CN106970461B - 基于椭球面反射镜的全内反射荧光显微成像装置 - Google Patents

Abstract

本发明基于椭球面反射镜的全内反射荧光显微成像装置属于光学显微照明领域；该装置采用了由遮光片调制的环形光，经过照明物镜聚焦后发散，通过椭球面反射镜反射后，光线聚焦在椭球面反射镜第二焦点处，产生了在椭球面第一焦点处的聚焦的大顶角空心锥光束，进而实现了全内反射荧光成像现象；在照明光能量一定的情况下，该装置能够大幅度提高能量利用率，提高照明强度，并且椭球反射镜能够对任意照明方向光线进行反射，产生照明方向0°～360°的照明光线，实现了无阴影照明，并且能够弱化相干光的干涉条纹、增加图像信噪比，使得成像质量得到提高。

Description

基于椭球面反射镜的全内反射荧光显微成像装置

技术领域

本发明基于椭球面反射镜的全内反射荧光显微成像装置属于光学显微成像领域，在生命科学、物理化学和材料科学等研究领域具有广泛应用。

背景技术

随着生命科学领域新机理的发现和材料科学领域新物质的合成，光学显微镜得到了迅猛的发展，一些高精尖技术不断得到了突破。生命科学中大量的事实证明：细胞的动力学特征是起源于单个蛋白质分子的聚合和相互作用。为此，需要大力发展超分辨成像技术，从而在分子尺度上探测细胞各种生命活动的细节，进一步揭示生命活动的过程。目前，国际上公认的最具前途的单分子光学成像技术有全内反射荧光显微术、共聚焦荧光显微术、全场相衬显微术和近场光学扫描显微术。

全内反射荧光显微术(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM)，能够对单个的荧光分子直接地进行探测。在发生全内反射时，限定在表面的一薄层范围内的样品会受到倏逝波照明，荧光也仅在这一薄层范围被激发，因此收集到的荧光图像具有高的信噪比和对比度。棱镜型TIRF是早期的TIRF成像方法。该方法利用棱镜将照明光耦合到接触面来实现全内反射(TIR)，棱镜的几何参数决定了最大入射角度。物镜型TIRF是另一种普及的显微成像技术，它具有结构紧密、操作简单等特点。在这种方法中，大数值孔径(NA)的物镜虽然能够提供大角度照明，但是这种照明仍然是单向的。单方向不对称的照明会不可避免地产生遮挡效应，从而降低图像的对比度和分辨能力。

针对遮挡问题，常用的旋转光楔方法能够将入射光聚焦在物镜后焦面，从而产生空心光锥，实现各方向等同的对称照明，但是入射角的大小不能调整。此外，采用W型反射镜方法也能够实现对称照明，但是入射角的调节范围比较小。

发明内容

在光学显微技术领域和生物单分子成像领域中，针对全内反射荧光成像装置所面临的遮挡问题，本发明设计了一种基于椭球面反射镜的全内反射荧光显微成像装置。该装置充分利用椭球面反射镜双焦点共轭的特殊性质，使得聚焦在椭球面反射镜第二焦点处的环形光经椭球面反射镜反射，产生在椭球面第一焦点处的聚焦的大顶角空心锥光束，进而实现了全内反射荧光成像现象；在照明光能量一定的情况下，该装置能够大幅度提高能量利用率，提高照明强度，并且椭球反射镜能够对任意照明方向光线进行反射，产生照明方向0°～360°的照明光线，实现了无阴影照明，并且能够弱化相干光的干涉条纹、增加图像信噪比，使得成像质量得到提高。

本发明的目的是这样实现的：

椭球面反射镜全内反射显微成像装置，沿光线传播方向依次设置激光器、准直扩束镜、遮挡片、照明物镜、椭球面反射镜、半球透镜、玻璃台、成像物镜、滤光片、管镜和CCD；所述聚焦透镜的焦点与椭球面反射镜的第二焦点位置重合，椭球面反射镜的第一焦点位于的玻璃台上表面；所述半球透镜的回转轴与光轴重合，半球透镜的球心位置处于玻璃台的上表面，半球透镜的上表面与玻璃台的下表面贴合在一起；制作半球透镜材料的折射率不大于制作玻璃台材料的折射率；

从激光器发出的光束，依次经过准直扩束镜和照明物镜透射，椭球面反射镜反射，会聚半球透镜的球心处，照射到玻璃台；入射到所述玻璃台中的光线入射角大于能够发生全反射的最小入射角；全反射产生的倏逝波对玻璃台上表面覆盖的样品进行照明，信号光依次经过成像物镜、滤光片和管镜透射，会聚到CCD表面成像。

有益效果：

本发明实现了椭球面反射镜的全内反射荧光成像，具体体现在以下方面：

第一、在本发明中，利用椭球面反射镜对光线的会聚的特点，将传统TIRF照明方案中大面积平行光照明替代为覆盖视场范围的会聚照明，能够减小视场外的无效照明能量，提高照明光能的利用率，同时因为椭球面反射镜和锥面反射镜具有光能损失小的特点，系统所需的照明激光功率仅为传统方法的十分之一；

第二、在本发明中，椭球面反射镜能够对任意照明角度的光线进行反射，产生照明方向0°～360°的照明光线，从而减少了单向照明引起的遮挡效应，实现了无阴影照明，消除了传统技术方案中单向照明带来的“灯塔”状瑕疵，弱化了相干光的干涉条纹，增加了图像信噪比，提高了成像质量。

附图说明

图1是本发明基于椭球面反射镜全内反射的显微成像装置的结构示意图。

图中：1激光器、2准直扩束器、3遮挡片、4照明物镜、5椭球面反射镜、6半球透镜、7玻璃台、8成像物镜、9滤光片、10管镜、11CCD。

具体实施方式

下面将对本发明装置的具体实施方式做进一步说明。

本实施例的基于椭球面反射镜的全内反射荧光显微成像装置，结构示意图如图1所示。该基于椭球面反射镜的全内反射荧光显微成像装置沿光线传播方向依次设置激光器1、准直扩束镜2、遮挡片3、照明物镜4、椭球面反射镜5、半球透镜6、玻璃台7、成像物镜8、滤光片9、管镜10和CCD11；所述聚焦透镜4的焦点与椭球面反射镜5的第二焦点位置重合，椭球面反射镜5的第一焦点位于的玻璃台7上表面；所述半球透镜6的回转轴与光轴重合，半球透镜6的球心位置处于玻璃台7的上表面，半球透镜6的上表面与玻璃台7的下表面贴合在一起；制作半球透镜6材料的折射率不大于制作玻璃台7材料的折射率；

从激光器1发出的光束，依次经过准直扩束镜2和照明物镜4透射，椭球面反射镜5反射，会聚半球透镜6的球心处，照射到玻璃台7；入射到所述玻璃台7中的光线入射角大于能够发生全反射的最小入射角；全反射产生的倏逝波对玻璃台7上表面覆盖的样品进行照明，信号光依次经过成像物镜8、滤光片9和管镜10透射，会聚到CCD11表面成像。

Claims (1)

1.椭球面反射镜全内反射显微成像装置，其特征在于，沿光线传播方向依次设置激光器(1)、准直扩束镜(2)、遮挡片(3)、照明物镜(4)、椭球面反射镜(5)、半球透镜(6)、玻璃台(7)、成像物镜(8)、滤光片(9)、管镜(10)和CCD(11)；所述照明物镜(4)的焦点与椭球面反射镜(5)的第二焦点位置重合，椭球面反射镜(5)的第一焦点位于的玻璃台(7)上表面；所述半球透镜(6)的回转轴与光轴重合，半球透镜(6)的球心位置处于玻璃台(7)的上表面，半球透镜(6)的上表面与玻璃台(7)的下表面贴合在一起；制作半球透镜(6)材料的折射率不大于制作玻璃台(7)材料的折射率；

从激光器(1)发出的光束，依次经过准直扩束镜(2)和照明物镜(4)透射，椭球面反射镜(5)反射，会聚半球透镜(6)的球心处，照射到玻璃台(7)；入射到所述玻璃台(7)中的光线入射角大于能够发生全反射的最小入射角；全反射产生的倏逝波对玻璃台(7)上表面覆盖的样品进行照明，样品被激发产生的荧光依次经过成像物镜(8)、滤光片(9)和管镜(10)透射，会聚到CCD(11)表面成像。