CN111208634B - 基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法，该装置不需要荧光染色即可实现超分辨成像，可以更加真实观测样品动态；无类似荧光成像的漂白特性，可以长时间成像；通过软件控制二维扫描振镜实现透射照明和倏逝场照明方式的切换，不需要对光学系统元件进行调整，装调简单，结构紧凑，可操作性强；利用圆锥反射镜实现了对样品的全方位角照明，能够对任意照明方向的光线进行反射，同时由于反射镜光能损失小的特点，大大提高了照明的光能利用率，使得装置对照明激光的功率要求降低，更加节能环保。

Description

基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法

技术领域

本发明涉及显微成像技术领域，更具体的说是涉及一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法。

背景技术

目前，在常规超分辨显微镜中，通常需要荧光标记，传统的荧光超分辨显微技术是利用荧光颗粒的非线性效应而将距离很近的结构分辨开来，达到超分辨的效果。基于荧光标记样品的超分辨成像方法对荧光颗粒和成像样品都有着较为严格的要求，普适性不强，标记样本由于其光漂白特性无法长时间成像，且易引起生物体排异反应，影响生物特性运动影响理论研究。

相比而言，非荧光标记的超分辨显微方法在活体成像、多类样品成像和快速成像等方面具有天然的优势。但是，该方法需要克服光学中衍射极限的根本性物理瓶颈，故发展非常缓慢，且现有的非荧光标记超分辨显微技术实时性差、视场狭窄，并不能很好的解决荧光超分辨显微技术普适性差、成像时间短等问题。

因此，如何提供一种无需荧光标记即可实现超分辨成像的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法，不需要荧光染色即可实现超分辨成像，可以更加真实观测样品动态，无类似荧光成像的漂白特性，可以长时间成像，且可以实现全方位角照明，装置对照明激光的功率要求降低，更加节能环保。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置，包括：偏振照明模块、光束扫描模块以及检偏探测模块，所述偏振照明模块、光束扫描模块和检偏探测模块沿光线传播方向依次布置；

所述偏振照明模块沿光线传播方向依次设有激光器、第一偏振片以及四分之一玻片；

所述光束扫描模块沿光线传播方向依次设有二维扫描振镜、扫描透镜、第一管镜、激光扩束镜、圆锥反射镜以及圆锥透镜，所述扫描透镜的工作面置于所述第一管镜的前焦面位置，经所述圆锥反射镜反射的光线与所述圆锥透镜的入射面垂直；

所述检偏探测模块沿光线传播方向依次设有物镜、第二偏振片、第二管镜以及相机。

进一步地，所述圆锥反射镜为中空环形，所述圆锥反射镜的中心与光轴重合。

另一方面，本发明还提供了一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像方法，该方法包括：

步骤1：使用上述的成像装置进行照明光束扫描，在成像装置中的二维扫描振镜为无偏转状态下，即入射角θ_i＝0°时，获取垂直入射下待测样品透射光强分布图像；

步骤2：改变二维扫描振镜的偏转状态，获得某一入射角θ_i＝θ_p下的透射光场光强分布图像；

步骤3：控制二维扫描振镜，对样品进行360°圆周扫描，获得某一入射角θ_p下的不同照明方位角的透射光场光强分布图像集；

步骤4：继续改变二维扫描振镜的偏转状态，获得不同入射角θ_i以及不同照明方位角α_j下待测样品的透射光场光强分布图像集；

步骤5：继续改变二维扫描振镜的偏转状态，使得入射角θ_i大于全内反射临界角，控制二维扫描振镜对样品进行360°圆周扫描，获得倏逝场照明下不同照明方位角的散射光强分布图像集；

步骤6：应用傅里叶叠层成像算法进行频谱合成迭代求解，计算出待测样品的高分辨率复振幅最优解，得到高分辨率待测样品图像。

进一步地，所述步骤1具体包括：

步骤101：激光器发出的平行激光光束，经过第一偏振片和四分之一玻片后形成圆偏振光束；

步骤102：设置二维扫描振镜为无偏转状态，圆偏振光束经过二维扫描振镜反射后，通过扫描透镜聚焦至第一管镜的前焦面处，依次通过第一管镜、激光扩束镜生成平行光；

步骤103：通过圆锥透镜后以0°入射角照明样品，携带待测样品信息的透射光通过物镜、第二偏振片和第二管镜后被相机接收，获得垂直入射下待测样品透射光强分布图像。

具体地，步骤2的实现过程为：改变二维扫描振镜的偏转状态，使得平行光束经过二维扫描振镜反射后偏离中心位置，此时光束通过扫描透镜聚焦至第一管镜前焦面处，发出平行光入射到圆锥反射镜上，经圆锥反射镜反射的平行光束进入圆锥透镜，当入射角θ_i小于全内反射临界角θ_c时不会发生全内反射，光束通过圆锥透镜后倾斜照明样品，样品经过倾斜照明后所产生的透射光通过物镜、第二偏振片和第二管镜后被相机接收。

进一步地，所述步骤3具体包括：

步骤301：控制二维扫描振镜，使照明光束在指定半径的圆周上移动；

步骤302：每移动一次，相机拍摄一次图像，每次移动360°/N；

步骤303：扫描一圈后得到透射光场光强分布图像集：

{I(θ_p，α_j)，j＝1,2,3,…,N}

其中，θ_p为当前二维扫描振镜的偏转状态下的入射角，α_j为360°圆周扫描过程中的不同方位角。

进一步地，所述步骤4具体包括：

步骤401：改变二维扫描振镜的偏转状态，使入射角θ_i以相同角度间隔增加M次；

步骤402：每改变一次入射角度θ_i，重复一次步骤3的操作，得到M×N张倾斜入射下待测样品透射光强分布图像集：

{I(θ_i，α_j)，i＝1,2,3,…,M，j＝1,2,3,…,N}

其中，θ_i为二维扫描振镜调整过程中的不同的入射角，α_j为360°圆周扫描过程中不同的方位角。

进一步地，所述步骤5具体包括：

步骤501：继续改变二维扫描振镜的偏转状态，使得入射角θ_i大于全内反射临界角，此时光束通过扫描透镜聚焦至第一管镜前焦面处，发出的平行光入射到圆锥反射镜上，经圆锥反射镜反射出的平行光束进入圆锥透镜，并在圆锥透镜与样品交界面处产生倏逝场；

步骤502：样品经过倏逝场照明后所产生的散射光通过物镜、第二偏振片和第二管镜后被相机接收；

步骤503：控制二维扫描振镜使照明光束在指定半径的圆周上移动，每移动一次，相机拍摄一次图像，每次移动360°/N；

步骤504：扫描一圈后得到N张倏逝场照明下不同照明方位角的散射光强分布图像集：

{E(α_j)，j＝1,2,3,…,N}

式中，α_j为360°圆周扫描过程中的不同方位角，N为图像总张数。

进一步地，所述全内反射临界角的计算公式为：

θ_c＝arcsin(n)

式中，n为圆锥透镜折射率，θ_c为全内反射临界角。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法，该装置不需要荧光染色即可实现超分辨成像，可以更加真实观测样品动态；无类似荧光成像的漂白特性，可以长时间成像；通过软件控制二维扫描振镜实现透射照明和倏逝场照明方式的切换，不需要对光学系统元件进行调整，装调简单，结构紧凑，可操作性强；利用圆锥反射镜实现了对样品的全方位角照明，能够对任意照明方向的光线进行反射，同时由于反射镜光能损失小的特点，大大提高了照明的光能利用率，使得装置对照明激光的功率要求降低，更加节能环保。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置的结构示意图；

图2附图为本发明提供的一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像方法的流程示意图；

图3附图为本发明实施例中频谱合成示意图。

图中：1、激光器，2、第一偏振片，3、四分之一玻片，4、二维扫描振镜，5、扫描透镜，6、第一管镜，7、激光扩束镜，8、圆锥反射镜，9、圆锥透镜，10、样品，11、物镜，12、第二偏振片，13、第二管镜，14、相机。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一方面，参见附图1，本发明实施例公开了一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置，包括：偏振照明模块、光束扫描模块以及检偏探测模块，偏振照明模块、光束扫描模块和检偏探测模块沿光线传播方向依次布置；

偏振照明模块沿光线传播方向依次设有激光器1、第一偏振片2以及四分之一玻片3；

光束扫描模块沿光线传播方向依次设有二维扫描振镜4、扫描透镜5、第一管镜6、激光扩束镜7、圆锥反射镜8以及圆锥透镜9，扫描透镜5的工作面置于第一管镜6的前焦面位置，经圆锥反射镜8反射的光线与圆锥透镜9的入射面垂直；

检偏探测模块沿光线传播方向依次设有物镜11、第二偏振片12、第二管镜13以及相机14。

在一个具体的实施例中，所述圆锥反射镜8为中空环形，所述圆锥反射镜8的中心与光轴重合。

在本实施例中，从第一管镜6出射的平行照明光束直径应足够小，使得其经过圆锥反射镜8反射后可以近似等效为垂直入射圆锥透镜9。

在本实施例中，不同角度的平行照明光束经过圆锥反射镜8反射，入射到圆锥透镜9后，与光学系统主光轴夹角θ_i也就是本实施例中提到的入射角应是可变的，即照明光束应以不同入射角θ_i照射样品10。

另一方面，参见附图2，本发明还提供了一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像方法，该方法包括：

S1：使用上述的成像装置进行照明光束扫描，在成像装置中的二维扫描振镜为无偏转状态下，即入射角θ_i＝0°时，获取垂直入射下待测样品透射光强分布图像；

S2：改变二维扫描振镜的偏转状态，获得某一入射角θ_i＝θ_p下的透射光场光强分布图像；

S3：控制二维扫描振镜，对样品进行360°圆周扫描，获得入射角θ_p下不同照明方位角下的透射光场光强分布图像集；

S4：继续改变二维扫描振镜的偏转状态，获得不同入射角θ_i以及不同照明方位角下待测样品的透射光场光强分布图像集；

S5：继续改变二维扫描振镜的偏转状态，使得入射角θ_i大于全内反射临界角，控制二维扫描振镜对样品进行360°圆周扫描，获得倏逝场照明下不同照明方位角的散射光强分布图像集；

S6：将以上步骤S1、S4、S5得到的(M+1)×N+1张图像进行光强归一化以及去噪处理，应用傅里叶叠层成像算法进行频谱合成，频谱合成示意图如附图3所示，通过迭代求解，计算出待测样品的高分辨率复振幅最优解，得到高分辨率待测样品图像。

在一个具体的实施例中，步骤S1具体包括：

S101：激光器1所发平行激光光束，经过偏振片2和四分之一玻片3之后形成圆偏振光束；

S102：设置二维扫描振镜4为无偏转状态，光束经过二维扫描振镜4反射，通过扫描透镜5聚焦至第一管镜6前焦面处，依次通过第一管镜6、激光扩束镜7生成平行光，通过圆锥透镜9后以0°入射角照明样品10。

S103：携带待测样品信息的透射光通过物镜11、第二偏振片12和第二管镜13后被相机14接收，获得垂直入射下待测样品透射光强分布图像T。光束路线如图1实线所示。

具体地，步骤S2的实现过程为：改变二维扫描振镜4的偏转状态，使得平行光束经过二维扫描振镜4反射后偏离中心位置，此时光束通过扫描透镜5聚焦至第一管镜6前焦面处，发出平行光入射到圆锥反射镜8上，反射出小角度平行光束进入圆锥透镜9，当θ_i小于全内反射临界角θ_c时不会发生全内反射，光束通过圆锥透镜9后倾斜照明样品10。样品10经过倾斜照明后所产生的透射光通过物镜11、偏振片二12和管镜二13后被相机14接收。

在一个具体的实施例中，步骤S3具体包括：

S301：控制二维扫描振镜4，使照明光束在指定半径的圆周上移动；

S302：每移动一次，相机拍摄一次图像，每次移动360°/N；

S303：扫描一圈后得到透射光场光强分布图像集：

{I(θ_p，α_j)，j＝1,2,3,…,N}

其中，θ_p为当前二维扫描振镜4的偏转状态下的入射角，α_j为360°圆周扫描过程中的不同方位角。

在一个具体的实施例中，步骤S4具体包括：

S401：改变二维扫描振镜4的偏转状态，使入射角θ_i以相同角度间隔增加M次；

S402：每改变一次入射角度θ_i，重复一次步骤3的操作，得到M×N张倾斜入射下待测样品透射光强分布图像集：

{I(θ_i，α_j)，i＝1,2,3,…,M，j＝1,2,3,…,N}

其中，θ_i为二维扫描振镜调整过程中的不同的入射角，α_j为360°圆周扫描过程中不同的方位角。

在一个具体的实施例中，步骤S5具体包括：

S501：继续改变二维扫描振镜4的偏转状态，使得入射角θ_i大于全内反射临界角，此时光束通过扫描透镜5聚焦至第一管镜6的前焦面处，发出的平行光入射到圆锥反射镜8上，经圆锥反射镜8反射出的平行光束进入圆锥透镜9，并在圆锥透镜9与样品10交界面处产生倏逝场；

S502：样品10经过倏逝场照明后所产生的散射光通过物镜11、第二偏振片12和第二管镜13后被相机14接收；

S503：控制二维扫描振镜4使照明光束在指定半径的圆周上移动，每移动一次，相机拍摄一次图像，每次移动360°/N；

S504：扫描一圈后得到N张倏逝场照明下不同照明方位角的散射光强分布图像集：

{E(α_j)，j＝1,2,3,…,N}

式中，α_j为360°圆周扫描过程中的不同方位角，N为图像总张数。

具体地，全内反射临界角的计算公式为：

θ_c＝arcsin(n)

式中，n为圆锥透镜折射率，θ_c为全内反射临界角。

在本实施例中，图3所示的频谱合成示意图中，最外层细实线部分代表倏逝场照明方式下，样品的高频频谱部分；次外圈粗实线和最内层的虚线部分分别是透射照明照明方式下，样品的中频和低频频谱部分。

综上所述，本发明实施例公开的基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法，与现有技术相比，具有如下优点：

1、对观测生命体无除光照外，例如染色等干预，可以更加真实观测样品动态。

2、无类似荧光成像的漂白特性，可以长时间成像。

3、通过软件控制二维扫描振镜实现透射照明和倏逝场照明方式的切换，不需要对光学系统元件进行调整，装调简单，结构紧凑，提高了系统的可操作。

4、利用圆锥反射镜实现了传统技术途径中较难实现的对样品的全方位角照明，能够对任意照明方向的光线进行反射，同时由于反射镜光能损失小的特点，大大提高了照明的光能利用率，使得系统对照明激光的功率要求降低。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，该方法基于一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置，包括：偏振照明模块、光束扫描模块以及检偏探测模块，所述偏振照明模块、光束扫描模块和检偏探测模块沿光线传播方向依次布置；

所述偏振照明模块沿光线传播方向依次设有激光器(1)、第一偏振片(2)以及四分之一玻片(3)；

所述光束扫描模块沿光线传播方向依次设有二维扫描振镜(4)、扫描透镜(5)、第一管镜(6)、激光扩束镜(7)、圆锥反射镜(8)以及圆锥透镜(9)，所述扫描透镜(5)的工作面置于所述第一管镜(6)的前焦面位置，经所述圆锥反射镜(8)反射的光线与所述圆锥透镜(9)的入射面垂直；

所述检偏探测模块沿光线传播方向依次设有物镜(11)、第二偏振片(12)、第二管镜(13)以及相机(14)；

方法包括：

步骤1：使用所述的成像装置进行照明光束扫描，在成像装置中的二维扫描振镜为无偏转状态下，即入射角θ_i＝0°时，获取垂直入射下待测样品透射光场光强分布图像；

步骤2：改变二维扫描振镜的偏转状态，获得某一入射角θ_i＝θ_p下的透射光场光强分布图像；

步骤3：控制二维扫描振镜，对样品进行360°圆周扫描，获得入射角θ_p下的不同照明方位角的透射光场光强分布图像集；

步骤4：继续改变二维扫描振镜的偏转状态，逐次增大入射角θ_i，获得不同入射角θ_i以及不同照明方位角α_j下待测样品的透射光场光强分布图像集；

步骤5：继续改变二维扫描振镜的偏转状态，使得入射角θ_i大于全内反射临界角，控制二维扫描振镜对样品进行360°圆周扫描，获得倏逝场照明下不同照明方位角的散射光场光强分布图像集；

步骤6：应用傅里叶叠层成像算法进行频谱合成迭代求解，计算出待测样品的高分辨率复振幅最优解，得到高分辨率待测样品图像。

2.根据权利要求1所述的一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，所述步骤1具体包括：

步骤101：激光器发出的平行激光光束，经过第一偏振片和四分之一玻片后形成圆偏振光束；

步骤102：设置二维扫描振镜为无偏转状态，圆偏振光束经过二维扫描振镜反射后，通过扫描透镜聚焦至第一管镜的前焦面处，依次通过第一管镜、激光扩束镜生成平行光；

步骤103：通过圆锥透镜后以0°入射角照明样品，携带待测样品信息的透射光通过物镜、第二偏振片和第二管镜后被相机接收，获得垂直入射下待测样品透射光场光强分布图像。

3.根据权利要求1所述的一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，所述步骤3具体包括：

步骤301：控制二维扫描振镜，使照明光束在指定半径的圆周上移动；

步骤302：每移动一次，相机拍摄一次图像，每次移动360°/N；

步骤303：扫描一圈后得到透射光场光强分布图像集：

{I(θ_p，α_j)，j＝1,2,3,…,N}

其中，θ_p为当前二维扫描振镜的偏转状态下的入射角，α_j为360°圆周扫描过程中的不同照明方位角，N为图像总张数。

4.根据权利要求3所述的一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，所述步骤4具体包括：

步骤401：改变二维扫描振镜的偏转状态，使入射角θ_i以相同角度间隔增加M次；

步骤402：每改变一次入射角度θ_i，重复一次步骤3的操作，得到M×N张倾斜入射下待测样品透射光场光强分布图像集：

{I(θ_i，α_j)，i＝1,2,3,…,M，j＝1,2,3,…,N}

其中，θ_i为二维扫描振镜调整过程中的不同的入射角，α_j为360°圆周扫描过程中不同照明方位角。

5.根据权利要求1所述的一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，所述步骤5具体包括：

步骤501：继续改变二维扫描振镜的偏转状态，使得入射角θ_i大于全内反射临界角，此时光束通过扫描透镜聚焦至第一管镜前焦面处，发出的平行光入射到圆锥反射镜上，经圆锥反射镜反射出的平行光束进入圆锥透镜，并在圆锥透镜与样品交界面处产生倏逝场；

步骤502：样品经过倏逝场照明后所产生的散射光通过物镜、第二偏振片和第二管镜后被相机接收；

步骤503：控制二维扫描振镜使照明光束在指定半径的圆周上移动，每移动一次，相机拍摄一次图像，每次移动360°/N；

步骤504：扫描一圈后得到倏逝场照明下不同照明方位角的散射光场光强分布图像集：

{E(α_j)，j＝1,2,3,…,N}

式中，α_j为360°圆周扫描过程中的不同照明方位角，N为图像总张数。

6.根据权利要求5所述的一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，所述全内反射临界角的计算公式为：

θ_c＝arcsin(n)

式中，n为圆锥透镜折射率，θ_c为全内反射临界角。

Images