CN103926225B

CN103926225B - 一种基于倏逝波照明的荧光发射微分显微方法及装置

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Publication number: CN103926225B
Application number: CN201410124581.XA
Authority: CN
Inventors: 刘旭; 方月; 匡翠方; 荣子豪
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2034-03-28
Also published as: CN103926225A

Abstract

本发明公开了一种基于倏逝波照明的荧光发射微分显微方法，包括以下步骤：1）将光源发出的照明光束扩束后，分为两束正交的平行偏振光和垂直偏振光；2）单独采用平行偏振光进行照明，将平行偏振光调制后转换为圆偏光，再转换为第一环形照明光，然后聚焦到样品表面形成第一倏逝场对荧光样品进行激发，收集激发荧光得到暗斑图像信号；3）单独采用垂直偏振光进行照明，将垂直偏振光变为圆偏光后再转换为第二环形照明光，然后聚焦到样品表面形成第二倏逝场，对荧光样品进行激发，收集激发荧光得到亮斑图像信号；4）对暗斑图像信号和亮斑图像信号进行微分处理，完成对样品的一点扫描。本发明还公开了一种基于倏逝波照明的荧光发射微分显微装置。

Description

一种基于倏逝波照明的荧光发射微分显微方法及装置

技术领域

本发明属于共聚焦显微领域，特别涉及一种基于倏逝波照明的荧光发射微分显微方法及装置。

背景技术

共聚焦显微镜利用激光束经光学系统形成的点光源对样品内物镜焦平面的每一点进行扫描。样品上的被照射点，在探测针孔处成像，而焦平面以外的点不会在探测针孔处成像。样品上被照射点的图像信息由探测针孔后的光电探测器逐点接收，迅速在计算机监视屏上形成荧光图像，这样得到的共聚焦图像就是样品内物镜焦平面的光学横断面。但是根据衍射理论，显微镜的分辨能力与波长和数值孔径有关，减小波长和增大数值孔径都能提高分辨率，但都无法突破衍射极限，不能真正大幅度地提高分辨率。

近年来，一些突破衍射极限的超分辨显微方法逐渐提出。其中受激发射损耗显微镜(STED)通过分子态的饱和损耗可实现超分辨，但需使用大功率激光器提高分辨率，很容易发生荧光漂白现象；随机光学重构显微镜(STORM)则是通过牺牲时间分辨率来换取空间分辨率；结构光照明显微镜(SIM)则有操作复杂，分辨率提高有限等缺点。

发明内容

本发明在共聚焦显微镜(如图1所示)的基础上，提出了一种基于倏逝波照明的荧光发射微分显微方法及装置，可在保证纵向分辨率的同时实现横向的超分辨显微成像，通过光在样品表面发生全内反射时产生的倏逝波照明样本，仅激发样品表面薄层范围内的荧光基团，从而提高了显微成像在纵轴上的空间分辨率。在横向上，本装置利用偏振分光镜(PBS)将照明光束分成两束光，用涡旋位相板对其中一束光进行调制使其在样品表面干涉形成暗斑，另一束未经调制的光聚焦于样品表面形成亮斑，分别用实心亮斑和空心暗斑对样品表面实现逐点倏逝场照明。通过光电探测器分别接收这两束光照明的图像信息，对最终所得的亮斑图像和暗斑图像进行微分处理，可实现横向的超分辨显微成像。

一种基于倏逝场照明的荧光发射微分显微方法，针对荧光样品包括以下步骤：

(1)激光器发出照明光束，首先经第一透镜和第二透镜扩束，扩束后的照明光束经第一偏振分光镜(PBS)分光后，得到平行偏振光(p光)和垂直偏振光(s光)；所述平行偏振光(p光)光斑经涡旋位相板，再经第二偏振分光镜(PBS)全部透射后，经四分之一波片后变成第一圆偏照明光，其横切面如图5(a)；第一圆偏光经圆形挡板或锥形镜，形成第一环形照明光，其横切面如图5(b)所示；经过涡旋位相板调制的第一环形照明光经物镜聚焦到荧光样品表面，干涉形成空心暗斑如图7(b)，并在样品表面发生全反射产生与空心暗斑分布相同的倏逝场分布，即第一倏逝场，对荧光样品进行激发；

(2)所述荧光样品被第一倏逝场激发出荧光，得到的荧光先被物镜收集，经二色镜反射，再经第三透镜聚焦被光电探测器接收；

(3)被第一偏振分光镜(PBS)反射的所述垂直偏振光(s光)，被所述第一反射镜和第二反射镜全部反射后，经所述第二偏振分光镜(PBS)全部反射，再经四分之一波片后变成第二圆偏照明光，其横切面如图6(a)；第二圆偏光经圆形挡板或锥形镜，形成第二环形照明光，其横切面如图6(b)所示；第二环形照明光经物镜聚焦到荧光样品表面形成实心光斑如图7(a)，并在样品表面发生全反射产生与实心光斑分布相同的倏逝场分布，即第二倏逝场，对荧光样品进行激发；

(4)所述荧光样品被第二倏逝场激发出荧光，得到的荧光先被物镜收集，经二色镜反射，再经第三透镜聚焦被光电探测器接收；

(5)所述光电探测器将光信号转换为电信号并传给计算机，计算机对两次得到的图像信号做微分处理，完成了对第一个扫描点的亮斑图像信息和暗斑图像信息的读入和处理，即第一次扫描；

(6)荧光样品所在的纳米平移台与计算机相连，通过计算机来控制纳米平移台使样品完成二维平面的扫描。

本发明还提供了一种基于倏逝场照明的荧光发射微分显微装置，针对荧光样品包括：

激光器，用于发出激发光，实现对荧光样品的照明激发；

第一透镜，第二透镜，用于对激光器发出的激发光进行扩束；

第一偏振分光镜(PBS)，用于对扩束后的照明光进行分光，反射垂直偏振光(s光)，同时让平行偏振光(p光)全部通过；

第二偏振分光镜(PBS)，用于反射垂直偏振光(s光)并透射经涡旋位相板调制的平行偏振光(p光)；

0～2π涡旋位相板，用于对平行偏振光(p光)进行调制，从而使平行偏振光(p光)在样品面聚焦时形成空心暗斑；

第一快门，用于控制平行偏振光(p光)；

第二快门，用于控制垂直偏振光(s光)；

第一反射镜、第二反射镜，用于反射垂直偏振光(s光)；

四分之一波片，用于将线偏光变成圆偏光，使照明光束更加均匀；

挡板，具有环形的通光孔，用于将圆形照明光束调制成环形照明光束，从而使照明光经过物镜后聚焦于样品表面时能够发生全发射；

锥形镜(内锥镜和外锥镜)，另一种将圆形照明光束调制成环形照明光束的器件；

二色镜，透射激发光以及激发光照射样品产生的后向散射光，反射样品激发出的荧光；

纳米平移台，通过控制纳米位移平台完成对样品的二维平面扫描；

光电探测器，将探测针孔处探测到的光信号转换为电信号传送至计算机；

计算机，用于处理探测器的信号，控制快门的开关，同时控制纳米平移台完成对样品的二维平面扫描。

本发明原理如下：

在通用的共聚焦显微镜装置基础上，首先利用一个偏振分光镜(PBS)，将激光发出的照明光束分为两个正交的线性偏振分量，其中垂直偏振光(s光)以90°反射，而平行偏振光(p光)则透射而出。全部透射而出的平行偏振光(p光)经过一个涡旋位相板调制，再经一个偏振分光镜全部透射后，经过一个四分之一波片变成第一圆偏光，第一圆偏光经圆形挡板或锥形镜后，形成第一环形照明光。该环形照明光经物镜聚焦到荧光样品表面发生全反射，并形成如空心斑分布(如图7(b))的倏逝场来激发样品发出荧光。激发出的荧光被物镜收集并被光电探测器接收得到第一个扫描点的暗斑图像。

另一束被90°全部反射的垂直偏振光(s光)经两个反射镜和另一个偏振分光镜全部反射后，经四分之一波片变成第二圆偏光，第二圆偏光经圆形挡板或锥形镜后，形成第二环形照明光。该环形照明光经物镜聚焦到荧光样品表面发生全反射，并形成如实心光斑分布(如图7(a))的倏逝场来激发样品发出荧光。激发出的荧光被物镜收集并被光电探测器接收得到第一个扫描点的亮斑图像。

通过快门控制，先开启第一快门、关闭第二快门，得到每个扫描点的第一个图像信息，再开启第二快门、关闭第一快门，得到该扫描点的第二个图像信息。通过对最终收集到的亮斑图像信息和暗斑图像信息进行微分处理，可以得到暗斑的中心暗区大小的光斑激发出的荧光，显然中心暗区的尺寸(如图7(c))比原有的实心光斑(如图7(a))的尺寸更小，因此最终得到的微分结果相当于是中心暗区大小的光斑激发出的荧光，从而实现了横向超分辨。通过计算机同步控制快门的开关和纳米平移台的移动实现对样品的二维扫描，得到样品的二维荧光图像。本发明在提高纵向分辨率的同时实现横向的超分辨显微成像，在一定程度上达到了三维超分辨的效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)相对于原有的共聚焦显微镜，通过倏逝场照明实现了纵向分辨的提高。

(2)通过微分方法突破衍射极限，实现了横向超分辨。

(3)装置结构简单，数据处理方便。

附图说明

图1为传统的共聚焦显微镜装置示意图；

图2为一种由挡板调制的基于倏逝场照明的荧光发射微分显微装置示意图；

图3(a)为图2装置的虚线框部分的放大图，其中由于激发光可全部透过分光镜，故将分光镜省略；图3(b)为图3(a)虚线处的横切图，即挡板的横切图；

图4为一种由锥形镜调制的基于倏逝场照明的荧光发射微分显微装置示意图；

图5(a)为图2中虚线a的横切面图；图5(b)为图2中虚线b的横切面图；

图6(a)为图4中虚线a的横切面图；图6(b)为图4中虚线b的横切面图；

图7(a)为垂直偏振光(s光)形成的实心亮斑示意图；图7(b)为平行偏振光(p光)经涡旋位相板调制后形成的空心暗斑示意图；图7(c)为样品面上两束光斑微分的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不限于此。

实施例1

如图2所示，一种针对荧光样品的由挡板调制的基于倏逝场照明的荧光发射全反射微分显微装置，包括激光器1，第一透镜2，第二透镜3，第一偏振分光镜4，位相板5，第一快门6，第二偏振分光镜7，四分之一波片8，具有环形通光孔的挡板9，二色镜10，物镜11，样品12，纳米平移台13，第一反射镜14，第二快门15，第二反射镜16，第三透镜17，探测针孔18，光电探测器19，计算机20。

采用图2所示的装置实现针对样品的基于倏逝场照明的荧光发射微分显微方法，其过程如下：

(1)激光器1发出照明光，经第一透镜2和第二透镜3扩束；

(2)扩束后的照明光经第一偏振分光镜4分成两束正交的线偏光，其中垂直偏振光(s光)以90°反射，而平行偏振光(p光)则透射而出；

(3)第一快门6打开，第二快门15关闭，使平行偏振光(p光)经过涡旋位相板调制后通过，再经第二偏振分光镜7全部透射后，经四分之一波片8变成圆偏光，最后形成的圆偏光经具有环形通光孔的挡板9调制为环形照明光，其中挡板9的尺寸要保证第一环形照明光中最靠近光轴的光线经过物镜11照射到样品表面时发生全反射，如图3(a)所示，即挡板的中心圆半径r要满足：

r/f≥sinθ_c＝n_样品/n_浸油

其中，r为挡板的中心圆半径，f为物镜的焦距，θ_c为光束在样品表面发生全反射的入射临界角，n_样品为样品的折射率，n_浸油为物镜浸油的折射率；

环形照明光经分光镜10全部透射后，再经物镜11聚焦到样品12表面，得到一个空心光斑激发的倏逝场激发样品12发出荧光。激发出的荧光被物镜11收集，经分光镜10反射，并在垂直照明光光轴方向由第三透镜17聚焦到探测针孔18处，由光电探测器19接收得到第一个扫描点的暗斑图像信号传输到计算机20中。

(4)被90°反射的垂直偏振光(s光)经第一反射镜14反射，在得到第一幅图后，立刻关闭第一开关6，并打开第二开关15，这束s光经过第二反射镜16反射，再经第二偏振分光镜7反射，最后经四分之一波片8变成圆偏光，最后形成的圆偏光经挡板9调制为环形照明光。环形照明光经分光镜10全部透射后，再经物镜11聚焦到样品12表面，得到一个实心光斑激发的倏逝场激发样品12发出荧光。激发出的荧光被物镜11收集，经分光镜10反射，并在垂直照明光光轴方向由第三透镜17聚焦到探测针孔18处，由光电探测器19接收得到第一个扫描点的亮斑图像信号传输到计算机20中。

(5)计算机19将对得到的两幅图进行微分处理，完成第一次扫描；

(6)样品12所在的纳米平台13与计算机20相连，通过计算机20来控制纳米平移台13使样品12移动完成二维扫描成像。

实施例2

如图4所示，一种针对荧光样品的由挡板调制的基于倏逝场照明的荧光发射全反射微分显微装置，包括激光器1，第一透镜2，第二透镜3，第一偏振分光镜4，位相板5，第一快门6，第二偏振分光镜7，四分之一波片8，内锥镜和外锥镜21，分光镜10，物镜11，样品12，纳米平移台13，第一反射镜14，第二快门15，第二反射镜16，第三透镜17，探测针孔18，探测器19，计算机20。

采用图4所示的装置实现针对样品的基于倏逝场照明的荧光发射微分显微方法，其过程如下：

(1)激光器1发出照明光，经第一透镜2和第二透镜3扩束；

(3)第一快门6打开，第二快门15关闭，使平行偏振光(p光)经过涡旋位相板调制后通过，再经第二偏振分光镜7全部透射后，经四分之一波片8变成圆偏光，最后形成的圆偏光经内锥镜和外锥镜21调制为环形照明光，其中内锥镜和外锥镜的设置要保证第一环形照明光中最靠近光轴的光线经过物镜照射到样品表面时发生全反射；环形照明光经分光镜10全部透射后，再经物镜11聚焦到样品12表面，得到一个空心光斑激发的倏逝场激发样品12发出荧光。激发出的荧光被物镜11收集，经分光镜10反射，并在垂直照明光光轴方向由第三透镜17聚焦到探测针孔18处，由光电探测器19接收得到第一个扫描点的暗斑图像信号传输到计算机20中。

(4)被90°反射的垂直偏振光(s光)经第一反射镜14反射，在得到第一幅图后，立刻关闭第一开关6，并打开第二开关15，这束s光经过第二反射镜16反射，再经第二偏振分光镜7反射，最后经四分之一波片8变成圆偏光，最后形成的圆偏光经内锥镜和外锥镜21调制为环形照明光。环形照明光经分光镜10全部透射后，再经物镜11聚焦到样品12表面，得到一个实心光斑激发的倏逝场激发样品12发出荧光。激发出的荧光被物镜11收集，经分光镜10反射，并在垂直照明光光轴方向由第三透镜17聚焦到探测针孔18处，由光电探测器19接收得到第一个扫描点的亮斑图像信号传输到计算机20中。

Claims

1.一种基于倏逝波照明的荧光发射微分显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将光源发出的照明光束扩束后，分为两束正交的平行偏振光和垂直偏振光；

2)单独采用平行偏振光进行照明，将所述的平行偏振光调制后转换为圆偏光，再转换为第一环形照明光，然后聚焦到样品表面，干涉形成空心暗斑，并在样品表面发生全反射产生与空心暗斑分布相同的倏逝场分布，即第一倏逝场，对荧光样品进行激发，收集激发荧光得到暗斑图像信号；

3)单独采用垂直偏振光进行照明，将所述的垂直偏振光变为圆偏光后再转换为第二环形照明光，然后聚焦到样品表面形成实心光斑，并在样品表面发生全反射产生与实心光斑分布相同的倏逝场分布，即第二倏逝场，对荧光样品进行激发，收集激发荧光得到亮斑图像信号；

4)对所述的暗斑图像信号和亮斑图像信号进行微分处理，完成对样品的一点扫描。

2.如权利要求1所述的基于倏逝波照明的荧光发射微分显微方法，其特征在于，在步骤2)中，采用0～2π涡旋位相板对所述的平行偏振光进行调制。

3.如权利要求2所述的基于倏逝波照明的荧光发射微分显微方法，其特征在于，在步骤2)和步骤3)中，采用具有环形通光孔的挡板将所述的圆偏光转换为对应的环形照明光。

4.如权利要求2所述的基于倏逝波照明的荧光发射微分显微方法，其特征在于，在步骤2)和步骤3)中，利用沿光路依次布置的内锥镜和外锥镜，将所述的圆偏光转换为对应的环形照明光。

5.如权利要求3或4所述的基于倏逝波照明的荧光发射微分显微方法，其特征在于，在步骤2)和步骤3)中，利用快门控制所述的平行偏振光和垂直偏振光的光路开启或关闭。

6.一种基于倏逝波照明的荧光发射微分显微装置，其特征在于，包括：

沿光路依次布置的光源、扩束镜组和分光器件，所述光源发出的照明光经分光器件后分为垂直偏振光和平行偏振光；

位于所述平行偏振光光路上的位相板和第一快门；

位于所述垂直偏振光光路上的第二快门；

用于将所述平行偏振光和垂直偏振光转换为圆偏光的四分之一波片；

用于将所述的圆偏光转换为相应环形照明光的光学器件；

用于将环形照明光聚焦到样品表面的物镜；

以及分别用于荧光信号采集和信号处理的光电探测器和计算机。

7.如权利要求6所述的基于倏逝波照明的荧光发射微分显微装置，其特征在于，所述的位相板为0～2π涡旋位相板。

8.如权利要求7所述的基于倏逝波照明的荧光发射微分显微装置，其特征在于，所述的光学器件为具有环形通光孔的挡板。

9.如权利要求7所述的基于倏逝波照明的荧光发射微分显微装置，其特征在于，所述的光学器件为沿光路依次布置的内锥镜和外锥镜。