CN112710641B - 基于电光调制技术的偏振调制荧光差分显微成像方法和装置 - Google Patents

基于电光调制技术的偏振调制荧光差分显微成像方法和装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于电光调制技术的偏振调制荧光差分显微成像装置和方法，包括产生激发光束的照明系统，收集样品发出荧光信号的探测系统，以及用于控制和信号处理的计算机，所述照明系统包括依次设置的：激光器，用于发出激光光束；电光调制模块，用于调制线偏振光在两个不同偏振状态间快速转换；涡旋半波片，用于将线偏振光分别调制为径向偏振光和角向偏振光，经物镜聚焦后形成照明样品的实心光斑和空心光斑。本发明实现了实心光斑和空心光斑的快速转换，在很大程度上提升了荧光差分显微成像系统的成像速度。

Description

基于电光调制技术的偏振调制荧光差分显微成像方法和装置
技术领域
本发明属于共聚焦显微成像领域，特别涉及到一种基于电光调制技术实现快速相位调制荧光差分显微成像的方法和装置。
背景技术
传统的远场荧光显微技术由于受到衍射极限的限制，能够实现的分辨率通常很难低于二分之一波长，因此在生物医学、纳米技术以及材料等领域的应用受到很大的限制。为了突破这一限制，从上个世纪90年代开始，相关研究人员便提出了例如受激辐射损耗超分辨显微技术(STED)，单分子定位超分辨显微技术(SMS)等很多超分辨显微技术。在这些超分辨显微技术中，荧光差分显微技术(FED)作为近期提出的超分辨显微技术，以共聚焦显微成像技术为基础，通过两个特定的激发光斑扫描待测样品得到两幅图像，并对得到的两幅图像进行差分运算实现图像分辨率的提升。实验证明荧光差分显微成像技术在远场可以实现小于四分之一波长的分辨率，并具有较高的信噪比，此外由于无需高功率的照明光，可以在很大程度上减小可能带来的光漂白和光损伤，减少可能对样品造成的伤害。
然而，荧光差分显微成像技术存在成像速度受到限制无法对时间分辨率要求较高的样品成像，以及成像过程中可能出现运动伪影的问题。荧光差分显微成像系统中通常使用相位调制作为获得空心光斑的方式，采用0到2π的涡旋相位板或加载相同0到2π的涡旋相位图案的空间光调制器调制一个与之同向的圆偏振光，从而得到所需的空心光斑，如公开号CN 110118726 A和CN 105510290 A的申请文件公开的技术方案。由于成像过程中需要用实心和空心光斑分别对待测样品进行扫描，当使用涡旋相位板作为相位调制方式时，需要用分光棱镜将光束分成两路，一路经过涡旋相位板调制为空心光斑，另一路不经过相位调制为实心光斑，用两路光束分别对待测样品进行扫描，这样系统的复杂程度以及调节难度都会比较高；当使用空间光调制器作为相位调制方式时，通常采用改变空间光调制器表面加载的相位调制图案的方式实现实心和空心光斑之间的转换，由于空间光调制本身存在一定的响应时间，并且用软件程序控制空间光调制器加载的相位调制图案在两种模式之间转换也需要一定时间，因此实心和空心光斑之间的转换需要一定时间，用实心光斑和空心光斑分别扫描待测样品会花费较长的时间并且会出现运动伪影的现象，从而会限制荧光差分显微成像的成像速度和对运动待测样品的观测。要提升该技术的成像速度，解决这一问题的关键是减少实心和空心光斑转换所需的时间。
发明内容
本发明提供了一种基于电光调制技术的偏振调制荧光差分显微成像装置。本装置结构紧凑简单，基于普通荧光差分显微成像系统即可进行改装；采用偏振调制方式获取空心光斑，简化实验装置；实现了实心和空心光斑的快速转换，在很大程度上提升了荧光差分显微成像系统的成像速度。
本发明在传统的荧光差分显微成像系统(图1)的基础上，提出了利用电光调制技术实现照明光偏振状态的改变，由于不同偏振状态的照明光在经过没有相位调制的普通显微光学系统后其分布情况存在差异，角向偏振光会产生一个空心光斑，其他偏振光例如径向偏振光会产生一个实心光斑，并且电光调制器具有很高的响应速度，工作频率最高可以达到100MHz，因此能够实现实心和空心光斑之间的高速转换，从而减少系统成像所需的时间，进而实现荧光差分显微成像的速度提升。
一种基于电光调制技术的偏振调制荧光差分显微成像装置，包括产生激发光束的照明系统，收集样品发出荧光信号的探测系统，以及用于控制和信号处理的计算机，所述照明系统包括依次设置的：
激光器，用于发出激光光束；
电光调制模块，用于调制线偏振光在两个不同偏振状态间快速转换；
涡旋半波片，用于将线偏振光调制分别为径向偏振光和角向偏振光，经物镜聚焦后形成照明样品的实心光斑和空心光斑。
优选的，所述的电光调制模块包括用于调制激发光偏振状态的电光调制器和用于控制电光调制器的高电压驱动模块，所述高电压驱动模块受控于所述计算机。
优选的，所述激发光通过一偏振片变成线偏振光，所述偏振片的偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为45°。
优选的，光束通过电光调制器，当电光调制器不施加控制电压时光束的偏振状态不发生变化，当电光调制器施加大小为电光调制器的半波电压Vπ大小的电压时，光束转换为偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为-45°的线偏振光，通过施加具有间隔的大小为Vπ的高频脉冲电压，实现光束在偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为45°和-45°的两个状态之间的快速转换。
优选的，光束通过涡旋半波片，调节涡旋半波片的0°快轴角度与电光调制器的晶体光轴夹角为45°，当光束偏振方向与涡旋半波片的0°快轴角度平行时，得到径向偏振光，当方向垂直时，得到角向偏振光。
具体的本申请装置中，照明系统包括：
激光器，用于发出激光光束；
用于保证激光出射偏振方向不变的保偏光纤；
由于将经保偏光纤单模输出的激光光源准直扩束的准直镜；
用于将激发光调整为偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为45°的偏振片；
用于调制激发光偏振状态的电光调制器，以及用于控制电光调制器的高电压驱动模块；
用于实现激发光偏振调制的0°快轴角度平行于偏振片偏振方向的涡旋半波片；
用于反射激发光、透射荧光的二色镜；
用于实现对样品扫描的振镜系统；
用于实现对激光光束扩束和点扫描的4f系统，包括扫描镜和场镜；
用于调节激光光路，使光路变得紧凑的反射镜；
用于聚焦激发光并收集荧光的物镜。
本申请中，探测系统包括：
用于滤除经样品面反射回来的激光，仅使荧光样品发出的荧光通过参与成像的滤波片；
用于将荧光样品发出的荧光会聚到探测器阵列上的透镜；
由多个光电探测器组成，用于将探测到的光信号转换为电信号并传送到计算机的探测器阵列。
同时，计算机还用于控制激光光源、电光调制器、振镜系统和探测阵列。
另外，本申请还提供一种基于电光调制技术的偏振调制荧光差分显微成像方法，包括：
1)激光器发出的激光光束准直后调制为线偏振光；
2)通过电光调制模块调制线偏振光在两个不同偏振状态间快速转换；
3)利用涡旋半波片将线偏振光调制为径向偏振光和角向偏振光，经物镜聚焦后形成照明样品的实心光斑和空心光斑，并激发荧光样品产生荧光；
4)收集荧光信号，分别得到实心光斑和空心光斑的图像，差分处理后得到显微成像结果。
优选的，所述的电光调制模块包括用于调制激发光偏振状态的电光调制器和用于控制电光调制器的高电压驱动模块，所述高电压驱动模块受控于计算机。
优选的，激发光通过一偏振片变成线偏振光，所述偏振片的偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为45°。
优选的，光束通过电光调制器，当电光调制器不施加控制电压时光束的偏振状态不发生变化，当电光调制器施加大小为电光调制器的半波电压Vπ大小的电压时，光束转换为偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为-45°的线偏振光，通过施加具有间隔的大小为Vπ的高频脉冲电压，实现光束在偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为45°和-45°的两个状态之间的快速转换。
优选的，光束通过涡旋半波片，调节涡旋半波片的0°快轴角度与电光调制器的晶体光轴夹角为45°，当光束偏振方向与涡旋半波片的0°快轴角度平行时，得到径向偏振光，当方向垂直时，得到角向偏振光。
本发明的原理如下：
本发明在传统的荧光差分显微成像系统的基础上，用偏振调制代替相位调制作为空心光斑的获取方式，准直扩束后激光首先经过偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°的偏振片调节为线偏振光，然后进入电光调制器。激光在电光调制器的控制下实现在偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角为正负45°的线偏振光之间的快速转换，经过0°快轴角度与电光调制器的晶体光轴夹角为45°的涡旋半波片后，激光根据偏振方向与涡旋半波片的0°快轴角度平行或垂直分别得到径向和角向偏振光，经过光学显微成像系统后径向和角向偏振光分别会聚为实心和空心光斑，用实心和空心光斑分别对样品进行扫描并将得到的成像结果按一定比例相减得到荧光差分显微成像结果。
电光调制器的工作原理为电光效应，即电光材料在直流或交流电场的作用下其折射率发生变化的现象，对于各向异性的电光材料，电场会影响材料在各个方向上的折射率分布。普克尔效应指折射率的变化和所加电场成正比的效应，也可称为线性电光效应。在外电场作用下，电光材料的折射率n(E)是外电场振幅E的函数，并随着E的变化而发生微小变化，可以写为：
Figure BDA0002754260260000051
任何一个偏振光可以分解成两个正交的偏振分量，在各向异性的介质中，这两个偏振分量一般被分解到折射率椭球的两个主折射率轴上，设两个偏振分量所对应的折射率分别为n1和n2，则它们的传播速度分别为c0/n1和c0/n2，其中c0为真空中的光波速度。由于两个分量传播速度的差异，使一个分量传播到器件的另一端时，在时间上会超前或落后于另一个偏振分量，从而构成相位延迟，改变出射光的偏振态。当在各向异性材料上施加外电场E时，对于普克尔效应，光通过长度为L的调制器时，两个偏振分量产生的相位差为：
Figure BDA0002754260260000052
Figure BDA0002754260260000061
对于外加电场方向和光的传播方向垂直的横向调制器，其电场E＝V/d，其中V为所加电压，d为两个电极之间的距离，可以把相位差的表达式写为：
Figure BDA0002754260260000062
其中Γ0＝k0(n1-n2)L为器件自身所具有的相位差，半波电压为
Figure BDA0002754260260000063
Figure BDA0002754260260000064
相位延迟量和所加电压成线性关系，当电压为Vπ时，相位延迟量为π。
本专利中调节入射激光为偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角45°的线偏振光，在这种情况下可以将激光看作偏振方向分别为平行于光轴和垂直于光轴的两束振幅相等且偏振方向正交的分量的和，施加电压使电光调制器对光束进行调制时，两个分量之间的相对相位差发生变化。当两分量的相位相同或相差180°时激光为线偏振光，因此当施加电压大小为Vπ时，两分量之间的相位差变化180°，在相位相同或相差180°两种状态之间转换，表现为在偏振方向互相垂直的两种状态下转换的线偏振光。
在显微成像系统中，显微物镜焦点附近的光斑强度分布通常受到偏振状态，输入光斑形状，透镜结构和相位板结构的影响。当使用一个高数值孔径的显微物镜时，根据矢量衍射理论，可以将焦点附近的电场向量分布表示为：
Figure BDA0002754260260000065
Figure BDA0002754260260000066
其中
Figure BDA0002754260260000067
是点
Figure BDA0002754260260000068
处的电场向量，
Figure BDA0002754260260000069
是原点在焦点处的柱坐标分布，C是归一化的常量，
Figure BDA00027542602600000610
是输入光的振幅函数，通常可以表示为1或基本高斯函数的变形，
Figure BDA00027542602600000611
是表示成像透镜结构的3×3矩阵，通常可以表示为
Figure BDA00027542602600000612
[px；py；pz]是表示输入光偏振状态的单位矩阵向量。
光学显微成像系统中，当入射光为角向偏振光时，通过代入上述公式，可以计算得到在焦点处光斑在水平面的分布分别为空心光斑，当入射光为其他状态的偏振光例如径向偏振光时，焦点处的光斑在水平面的分布为实心光斑。涡旋半波片对给定方位角的快轴方向可以表示为：
Figure BDA0002754260260000071
其中
Figure BDA0002754260260000072
为给定方位角，δ为
Figure BDA0002754260260000073
时的快轴方向，m为涡旋半波片的阶次，通常可以取m＝1或m＝2，本专利中采用m＝1的涡旋半波片。对于m＝1的涡旋半波片，当入射光的偏振方向与其0°快轴角度方向平行时，输出光为径向偏振光，当入射光的偏振方向与0°快轴角度方向垂直时，输出光为角向偏振光。
将电光调制技术和偏振调制的荧光差分显微成像技术相结合，利用电光调制器实现输入光在与涡旋半波片的0°快轴角度方向平行和垂直之间的快速转换，在经过涡旋半波片后激光在径向和角向偏振光之间快速转换，并在经过光学显微成像系统后得到的光斑在实心光斑和空心光斑之间快速转换。在很短时间内得到待测样品在实心光斑和空心光斑两种模式下照明得到的图像，从而在很大程度上减少了荧光差分显微成像所需的时间。
相对于现有的技术，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)在传统的荧光差分显微成像系统的基础上进行了简单的改进，系统较为简单，且适用于一切荧光差分显微成像系统；
(2)利用偏振调制作为将激发光调节为空心光斑的方法，与相位调制相比更加容易实现，简化了光学系统；
(3)利用电光调制技术实现激发光偏振状态的快速转换，只需控制电光调制器的施加电压即可实现，操作简单且所需时间短；
(4)利用电光调制技术实现激发光偏振状态的快速转换，减少了激发光在实心和空心两种分布状态下转换所需的时间，提升荧光差分显微成像的速度，实现实时成像。
附图说明
图1为传统的基于共聚焦成像系统和振镜扫描的荧光差分显微成像系统装置示意图；
其中，激光器1，准直透镜2，偏振片3，1/4波片4，反射镜5，反射镜5，0到2π的涡旋相位板6，1/2波片7，1/4波片8，二色镜9，振镜扫描系统10，扫描透镜11，场镜12，反射镜13，高数值孔径的物镜14，样品15，滤波片16，透镜17，探测器阵列18，计算机19。
图2为本发明中基于电光调制技术和偏振调制的荧光差分显微成像系统装置实例图；
图3为本发明中采用的电光调制器的对输入光偏振调制的示意图，显示了输入光两个偏振态之间引入的相位延迟随着施加电压的变化；
图4为本发明中采用的涡旋半波片的快轴方向分布示意图；
图5为当输入光为与涡旋半波片的0°快轴角度方向平行的线偏振光时经过涡旋半波片和光学系统会聚后得到的光斑强度分布示意图，(a)为水平平面光斑分布示意图，(b)为纵向平面光斑分布示意图；
图6为当输入光为与涡旋半波片的0°快轴角度方向垂直的线偏振光时经过涡旋半波片和光学系统会聚后得到的光斑强度分布示意图，(a)为水平平面光斑分布示意图，(b)为纵向平面光斑分布示意图；
图7为荧光差分显微成像中利用实心光斑照明得到的点扩散函数减去空心光斑照明得到的点扩散函数得到一个更小的实心点扩散函数的过程示意图，(a)为实心光斑照明得到的点扩散函数示意图；(b)为空心光斑照明得到的点扩散函数示意图；(c)为相减后半高全宽更小的点扩散函数示意图。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
如图2所示，一种基于电光调制技术和偏振调制的荧光差分显微成像系统装置，包括：638nm激光器1，准直透镜2，偏振片3，电光调制器20，高电压驱动模块21，涡旋半波片22，二色镜9，振镜扫描系统10，扫描透镜11，场镜12，反射镜13，高数值孔径的物镜14，样品15，滤波片16，透镜17，探测器阵列18，计算机19。
其中偏振片3用于将激发光的偏振状态调整至偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°的线偏振光，便于电光调制器的偏振调制；电光调制器20用于调制激发光的偏振状态，使其在与电光调制器的晶体光轴方向夹角为正负45°的线偏振光之间转换；涡旋半波片22用于将线偏振光调制为径向偏振光或角向偏振光；扫描透镜11和场镜12组成4f系统，用于使激发光的光束大小和物镜14的数值孔径相匹配，并保证在物镜入瞳位置为平行光；滤波片16的通光波段需要匹配样品的荧光波段；振镜扫描系统10的驱动需要和电光调制器20的驱动信号相匹配，对于每一个成像单元，获取实心和空心两种照明情况下的成像结果后，再控制振镜扫描系统对下一个成像单元扫描成像。
采用图2所示装置实现荧光差分显微成像的过程如下：
(1)激光器1发出的激发光经过准直透镜2准直并扩束后，经偏振片3后变成偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°的线偏振光；
(2)线偏振光进入电光调制器20进行偏振调制，在高电压驱动模块21的控制下，当驱动电压为0时激发光为偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°的线偏振光，当驱动电压为电光调制器的半波电压Vπ大小时激发光转变为偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角为-45°的线偏振光，随着驱动电压的变化，激发光在两种偏振方向的线偏振光之间快速转换，电光调制器可以在0.1-100MHz的共振频率之间工作，通常以20MHz作为工作频率，在该工作频率下可以在1μs让激发光转换20次，从而实现实时扫描FED成像；
(3)线偏振光进入涡旋半波片22进行偏振调制，当线偏振光的偏振方向和涡旋半波片的0°快轴角度平行时得到径向偏振光，当线偏振光的偏振方向和涡旋半波片的0°快轴角度垂直时得到角向偏振光；被调制相位后的激发光在经过二色镜9反射后进入振镜扫描系统10，在最终样品面实现二维扫描；从振镜扫描系统10出来的激发光经过扫描透镜11和场镜12组成的4f系统，调节光束大小使其与物镜14的数值孔径大小相匹配；激发光经过物镜14聚焦后径向偏振光得到实心光斑，角向偏振光得到空心光斑，激发光斑聚焦到荧光样品15上；
(4)在实心和空心光斑两种模式下快速转换的激发光照明荧光样品15后激发样品产生荧光，产生的荧光经过物镜14收集后经过反射镜13，场镜112，扫描透镜11以及振镜扫描系统10后入射到二色镜9上；二色镜9使荧光透射；透射的荧光经滤波片16滤除样品反射的激发光以及其他杂散光，只让荧光出射；出射的荧光经透镜17会聚后聚焦到探测器阵列18处；探测器阵列将光信号转换为电信号并将电信号传送至计算机19处；
(5)计算机19将探测器阵列18中每个探测器单元探测得到的信号做相应的图像处理后得到在实心或空心照明模式下一个物点所对应的成像结果，计算机19通过高电压驱动模块21控制电光调制器20实现激发光在实心和空心照明模式下的快速转换，计算机19得到两种照明模式下一个物点所对应的2种成像结果，按一定比例进行相减处理后得到一个物点对应的最终图像；
(6)振镜扫描系统10与计算机19相连，通过计算机控制振镜扫描系统对样品进行二维扫描，得到样品对应的二维图像。
如图3所示，对电光调制器所施加电压的变化会在输入光两个偏振态之间引入变化的相位延迟，对于偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为-45°的线偏振光，当电光调制器的驱动电压大小为电光调制器的半波电压Vπ时，会在输入光的两个偏振状态之间引入π大小的相位延迟，则线偏振光的偏振方向会转变为与电光调制器的晶体光轴夹角为45°，当驱动电压大小为0时，在输入光的两个偏振状态之间的相位延迟为0，线偏振光的偏振方向为与电光调制器的晶体光轴夹角为-45°，通过施加具有间隔的大小为Vπ的高频脉冲电压，能够实现光束在偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为45°和-45°的两个状态之间的快速转换。
如图4所示，涡旋半波片的快轴方向从0°到180°连续旋转变化，当入射光的偏振方向与涡旋半波片的0°快轴角度平行时，经过涡旋半波片的线偏振光转换为径向偏振光，当入射光的偏振方向与涡旋半波片的0°快轴角度垂直时，经过涡旋半波片的线偏振光转换为角向偏振光。
如图5所示，当输入光为偏振方向与涡旋半波片的0°快轴角度平行的线偏振光时，经过涡旋半波片后转换为径向偏振光，径向偏振光经过光学系统会聚后得到实心光斑，根据矢量衍射理论计算得到实心光斑在光学系统焦点附近的具体分布情况，实心光斑在水平平面的分布情况如图5(a)所示，在纵向平面的分布情况如图5(b)所示。
如图6所示，当输入光为偏振方向与涡旋半波片的0°快轴角度垂直的线偏振光时，经过涡旋半波片后转换为角向偏振光，角向偏振光经过光学系统会聚后得到空心光斑，根据矢量衍射理论计算得到空心光斑在光学系统焦点附近的具体分布情况，空心光斑在水平平面的分布情况如图6(a)所示，在纵向平面的分布情况如图6(b)所示。
如图7所示，用实心点扩散函数减去空心点扩散函数得到一个更小的实心点扩散函数的过程，径向偏振光经过光学系统会聚后得到的实心光斑照明荧光样品后激发样品产生荧光的实心点扩散函数如图7(a)所示，角向偏振光经过光学系统会聚后得到的空心光斑照明荧光样品后激发样品产生荧光的空心点扩散函数如图7(b)所示，将两种荧光信号相减后得到最终成像结果，实心点扩散函数与空心点扩散函数相减后得到的半高全宽更小的实心点扩散函数如图7(c)所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种基于电光调制技术的偏振调制荧光差分显微成像装置，包括产生激发光束的照明系统，收集样品发出荧光信号的探测系统，以及用于控制和信号处理的计算机，其特征在于，所述照明系统包括依次设置的：
激光器，用于发出激光光束；
电光调制模块，用于调制线偏振光在两个不同偏振状态间快速转换；
涡旋半波片，用于将线偏振光分别调制为径向偏振光和角向偏振光，经物镜聚焦后形成照明样品的实心光斑和空心光斑；
所述的电光调制模块包括用于调制激发光偏振状态的电光调制器和用于控制电光调制器的高电压驱动模块，所述高电压驱动模块受控于所述计算机；
光束通过电光调制器，当电光调制器不施加控制电压时光束的偏振状态不发生变化，当电光调制器施加大小为电光调制器的半波电压Vπ大小的电压时，光束转换为偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为-45°的线偏振光，通过施加具有间隔的大小为Vπ的高频脉冲电压，实现光束在偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为45°和-45°的两个状态之间的快速转换；
光束通过涡旋半波片，调节涡旋半波片的0°快轴角度与电光调制器的晶体光轴夹角为45°，当光束偏振方向与涡旋半波片的0°快轴角度平行时，得到径向偏振光，当方向垂直时，得到角向偏振光；径向偏振光和角向偏振光镜物镜聚焦后光分别形成照明样品为实心光斑和空心光斑，并激发荧光样品产生荧光，
所述探测系统收集荧光信号，分别得到实心光斑和空心光斑的图像，差分处理后得到显微成像结果。
2.根据权利要求1所述的基于电光调制技术的偏振调制荧光差分显微成像装置，其特征在于，所述激发光通过一偏振片变成线偏振光，所述偏振片的偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为45°。
3.一种基于电光调制技术的偏振调制荧光差分显微成像方法，其特征在于，包括：
1)激光器发出的激光光束准直后调制为线偏振光；
2)通过电光调制模块调制线偏振光在两个不同偏振状态间快速转换；
所述的电光调制模块包括用于调制激发光偏振状态的电光调制器和用于控制电光调制器的高电压驱动模块，所述高电压驱动模块受控于计算机；
3)利用涡旋半波片将线偏振光调制为径向偏振光和角向偏振光，经物镜聚焦后形成照明样品的实心光斑和空心光斑，并激发荧光样品产生荧光；
光束通过电光调制器，当电光调制器不施加控制电压时光束的偏振状态不发生变化，当电光调制器施加大小为电光调制器的半波电压Vπ大小的电压时，光束转换为偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为-45°的线偏振光，通过施加具有间隔的大小为Vπ的高频脉冲电压，实现光束在偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为45°和-45°的两个状态之间的快速转换；
光束通过涡旋半波片，调节涡旋半波片的0°快轴角度与电光调制器的晶体光轴夹角为45°，当光束偏振方向与涡旋半波片的0°快轴角度平行时，得到径向偏振光，当方向垂直时，得到角向偏振光；径向偏振光和角向偏振光镜物镜聚焦后光分别形成照明样品为实心光斑和空心光斑，并激发荧光样品产生荧光，4)收集荧光信号，分别得到实心光斑和空心光斑的图像，差分处理后得到显微成像结果。
4.根据权利要求3所述的基于电光调制技术的偏振调制荧光差分显微成像方法，其特征在于，激发光通过一偏振片变成线偏振光，所述偏振片的偏振方向与电光调制器的晶体光轴夹角为45°。
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