CN103048299B - 基于荧光寿命差分的超分辨显微方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，包括以下步骤：1)将圆偏振光作为激发光束，使用经涡旋位相编码的圆偏振光作为抑制光束，所述激发光束和抑制光束通过大数值孔径显微物镜聚焦并同时对荧光样品进行扫描；2)利用所述大数值孔径显微物镜收集扫描荧光样品发出的荧光，并通过光电感应器件得到整幅荧光强度图像；3)通过分析所述荧光强度图像的荧光强度信息，得到相应的荧光寿命信息；4)设置时间门，对所述荧光寿命信息中的长寿命荧光图像和短寿命荧光图像进行分离；5)设置权值，用所述的短寿命荧光图像减去加权的长寿命荧光图像，得到最终的超分辨显微图像。本发明还公开了一种基于荧光寿命差分的超分辨显微装置。
Description
技术领域
本发明涉及显微成像领域，尤其涉及一种基于荧光寿命差分的超分辨显微方法及装置。
背景技术
与绝大部分光学成像一样，自从显微镜被发明以来，阿贝衍射极限也一直制约着显微系统分辨率的提高。早期的显微系统均为宽场成像系统，成像分辨能力有限。这一情况直到共聚焦显微系统(Confocal Microscope)发明后才得到一定的改善。共聚焦显微的基本概念在1957年由M.Minsky等人提出(参见M.Minsky等Microscopy Apparatus，美国专利3013467)，但直到1978年该技术才真正得以仪器化(参见C.Cremer等Considerationson a laser-scanning-microscope with high resolution and depth of field，Microscopia Acta81,31-44(1978))。与传统的宽场显微系统相比，共聚焦显微系统采用扫描成像的方式，在与成像物面共轭的焦平面上放置一个针孔(Pinhole)对非成像点周围的杂散光进行遮挡，从而有效地限制了系统的有效点扩散函数。通过系统的光学传递函数分析可以证明，使用共聚焦方法，能够在系统的极限分辨率提高约1.4倍。
近年来，随着受激发射损耗显微技术(Stimulated Emission Depletion(STED)microscopy)的提出(参见S.W.Hell等Breaking the DiffractionResolution Limit by Stimulated-Emission-Stimulated-Emission-DepletionFluorescence Microscopy，Optics Letters19,780-782(1994))，远场光学显微成像的分辨率得到更大的改进，其分辨率被进一步推进达到纳米量级，可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质，从而从物理上打破了衍射光学极限。其具体原理是：基于传统共焦显微技术，对荧光标记进行荧光激发，与此同时用另一束高强度同轴激光光束形成空心聚焦暗斑，对荧光标记周围的衍射弥散发光进行抑制，这样只有中心点的荧光激发现象可以被观察到，从而打破衍射极限，达到超分辨显微成像的目的。
虽然STED显微技术有效地提高了光学荧光显微系统的成像分辨能力，但是由于其理论本身的限制，要求抑制光束的输入光功率很高(通常达到W量级)，加大了荧光漂白和光毒作用的风险，容易对荧光样品造成不可逆的损害，误导观察现象。为了降低抑制光束的光功率，Vicidomini等人在2011年提出了基于时间门技术的STED显微术(time-gated STED，g-STED)(参见G.Vicidomini等Sharper low-power STED nanoscopy by timegating，Nature Methods8,571-573(2011))。该技术利用抑制光束照射荧光样品在抑制其受激荧光幅射的同时会缩短其荧光寿命的特点，在系统中设置时间门对荧光信号进行实时过滤，从而有效地将所需要的抑制光束输入光功率降低到数十mW量级。但是，该种方法减少了可有效利用的荧光信号强度，降低了系统信噪比，容易对系统的实际分辨能力产生不利影响。
发明内容
本发明提供了一种基于荧光寿命差分的超分辨显微方法和装置，在保证低抑制光束输入光功率的同时，提高系统的信噪比，从而提高系统的实际分辨能力。
一种基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，包括以下步骤：
1)将圆偏振光作为激发光束，使用经涡旋位相编码的圆偏振光作为抑制光束，所述激发光束通过大数值孔径显微物镜聚焦形成实心聚焦光斑，所述抑制光束通过所述大数值孔径显微物镜聚焦形成空心聚焦光斑，两光斑同时对荧光样品进行扫描；
2)利用所述大数值孔径显微物镜收集扫描荧光样品发出的荧光，并通过光电感应器件得到整幅荧光强度图像；
3)通过分析所述荧光强度图像的荧光强度信息，得到相应的荧光寿命信息；
4)设置时间门，对所述荧光寿命信息中的长寿命荧光图像和短寿命荧光图像进行分离；
5)设置权值，用所述的长寿命荧光图像减去加权的短寿命荧光图像，得到最终的超分辨显微图像。
步骤1)中所述的涡旋位相编码是指对于一个横截面中心对称的圆形入射光束，以光束中心点为圆心，对横截面内的光束产生0～2π的涡旋位相延迟，位相延迟量仅与截面内特定点的角向大小有关，而与该点到圆心的距离无关。可用如下公式加以表示：
其中Δα为位相延迟量，为角向大小。
所述的激发光束和抑制光束，其对应波长由荧光样品荧光标记的性质决定：激发光束的波长应位于荧光标记的荧光吸收光谱带内，抑制光束的波长应位于荧光标记的荧光发射光谱带内，且抑制光束的波长应长于荧光发射峰值波长。
所述的实心聚焦光斑，是指聚焦光斑光强呈高斯或类高斯状分布，且聚焦光斑内峰值光强位于理想物方焦点处；所述的空心聚焦光斑，是指聚焦光斑光强围绕理想物方焦点呈面包圈状分布，且理想物方焦点处光强小于聚焦光斑内峰值光强的1％。
步骤3)中所述的荧光寿命信息，可以通过在线实时获取荧光强度信号随时间变化的信息后通过曲线拟合得到，也可以在记录完整强度信息后通过时间相关单光子记数算法(Time Correlated Single Photon Counting，TCSPC)得到，优选通过TCSPC算法得到。
步骤4)中所述的时间门，可以为在光路上设置快门，也可以通过电路对光电感应器件设置积分时间，或者通过软件设置积分阈值的方法实现，优选为通过软件设置积分阈值的方法。
步骤5)中的权值即比例参数，其值大小设置为0～1，优选为0.5。
本发明的工作原理如下：
基于STED显微镜的基本原理，当空心的抑制光束聚焦光斑与实心的激发光束聚焦光斑嵌套照射在样品表面时，两聚焦光斑重叠区域的荧光标记受激辐射将会减弱，其衰减率由抑制光强ISTED决定。特别地，在荧光标记受激辐射减弱的同时，相应区域的荧光寿命也会降低，其对应荧光寿命可以由如下公式表示：
τfl'＝1/(kfl+σISTED)
其中kfl＝1/τfl,τfl为荧光样品荧光标记原始寿命，σ为非线性系数。通常情况下，σ>>1。这意味着荧光寿命的非线性效应远比光强非线性效应明显；换句话说，使用较低的光强即可以产生很明显的荧光寿命差异。这也是所有g-STED显微镜可以采用较低的输入功率获取超分辨显微能力的理论前提。
为了实现超分辨显微成像，g-STED显微镜通常的作法是设置时间门，将短寿命荧光强度信号全部丢弃，仅保留长寿命荧光图像。这种作法虽然可以有效地减小荧光标记的点扩散函数，从而提高系统的分辨能力。但与此同时，荧光标记的实际荧光强度也因此减弱，从而降低了系统的信噪比，反而影响了系统的实际分辨能力。
系统的噪声主要来源于以下几个方面：光电感应器件暗电流噪声、光学系统杂散光和背景辐射噪声，以及统计泊松噪声等。由于长寿命荧光图像和短寿命荧光图像获取时间的同时性，所观察的也是荧光样品中相同的区域，可以认为二者的噪声特性完全相同，因此可以通过二者相减差分的方法降低系统噪声，从而提高系统的信噪比。与此同时，长寿命荧光图像和短寿命荧光图像的点扩散函数不尽相同：在本发明中，长寿命荧光图像的点扩散函数半高全宽(full-width-half-maximum，FWHM)小于短寿命荧光图像。如果对二者进行傅里叶变换，即可以得到对应的系统光学传递函数。由于差分本身是一个线性过程，因此本发明的系统光学传递函数可以通过长寿命荧光图像的系统光学传递函数与加权的短寿命荧光图像的系统光学传递函数相减得到。通过调节合适的比例参数，可以使本发明的系统光学传递函数中的高频分量相对于原有的系统光学传递函数相对提高。由于系统光学传递函数中的高频分量对应于可分辨荧光样品细节的能力。因此，高频分量的提高本身也意味着更高的极限分辨能力。通过上述方法，相较于原有的g-STED显微镜，本发明可以提高系统极限分辨能力约30％。
本发明还提供了基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，包括：
沿激发光束光路依次布置的第一激光器和第一偏振态转换器；
沿抑制光束光路依次布置的第二激光器、位相编码器和第二偏振态转换器；
用于对所述激发光束和抑制光束进行聚焦，并收集荧光样品发出的荧光信号的大数值孔径显微物镜；
用于扫描荧光样品的扫描器；
用于感应所述荧光强度的光电感应器件；
以及用于信号分析处理的计算机。
本发明的显微装置还包括：
用于将激发光束和抑制光束合束的第一二色镜；
以及用于将激发光束和抑制光束导入所述大数值孔径显微物镜的第二二色镜；
用于对所述大数值孔径显微物镜收集的荧光信号进行聚焦的凸透镜；以及位于所述凸透镜的焦平面上，用于遮挡理想焦点外荧光散射噪声的针孔。
其中，所述的第一激光器、位相编码器、大数值孔径显微物镜、二色镜、凸透镜、针孔和光电感应器件位于同轴光路上。凸透镜和针孔与所观察的荧光样品面处于共轭位置。
其中，所述的第一激光器和第二激光器为能发射波长为380～780nm内任意波长的可见单色光的激光器，优选波长由所观察荧光样品的荧光吸收与发射光谱决定。激光器出射为准直光。所述的第一激光器输出功率为5～20mW，所述的第二激光器输出功率为20～100mW。
其中，所述的第一偏振态转换器和第二偏振态转换器在现有技术条件下可以有多种选择，优选为二分之一玻片与四分之一玻片组合而成，工作波长由入射光束中心波长决定。
其中，所述的位相编码器在现有技术条件下可以有多种选择，如位相板(Phase Plate，PP)、空间光调制器(Spatial Light Modulator，SLM)等，优选为位相板。
其中，所述的大数值孔径显微物镜，是指数值孔径在0.8～0.95的非浸没式显微物镜，或数值孔径在1.2～1.4的浸没式显微物镜，显微物镜放大倍率为80～100倍，优选为数值孔径为1.4的100倍放大浸油式显微物镜，此时浸没油的折射率为1.518，大数值孔径显微物镜应为平场复消色差显微物镜。
其中，所述的第一二色镜和第二二色镜，其镜整体面型曲率半径应大于150m，面型峰谷值(peak and valley，PV)小于四分之一激发光束波长，面型表面粗糙度(Roughness Measurement of the Surface，RMS)小于八分之一激发光束波长。
其中，所述的凸透镜为100～400mm焦距的凸透镜，凸透镜的口径应大于所选大数值孔径显微物镜的出瞳。
其中，所述的光电感应器件在现有技术条件下可以有多种选择，如光电池、光电二极管、光电倍增管、雪崩式光电管、电子倍增式电荷耦合器件(Electron Multiplying Charge-Coupled Device，EM-CCD)等，为保证系统信嗓比，优选为光电倍增管或雪崩式光电管。
其中，所述的扫描器在现有技术条件下可以有多种选择，可以为二维扫描移动平台或二维扫描振镜，也可以为二者的组合结构，为保证扫描速度，优选为组合结构。
相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)更高的系统极限分辨率；
(2)更高的系统信噪比；
(3)系统改动小，结构简单；
(4)成像速度与原有共聚焦系统相当。
附图说明
图1为本发明的基于荧光寿命差分的超分辨显微装置的结构示意图。
图2为本发明的第一偏振态转换器和第二偏振态转换器的结构示意图；
图3为本发明的涡旋位相编码示意图；
图4为本发明的聚焦光斑光强分布示意图；
图5为本发明的系统光学传递函数示意图。
图中：
第一激光器1，第二激光器2，第一偏振态转换器3，第二偏振态转换器4，位相编码器5，第一二色镜6，第二二色镜7，大数值孔径显微物镜8，凸透镜9，针孔10，光电感应器件11，扫描器12，荧光样品13，计算机14，二分之一玻片a，四分之一玻片b，二维扫描移动平台c，二维扫描振镜d。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
如图1所示，一种基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，包括：
第一激光器1，第二激光器2，第一偏振态转换器3，第二偏振态转换器4，位相编码器5，第一二色镜6，第二二色镜7，大数值孔径显微物镜8，凸透镜9，针孔10，光电感应器件11，扫描器12，荧光样品13，计算机14。针孔10和光电感应器件11与荧光样品13处于共轭位置。
所述的所有光学元件和荧光样品：包括第一激光器1，第二激光器2，第一偏振态转换器3，第二偏振态转换器4，位相编码器2，第一二色镜6，第二二色镜7，大数值孔径显微物镜8，凸透镜9，针孔10，光电感应器件11，荧光样品13，均位于同轴光路上。
第一激光器1发出用于激发荧光样品13产生荧光的激发光束，并经过第一偏振态转换器3转换为圆偏振光；与之相对应，第二激光器2发出抑制荧光样品13产生荧光的抑制光束，并经过第二偏振态转换器4同样转换为圆偏振光。第一激光器1和第二激光器2所发出的激光波长由荧光样品13荧光标记的性质决定：激发光束的波长应位于荧光标记的荧光吸收光谱带内，抑制光束的波长应位于荧光标记的荧光发射光谱带内，且抑制光束的波长应长于荧光发射峰值波长。为保证激发与抑制效率，第一激光器1输出功率应为5～20mW，第二激光器2输出功率为20～100mW。
如图2所示，第一偏振态转换器3和第二偏振态转换器4可以采用相同的架构，并且在现有技术条件下可以有多种选择，优选为二分之一玻片a与四分之一玻片b组合而成。第一偏振态转换器3和第二偏振态转换器4的不同在于：二者的中心工作波长分别对应于第一激光器1和第二激光器2所发出的激光波长。
与激发光束不同，由第二激光器2发出的抑制光束，在通过第二偏振态转换器4转换为圆偏振光前，还需要进一步通过位相编码器5进行涡旋位相编码，如图3所示。所述的涡旋位相编码，是指对于一个横截面中心对称的圆形入射光束，以光束中心点为圆心，对横截面内的光束产生0～2π的涡旋位相延迟，位相延迟量仅与截面内特定点的角向大小有关，而与该点到到圆心的距离无关。可用如下公式加以表示：
其中Δα为位相延迟量，为角向大小。
激发光束和抑制光束在通过第一二色镜6合束后，进一步通过第二二色镜7折转光路。为避免二色镜面型误差带入附加波相差对最终结果造成影响，对第一二色镜6和第二二色镜7的面型有着严格的要求。具体如下：其镜整体面型曲率半径应大于150m，面型峰谷值(peak and valley，PV)小于四分之一激发光束波长，面型表面粗糙度(Roughness Measurement ofthe Surface，RMS)小于八分之一激发光束波长。合束后的光束最终被导入大数值孔径显微物镜8。所述的大数值孔径显微物镜8，是指数值孔径在0.8～0.95的非浸没式显微物镜，或数值孔径在1.2～1.4的浸没式显微物镜，显微物镜放大倍率为80～100倍，优选为数值孔径为1.4的100倍放大浸油式显微物镜，此时浸没油的折射率为1.518，大数值孔径显微物镜应为平场复消色差显微物镜。
光束通过大数值显微物镜8后，将被聚焦到大数值显微物镜8物方焦点上即荧光样品13表面。焦点在焦平面的分布可以由基于矢量光束理论的Debye积分公式计算得到。激发光束和抑制光束通过大数值孔径显微物镜8聚焦后将分别形成实心聚焦光斑和空心聚焦光斑(如图4所示)。所述的实心聚焦光斑，是指聚焦光斑光强呈高斯或类高斯状分布，且聚焦光斑内峰值光强位于理想物方焦点处；所述的空心聚焦光斑，是指聚焦光斑光强围绕理想物方焦点呈面包圈状分布，且理想物方焦点处光强小于聚焦光斑内峰值光强的1％。
荧光样品13在受到激发光束和抑制光束同时照射后，其中的荧光标记会产生荧光激发现象。被激发出的荧光，将通过相同的大数值孔径显微物镜8进行反向收集。收集到的荧光信号通过第二二色镜7后，将进一步被凸透镜9聚焦到针孔10上，完成整个共焦显微镜的光学架构，并最终被光电感应器件11感应对应成像位置的荧光强度。其中，所述的光电感应器件11在现有技术条件下可以有多种选择，如光电池、光电二极管、光电倍增管、雪崩式光电管、电子倍增式电荷耦合器件(ElectronMultiplying Charge-Coupled Device，EM-CCD)等，为保证系统信嗓比，优选为光电倍增管或雪崩式光电管。
通过扫描器12扫描整个荧光样品13表面，即可获取整幅荧光强度图像。其中所述的扫描器12在现有技术条件下可以有多种选择，可以为二维扫描移动平台c或二维扫描振镜d，也可以为二者的组合结构，为保证扫描速度，优选为组合结构。
需要指出的是，当空心的抑制光束聚焦光斑与实心的激发光束聚焦光斑嵌套照射在荧光样品13表面时，荧光样品13中的荧光标记荧光激发现象与常规状态不同：两聚焦光斑重叠区域的荧光标记受激辐射将会减弱，其衰减率由抑制光强ISTED决定。特别地，在荧光标记受激辐射减弱的同时，相应区域的荧光寿命也会降低，其对应荧光寿命可以由如下公式表示：
τfl'＝1/(kfl+σISTED)
其中kfl＝1/τfl,τfl为荧光样品荧光标记原始寿命，σ为非线性系数。通常情况下，σ>>1。这意味着荧光寿命的非线性效应远比光强非线性效应明显；换句话说，使用较低的光强即可以产生很明显的荧光寿命差异。
荧光样品13中荧光标记的荧光寿命信息，可以有多种方法获得。可以通过在线实时获取荧光强度信号随时间变化的信息后通过曲线拟合得到，也可以在记录完整强度信息后通过时间相关单光子记数算法(TimeCorrelated Single Photon Counting，TCSPC)得到，由于通过TCSPC算法仅需要软件支持，使用计算机14即可以完成，不需要复杂的硬件同步单元，可以降低系统复杂度，并节约成本，因此优选通过TCSPC算法得到。
在得到荧光样品13中荧光标记的荧光寿命后，可以通过设置时间门的方法对长寿命荧光图像和短寿命荧光图像进行分离。所述的时间门，可以为在光路上设置快门，也可以通过电路对光电感应器件设置积分时间，或者通过计算机14由软件设置积分阈值的方法实现。考虑到成本和系统复杂性，优选为通过软件设置积分阈值的方法。如前所述，由于激发光束和抑制光束聚焦光斑的光强分布不同，因此，长寿命的荧光信号相比于短寿命荧光信号会更加集中于荧光标记的中心区域，进而导致长寿命荧光图像和短寿命荧光图像的点扩散函数的差异。一般而言，长寿命荧光图像的点扩散函数半高全宽(full-width-half-maximum，FWHM)要小于短寿命荧光图像的点扩散函数。使用如下公式：
I(r)＝I1(r)-αI2(r)
进行差分即可有效减小最终得到的系统点扩散函数的大小，进而提高系统的分辨能力。其中，r为位置坐标，I1和I2分别为长寿命和短寿命荧光图像的点扩散函数，α为比例参数，其值大小设置为0～1，优选为0.5。
也可以从系统的光学传递函数角度对系统分辨能力的提高做进一步的说明。如图5所示，长寿命和短寿命荧光图像的系统光学传递函数分别由图中实线和虚线表示。由于光学传递函数为点扩散函数的傅里叶变换，根据傅里叶变换性质，差分后的系统光学传递函数即为长寿命和短寿命荧光图像的系统光学传递函数线性相减，所得到的结果由图5中的点划线表示。从图5中可以看出，相对于原有图像，最终图像的系统光学传递函数，其高频分量相对值要强于原有图像的系统光学传递函数，因此可以认为最终图像可以获得更好的图像分辨率。经过计算可以表明，使用本发明所述方法，最终图像分辨率的理论极限相对于g-STED可以提高约15％～30％。
另一方面，在实际系统中，图像分辨率还受到系统信噪比的影响。系统的噪声主要来源于以下几个方面：光电感应器件暗电流噪声、光学系统杂散光和背景辐射噪声，以及统计泊松噪声等。由于长寿命荧光图像和短寿命荧光图像获取时间的同时性，所观察的也是荧光样品中相同的区域，可以认为二者的噪声特性完全相同，因此可以通过二者相减差分的方法降低系统噪声，从而提高了系统的信噪比，进一步改善了图像分辨率。
Claims (10)
1.一种基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将圆偏振光作为激发光束，使用经涡旋位相编码的圆偏振光作为抑制光束，所述激发光束通过大数值孔径显微物镜聚焦形成实心聚焦光斑，所述抑制光束通过所述大数值孔径显微物镜聚焦形成空心聚焦光斑，两光斑同时对荧光样品进行扫描；
2)利用所述大数值孔径显微物镜收集扫描荧光样品发出的荧光，并通过光电感应器件得到整幅荧光强度图像；
3)通过分析所述荧光强度图像的荧光强度信息，得到相应的荧光寿命信息；
4)设置时间门，对所述荧光寿命信息中的长寿命荧光图像和短寿命荧光图像进行分离；
5)设置权值，用所述的长寿命荧光图像减去加权的短寿命荧光图像，得到最终的超分辨显微图像。
2.如权利要求1所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，其特征在于，所述激发光束的波长应位于所述荧光样品上的荧光标记的荧光吸收光谱带内，所述抑制光束的波长应位于所述荧光样品上的荧光标记的荧光发射光谱带内，且所述抑制光束的波长应长于荧光发射峰值波长。
3.如权利要求2所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，其特征在于，对所述荧光强度信息通过时间相关单光子记数算法得到所述的荧光寿命信息。
4.如权利要求3所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，其特征在于，所述权值设置为0～1。
5.如权利要求4所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，其特征在于，所述权值为0.5。
6.一种基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，其特征在于，包括：
沿激发光束光路依次布置的第一激光器和第一偏振态转换器；
沿抑制光束光路依次布置的第二激光器、位相编码器和第二偏振态转换器；
用于对所述激发光束和抑制光束进行聚焦，并收集荧光样品发出的荧光信号的大数值孔径显微物镜；
用于扫描荧光样品的扫描器；
用于感应所述荧光强度的光电感应器件；
以及用于信号分析处理的计算机，所述的计算机通过对荧光强度处理得到荧光寿命信息，设置时间门分离荧光寿命信息中的长寿命荧光图像和短寿命荧光图像，并用所述的长寿命荧光图像减去加权的短寿命荧光图像，最后处理得到超分辨显微图像。
7.如权利要求6所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，其特征在于，所述第一偏振态转换器和第二偏振态转换器均由二分之一玻片和四分之一玻片组合而成。
8.如权利要求7所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，其特征在于，所述位相编码器为位相板。
9.如权利要求8所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，其特征在于，所述扫描器为二维扫描移动平台或二维扫描振镜。
10.如权利要求9所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，其特征在于，所述超分辨显微装置还包括用于对所述大数值孔径显微物镜收集的荧光信号进行聚焦的凸透镜，以及位于所述凸透镜的焦平面上，用于遮挡理想焦点外荧光散射噪声的针孔。
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