CN106950208B - 一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法，包括：激光光束分成两路传播方向对称且振动方向垂直的线偏振光；将两路线偏振光转换为两束切向线偏振光，投射到荧光样品上发生全反射并相互干涉产生条纹结构光照明图样；收集样品发出的荧光信号，得到荧光强度信息；依次旋转结构光照明图样的干涉条纹的方向，在各方向下多次改变干涉条纹的相位，得到各方向的对应相位下的多幅荧光强度图像；利用多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到超分辨图像。本发明还公开基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像装置。本发明对入射光能量利用率高，干涉条纹对比度高，可以在低入射光功率条件下实现超过衍射极限的分辨率。

Description

一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法和 装置

技术领域

本发明属于光学超分辨显微成像领域，特别涉及一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

光学显微镜在生命科学研究中扮演着重要角色。但是，由于衍射极限的存在，即理想点物通过光学系统所成的像是一个有限大小的弥散斑，导致普通光学显微镜的成像分辨率被限制在半波长左右，即200nm。

近年来，为了突破衍射极限，在纳米尺度观测细胞的结构和功能，科研工作者们提出了多种超分辨光学显微镜技术。如基于单分子定位技术的成像方法，包括光激活定位显微镜、随机光学重构显微镜等。这类方法一般要求荧光标记密度较高，需要特异荧光染料，同时成像速度慢，难以观测分子动态运动。另一种技术是受激发射损耗显微镜，该技术通过调制点扩散函数实现了超分辨显微成像。但是这类技术也要求荧光标记密度较高，需要特异荧光染料，同时入射光功率较高，会产生光漂白现象。

在超分辨显微成像中，更加常用的一种技术是结构光照明显微镜，这种技术通过在傅里叶域对图像频谱进行处理，将普通显微镜无法观测到的高频分量移动到低频范围内，从而获取了成像样品的精细结构，提高了图像分辨率。结构光照明显微镜需要获取的图像数量较少，成像速度高，适用于实时活体细胞成像；所需荧光标记密度较低，无需特异荧光染料，普通宽场荧光显微镜所使用的荧光样品都可用于结构光成像，扩展了其应用范围，方便多色成像；入射光功率低，对生物体损伤小。但与上述几种方法相比，结构光照明显微镜的分辨率相对较低，只有100nm左右。虽对入射光功率的要求较低，但由于图像处理需要光栅扫描，限制了成像速度的进一步提高。

发明内容

本发明提供了一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法和装置，利用全内反射产生的倏逝波干涉产生结构光图样，进一步提高了普通结构光照明显微术的分辨率。该种方法和装置简单，操作方便；入射光能量利用率高；成像速度快；干涉条纹对比度高；可以在低入射光功率条件下实现超过衍射极限的分辨率，特别适用于生命科学领域中对荧光样品进行成像。

为实现上述的发明目的，本发明所采用的具体技术方案如下：

一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法，包括以下步骤：

1)激光光束分成两路传播方向对称且振动方向垂直的线偏振光；

2)将两路线偏振光转换为两束切向线偏振光，投射到荧光样品上发生全反射并相互干涉产生条纹结构光照明图样；

3)收集样品发出的荧光信号，得到荧光强度信息；

4)依次旋转结构光照明图样的干涉条纹的方向，在各方向下多次改变干涉条纹的相位，得到各方向的对应相位下的多幅荧光强度图像；

5)利用多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到超分辨图像。

在步骤4)中，至少在三个角度下旋转干涉条纹的方向，在各方向下至少三次改变干涉条纹的相位。

本发明中，单幅结构光图样投射到样品上获得的荧光强度信息中包含三个频率分量，为了分离这三个频率分量，需要得到三个方程。普通的结构光照明显微技术通过移动光栅得到三个方程，本发明通过压电陶瓷控制干涉臂反射镜进行移动，改变投射到样品上的干涉条纹的相位，得到三幅相移后的荧光图像，从而对频率分量进行提取和移动。

进一步的，为了在每个方向上都实现超分辨成像，还需要对结构光图样进行旋转。普通的结构光照明显微技术通过旋转光栅实现结构光图样的旋转，本发明通过计算机控制振镜进行圆扫描，改变投射到样品上的干涉条纹的方向，得到旋转后的荧光图像，从而实现了各个方向的超分辨成像。

作为优选的，分别在0°、60°和120°旋转干涉干涉条纹的方向，并分别控制干涉条纹相移0°、120°和240°。此处仅限于作为最优的实例，从理论上来说，旋转方向和相移角度可以是任意的数值，满足每次旋转方向和相移角度不同即可；另外，也可以增加旋转方向和相移角度的次数，也能实现本发明所要达到的技术效果和解决所提出的技术问题。

本发明与常规结构光照明显微成像技术所运用的图像重构算法完全兼容，可使用基于互相关的相位重构算法获取超分辨图像，也就是说，在图像数据处理和重构可基于现有的算法实现。

本发明还提供一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块；

所述的激发光路模块包括依次布置的：

激光器，发出激光光束；

扫描振镜系统，用于控制光束对样品进行扫描；

离轴迈克尔逊干涉仪，用于将激光光束分成两束传播方向对称且振动方向垂直的线偏振光；

切向光偏振片，用于将两束光束出射为振动方向相同的线偏振光；

显微物镜，用于将两束振动方向相同的线偏振光聚焦到样品表面进行干涉产生干涉条纹，并收集发出的荧光强度信号；

所述的成像光路模块包括：

工业相机，用于收集所述的荧光强度信号；

计算机，用于控制所述的离轴迈克尔逊干涉仪和扫描振镜系统，分别改变干涉条纹的相位和方向，并对采集的荧光强度信号进行数据处理和相位重构，得到超分辨图像。

作为优选的，所述的离轴迈克尔逊干涉仪包括：偏振光分束镜，用于将入射的线偏振光光束的两路；

依次设置在偏振光分束镜的透射光路上的第一四分之一波片、凸透镜和凹面反射镜；所述的第一四分之一波片用于将线偏振光转换成圆偏振光；所述的凸透镜用于将圆偏振光聚焦到凹面反射镜上；所述的凹面反射镜放置在凸透镜的焦点处，用于反射聚焦光同时使其传输方向相对入射方向发生位移，由凹面反射镜出射的反射光再次通过凸透镜和第一四分之一波片，由圆偏振光转换为线偏振光，且偏振方向与入射光偏振方向正交；

依次设置在偏振光分束镜的反射光路上的第二四分之一波片和由压电陶瓷驱动的平面反射镜；所述的第二四分之一波片用于将线偏振光转换成圆偏振光，平面反射镜用于反射圆偏振光再次通过第二四分之一波片变成线偏振光，偏振方向相对入射光转动180°；并通过所述的计算机控制压电陶瓷驱动平面反射镜，改变光程差使干涉图样产生相移。

根据上述描述，离轴迈克尔逊干涉仪的两干涉臂分别由四分之一波片、平面反射镜和压电陶瓷以及四分之一波片、“猫眼”构成。所述四分之一波片用于将入射的线偏振光振动方向转动180°。所述压电陶瓷用于改变相应平面反射镜的光程差使干涉图样产生相移。所述“猫眼”由凸透镜加凹面反射镜构成，用于使反射回的光线传输方向相对入射方向产生位移。

另外，所述激光器与扫描振镜系统之间依次放置有：单模光纤，用于激光光束进行滤波；起偏器，用于将激光光束变为线偏振光；和半波片，用于控制线偏振光入射到偏振分束镜上。

本发明所采用的扫描振镜系统由两个凹面反射镜构成的反射式4f系统连接。所述4f系统用于减小扫描误差并对光束进行扩束。也可采用透射式四镜系统或反射式三镜系统。

所述离轴迈克尔逊干涉仪和显微物镜之间依次放置有第三四分之一波片、切向光偏振片和凸透镜。所述第三四分之一波片用于将线偏振光转换为圆偏振光。所述切向光偏振片用于将圆偏振光转换成两束振动方向相同的线偏振光。所述凸透镜用于将两束线偏振光成像到物镜后瞳面。

所述显微物镜为大数值孔径物镜，NA＝1.42，用于将两束振动方向相同的线偏振光聚焦到待测样品表面进行干涉产生干涉条纹，同时收集待测样品发出的荧光强度信号。

在另一个技术方案中，本发明提供一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块；

所述的激发光路模块具有依次布置的：

激光器，发出激光光束；

扫描振镜系统，用于控制光束对样品进行扫描；

离轴迈克尔逊干涉仪，用于将激光光束分成两束振动方向相同的线偏振光；

切向光偏振转换器，用于将两束振动方向相同的线偏振光的偏振方向同时转动相同角度，得到沿切向方向偏振的透射光；

显微物镜，用于将两束振动方向相同的线偏振光聚焦到样品表面进行干涉产生干涉条纹，并收集发出的荧光强度信号；

所述的成像光路模块包括：

工业相机，用于收集所述的荧光强度信号；

计算机，用于控制所述的离轴迈克尔逊干涉仪和扫描振镜系统，分别改变干涉条纹的相位和方向，并对采集的荧光强度信号进行数据处理和相位重构，得到超分辨图像。

作为优选的所述的离轴迈克尔逊干涉仪包括：

非偏振光分束镜，用于将入射的线偏振光光束的两路；

依次设置在非偏振光分束镜的透射光路上的凸透镜和凹面反射镜；所述的凸透镜用于将投射的线偏振光聚焦到凹面反射镜上；所述的凹面反射镜放置在凸透镜的焦点处，用于反射聚焦光同时使其传输方向相对入射方向发生位移，由凹面反射镜出射的反射光再次通过凸透镜入射所述非偏振光分束镜；

设置在非偏振光分束镜的反射光路上的由压电陶瓷驱动的平面反射镜，用于反射线偏振光，偏振方向相对入射光转动180°；并通过所述的计算机控制压电陶瓷驱动平面反射镜，改变光程差使干涉图样产生相移。

作为优选的，所述的非偏振光分束镜与切向光偏振转换器间设置凸透镜，切向光偏振转换器位于该凸透镜的焦平面处。

作为优选的，所述激光器与扫描振镜系统之间依次放置有：单模光纤，用于激光光束进行滤波；起偏器，用于将激光光束变为线偏振光；和半波片，用于控制线偏振光入射到非偏振光分束镜上。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)装置简单，操作方便；

(2)使用离轴迈克尔逊干涉仪和全内反射现象代替光栅衍射获取干涉图样，提高了入射光能量利用率。同时离轴迈克尔逊干涉仪中使用“猫眼”结构对圆扫描光束进行位移，相比角锥棱镜位移精确度高；

(3)使用振镜扫描代替光栅扫描，无需机械旋转，进一步提高了结构光照明显微镜的成像速度，可进行活体成像，观测分子的动态结构；

(4)使用切向光偏振片提高了干涉条纹对比度，改善了成像质量；

(5)将结构光照明显微技术与全内反射显微技术相结合，进一步提高了成像分辨率，实现了低入射光功率条件下的超分辨率成像。

附图说明

图1为本发明一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像装置的示意图。

图2为切向光偏振片示意图。

图3分别为投射到待测样品表面发生干涉产生的条纹结构光图样对比度示意图，其中，(a)图为两束切向线偏振光产生的条纹结构光图样，(b)图为两束水平线偏振光产生的条纹结构光图样，(c)图为两束圆偏振光产生的条纹结构光图样；

图4为采用切向光偏振转换器实现本发明方法的装置示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

实施例1

如图1所示的宽场超分辨显微成像装置，包括：激光器1、单模光纤2、起偏器3、半波片4、扫描振镜系统5、偏振光分束镜6、第一四分之一波片7、第一凸透镜8、凹面反射镜9、第二四分之一波片10、平面反射镜11、压电陶瓷12、第三四分之一波片13、切向光偏振片14、第二凸透镜15、二向色镜16、显微物镜17、待测荧光样品18、滤波片19、第三凸透镜20、CMOS工业相机21、计算机22。

激光器1发出激光光束，单模光纤2、起偏器3和半波片4依次放置在激光光束光路的光轴上。单模光纤2用于激光光束进行滤波，起偏器3用于将出射激光转换成线偏振光，半波片4用于控制线偏振光入射到偏振分束镜上方向。

经过半波片4偏振方向改变后的线偏振光入射到扫描振镜系统5上。扫描振镜系统5由两个振镜和两个凹面反射镜组成的4f系统构成，四个光学元件位置的放置需要与后续光路保证物像关系，采用4f系统还可以减小扫描误差并对激光光束进行扩束，两个振镜通过计算机22控制其进行圆形扫描。振镜扫描系统也可采用透射式四镜系统或反射式三镜系统。

从振镜出射的光束入射到偏振光分束镜6上，偏振光分束镜6将光束分为两路，一路光透射依次通过第一四分之一波片7和第一凸透镜8聚焦到凹面反射镜9上，第一四分之一波片7用于将线偏振光转换成圆偏振光，第一凸透镜8用于将圆偏振光聚焦到凹面反射镜9上，凹面反射镜9放置在第一凸透镜8的焦点处，用于反射聚焦光同时使其传输方向相对入射方向发生位移，反射光再次通过第一凸透镜8和第一四分之一波片7，由圆偏振光转换为线偏振光，且偏振方向与入射光偏振方向正交。另一路光反射通过第二四分之一波片10入射到平面反射镜11上，第二四分之一波片10用于将线偏振光转换成圆偏振光，平面反射镜11用于反射圆偏振光再次通过第二四分之一波片10变成线偏振光，偏振方向相对入射光转动180°，平面反射镜由压电陶瓷12驱动，改变光程差使干涉图样产生相移。

从两干涉臂反射回来的两路偏振方向正交的线偏振光再次被偏振光分束镜6反射和透射进入激发光路，依次通过第三四分之一波片13、切向光偏振片14、第二凸透镜15、二向色镜16和显微物镜17，聚焦到待测荧光样品18上。第三四分之一波片13用于将两束振动方向正交的线偏振光转换为圆偏振光，切向光偏振片14结构如图2所示，用于将圆扫描圆偏振光转换成两束始终沿切向方向振动的线偏振光进行干涉，保证条纹对比度最高，如图3所示，(a)图为两束切向线偏振光产生的条纹结构光图样，(b)图为两束水平线偏振光产生的条纹结构光图样，(c)图为两束圆偏振光产生的条纹结构光图样。第二凸透镜15位于显微物镜17的焦点处，用于将两束线偏振光成像到显微物镜17后瞳面，二向色镜16用于透过激发光束，反射待测样品发出的荧光信号，显微物镜17为大数值孔径物镜，NA＝1.42，用于将两束振动方向相同的线偏振激发光聚焦到待测荧光样品18上，使其在样品表面发生全反射产生倏逝波并相互干渉形成结构光照明图样。

结构光照明图样激发待测样品18产生荧光信号，产生的荧光信号依次通过显微物镜17、二向色镜16、滤波片19和第三凸透镜20，聚焦到CMOS工业相机21上。显微物镜17用于收集待测样品产生的荧光信号，荧光信号被二向色镜11反射后通过滤波片19和第三凸透镜20，滤波片19用于滤去待测样品发出的荧光中的杂散光，第三凸透镜20用于待测样品内部荧光强度信息成像到CMOS工业相机21上。

采用图1所示的全内反射结构光照明装置的宽场超分辨显微成像装置工作方法如下：

激光器1发出的激光光束入射到偏振分束镜6上，分解成两束振动方向正交的线偏振光进入离轴迈克尔逊干涉仪的两干涉臂，从干涉仪两臂反射回来的两束线偏振光经过第一四分之一波片7、第二四分之一波片10、第三四分之一波片13和切向光偏振片14进行偏振态的转换，成像到显微物镜17后瞳面，聚焦到带有荧光标记的待测样品18上各自发生全反射并相互干涉产生条纹结构光图样。结构光照明图样激发待测样品18发出荧光信号被显微物镜17收集起来，经过滤波片19滤去收集到的荧光中的杂散光，然后成像到CMOS工业相机21上，得到待测样品18内部的荧光强度信息。

单幅结构光图样投射到样品上获得的荧光强度信息中包含三个频率分量，所以需要得到三个图像方程以分离这三个频率分量，通过压电陶瓷12控制平面反射镜11进行移动，使得投射到待测样品18上的条纹结构光图样相移0°、120°、240°，得到三幅相移后的荧光图像，从而对频率分量进行提取和移动。

相移后得到的频率分量只分布在水平方向，为了在各个方向都实现超分辨，需要使用计算机22控制振镜系统5进行圆扫描，使得投射到样品18上的条纹结构光图样的方向旋转0°、60°、120°，得到相应的荧光强度图像，此时即在平面内各个方向上都实现了超分辨成像。

最后再通过计算机22对得到的9幅荧光强度图像进行数据处理，采用基于互相关的相位重构算法获取超分辨图像。

实施例2

如图4所示，该实施例宽场超分辨显微成像装置也可以采用切向光偏振转换器来实现。图4与图1相比，使用非偏振光分束镜23替换了偏振光分束镜6，去掉了第一四分之一波片7、第二第一四分之一波片10、第三第一四分之一波片13和切向光偏振片14，同时加入了切向光偏振转换器24。由于切向光偏振转换器24要求入射光为点入射，所以需放置在第二凸透镜15的焦平面处，即显微物镜17的入瞳面处。非偏振分束镜23将入射线偏振光分成两路进入离轴迈克尔逊干涉仪两干涉臂时不会改变光的偏振态，只起分光强作用。切向光偏振转换器24用于将从两干涉臂反射回的两束振动方向相同的线偏振光的偏振方向同时转动相同角度，以不同偏振方向入射时转动的角度不同，保证透射光始终沿切向方向偏振，从而振镜系统在进行圆扫描时无需旋转某一光学元件(如传统结构光照明超分辨显微成像装置中的衍射光栅)就可以形成以不同角度投射到样品表面的干涉条纹结构光图样，提高了成像速度，避免了机械转动造成的误差，且结构光图样条纹对比度始终最高，改善了成像质量。其他方法和步骤与实施例1相同。

Claims (9)

1.一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)激光光束分成两路传播方向对称且振动方向垂直的线偏振光；

2)将两路线偏振光转换为两束切向线偏振光，投射到荧光样品上发生全反射并相互干涉产生条纹结构光照明图样；

3)收集样品发出的荧光信号，得到荧光强度信息；

4)依次旋转结构光照明图样的干涉条纹的方向，在各方向下多次改变干涉条纹的相位，得到各方向的对应相位下的多幅荧光强度图像；

在步骤4)中，至少在三个角度下旋转干涉条纹的方向，在各方向下至少三次改变干涉条纹的相位；

5)利用多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到超分辨图像。

2.一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块，其特征在于：

所述的激发光路模块包括依次布置的：

激光器，发出激光光束；

扫描振镜系统，用于控制光束对样品进行扫描；

离轴迈克尔逊干涉仪，用于将激光光束分成两束传播方向对称且振动方向垂直的线偏振光；

切向光偏振片，用于将两束光束出射为振动方向相同的线偏振光；

显微物镜，用于将两束振动方向相同的线偏振光聚焦到样品表面进行干涉产生干涉条纹，并收集发出的荧光强度信号；

所述的成像光路模块包括：

工业相机，用于收集所述的荧光强度信号；

计算机，用于控制所述的离轴迈克尔逊干涉仪和扫描振镜系统，分别改变干涉条纹的相位和方向，并对采集的荧光强度信号进行数据处理和相位重构，得到超分辨图像。

3.如权利要求2所述的宽场超分辨显微成像装置，其特征在于：所述的离轴迈克尔逊干涉仪包括：

偏振光分束镜，用于将入射的线偏振光光束的两路；

依次设置在偏振光分束镜的透射光路上的第一四分之一波片、凸透镜和凹面反射镜；所述的第一四分之一波片用于将线偏振光转换成圆偏振光；所述的凸透镜用于将圆偏振光聚焦到凹面反射镜上；所述的凹面反射镜放置在凸透镜的焦点处，用于反射聚焦光同时使其传输方向相对入射方向发生位移，由凹面反射镜出射的反射光再次通过凸透镜和第一四分之一波片，由圆偏振光转换为线偏振光，且偏振方向与入射光偏振方向正交；

依次设置在偏振光分束镜的反射光路上的第二四分之一波片和由压电陶瓷驱动的平面反射镜；所述的第二四分之一波片用于将线偏振光转换成圆偏振光，平面反射镜用于反射圆偏振光再次通过第二四分之一波片变成线偏振光，偏振方向相对入射光转动180°；并通过所述的计算机控制压电陶瓷驱动平面反射镜，改变光程差使干涉图样产生相移。

4.如权利要求3所述的宽场超分辨显微成像装置，其特征在于：所述激光器与扫描振镜系统之间依次放置有：

单模光纤，用于激光光束进行滤波；

起偏器，用于将激光光束变为线偏振光；

和半波片，用于控制线偏振光入射到偏振分束镜上。

5.如权利要求3所述的宽场超分辨显微成像装置，其特征在于：所述的偏振光分束镜与切向光偏振片之间设置将线偏振光转换为圆偏振光的第三四分之一波片。

6.一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块，其特征在于：

所述的激发光路模块具有依次布置的：

激光器，发出激光光束；

扫描振镜系统，用于控制光束对样品进行扫描；

离轴迈克尔逊干涉仪，用于将激光光束分成两束振动方向相同的线偏振光；

切向光偏振转换器，用于将两束振动方向相同的线偏振光的偏振方向同时转动相同角度，得到沿切向方向偏振的透射光；

显微物镜，用于将两束振动方向相同的线偏振光聚焦到样品表面进行干涉产生干涉条纹，并收集发出的荧光强度信号；

所述的成像光路模块包括：

工业相机，用于收集所述的荧光强度信号；

计算机，用于控制所述的离轴迈克尔逊干涉仪和扫描振镜系统，分别改变干涉条纹的相位和方向，并对采集的荧光强度信号进行数据处理和相位重构，得到超分辨图像。

7.如权利要求6所述的宽场超分辨显微成像装置，其特征在于：所述的离轴迈克尔逊干涉仪包括：

非偏振光分束镜，用于将入射的线偏振光光束的两路；

依次设置在非偏振光分束镜的透射光路上的凸透镜和凹面反射镜；所述的凸透镜用于将投射的线偏振光聚焦到凹面反射镜上；所述的凹面反射镜放置在凸透镜的焦点处，用于反射聚焦光同时使其传输方向相对入射方向发生位移，由凹面反射镜出射的反射光再次通过凸透镜入射所述非偏振光分束镜；

设置在非偏振光分束镜的反射光路上的由压电陶瓷驱动的平面反射镜，用于反射线偏振光，偏振方向相对入射光转动180°；并通过所述的计算机控制压电陶瓷驱动平面反射镜，改变光程差使干涉图样产生相移。

8.如权利要求7所述的宽场超分辨显微成像装置，其特征在于：所述的非偏振光分束镜与切向光偏振转换器间设置凸透镜，切向光偏振转换器位于该凸透镜的焦平面处。

9.如权利要求8所述的宽场超分辨显微成像装置，其特征在于：所述激光器与扫描振镜系统之间依次放置有：

单模光纤，用于激光光束进行滤波；

起偏器，用于将激光光束变为线偏振光；

和半波片，用于控制线偏振光入射到非偏振光分束镜上。