷积，公式如下：
对于涡旋光束照明的照明系统，照明系统的点扩散函数为空心光斑，且涡旋光阶数越高，空心光斑的内环半径越大；而成像系统的点扩散函数由物镜孔阑决定，是实心光斑；对高于3阶的涡旋光照明，空心光斑内环半径大于实心光斑半径，两光斑相互错开，实现了暗场的照明条件。 - 根据权利要求1所述的一种共聚焦扫描式暗场显微成像方法，其特征在于，调制相位的具体方法为：将激光器发出的激光光束准直后用起偏器转为P分量的线偏光入射到液晶空间光调制器；调节液晶空间光调制器出射平面与共聚焦扫描显微镜的物镜入瞳共轭；在液晶空间光调制器上加载0-2nπ涡旋相位。
- 根据权利要求2所述的一种共聚焦扫描式暗场显微成像方法，其特征在于，在起偏器后设置二分之一波片，激光光束通过起偏器后再通过一个二分之 一波片转为P分量的线偏光，使液晶空间光调制器对该偏振光作纯相位调制；所述P分量的线偏光入射液晶空间光调制器前使用一个D形镜转折光路，以减小入射角，改善液晶空间光调制器的性能。
- 根据权利要求2所述的一种共聚焦扫描式暗场显微成像方法，其特征在于，所述液晶空间光调制器使用泽尼克多项式校正像差，从而改善空心光斑的质量。
- 根据权利要求1所述的一种共聚焦扫描式暗场显微成像方法，其特征在于，在物镜前设置四分之一波片，将光束用四分之一波片转为圆偏光后入射到物镜，提高用于扫描样品的空心光斑质量。
- 一种共聚焦扫描式暗场显微成像装置，其特征在于，该装置包括激光器、调制器、4f系统和扫描成像模块；所述扫描成像模块包括扫描机构、管镜、物镜、透镜、小孔和探测器；所述激光器发出的激光光束通过调制器将相位调制成0-2nπ涡旋相位，其中n＞3；所述4f系统调节调制器的出射平面与物镜入瞳共轭，使得物镜的聚焦光斑为空心光斑，且空心光斑内环半径大于不进行相位调制时的实心光斑半径；所述扫描机构使得空心光斑在样品表面扫描，样品的反射光经过透镜聚焦在与物共轭的小孔上，反射光被探测器接收，获得暗场照明下的光强度分布；所述共聚焦扫描式暗场显微成像装置的点扩散函数PSF c(x,y)等于由激光器、调制器和4f系统构成的照明系统的点扩散函数PSF e(x,y)和由扫描机构、管镜和物镜构成的成像系统的点扩散函数PSF f(x,y)的乘积与小孔孔阑函数p(x,y)的卷积，公式如下：
对高于3阶的涡旋光照明，空心光斑内环半径大于实心光斑半径，两光斑相互错开，实现了暗场的照明条件。 - 根据权利要求6所述的一种共聚焦扫描式暗场显微成像装置，其特征在于，所述调制器由起偏器和液晶空间光调制器组成；所述激光器发出的激光光束准直后用起偏器转为P分量的线偏光入射到液晶空间光调制器；所述4f系统调节液晶空间光调制器的出射平面与物镜入瞳共轭，所述液晶空间光调制器上加载0-2nπ涡旋相位。
- 根据权利要求6所述的一种共聚焦扫描式暗场显微成像装置，其特征在于，所述扫描机构前设置二分之一波片和偏振分束棱镜，通过二分之一波片将光束转为P光，P光完全透过偏振分束棱镜后作为扫描机构的入射光；在物镜前设置四分之一波片，通过四分之一波片将P光转为圆偏光后入射物镜，并将样品的反射光转为S光，反射光被偏振分束棱镜反射后聚焦在小孔上。
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| WO (1) | WO2022241672A1 (zh) |
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