CN110849849A - 基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置及方法,涉及光学成像技术领域,装置包括光源、激发滤光片、液晶偏振旋转器、二向色镜、物镜、发射滤光片、波片、检偏器、成像透镜、相机、液晶控制器和计算机。方法包括:光源的出射光束经液晶偏振旋转器变为线偏振光,线偏振激发光入射到样品后激发出荧光,荧光经物镜、发射滤光片、波片和检偏器后进入相机靶面成像,在此过程中计算机控制液晶控制器驱动液晶偏振旋转器调制入射激发光偏振角度,并控制相机采集一系列荧光偏振图像,之后根据一系列荧光偏振图像计算获得各荧光参数图像。本发明具有成像速度快、分辨率高、宽视场、调制精度高等优点,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及光学成像技术领域,特别涉及一种基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置及方法。
背景技术
荧光显微成像技术是通过对样品进行特异性标记荧光蛋白、荧光染色剂等,实现特定目标的荧光成像,是目前最常用的光学测量方法之一,被广泛应用于生命科学、纳米技术等研究。荧光具有多个特征参量,包括光谱、强度、寿命、偏振等,大多数荧光成像方法对荧光强度参量进行测量,通过荧光强度获得特定荧光标记目标的形状、尺寸、数量等信息。荧光偏振是另外一个重要物理量,当采用线偏振光对标记荧光蛋白的生物染色样品进行荧光激发时,空间偶极取向与入射激发光偏振角度平行的荧光分子能够被激发出荧光,且激发出的荧光的偏振角度与入射光相同,空间偶极取向与入射激发光偏振角度垂直的荧光分子将被抑制,无法被激发出荧光。
目前现有的荧光显微成像方法主要有宽场荧光显微成像技术、结构光照明显微成像技术、激光扫描共聚焦技术和双光子荧光显微成像技术等。其中,普通宽场荧光显微成像技术分辨率较低;激光扫描共聚焦技术和双光子荧光显微成像技术采用点扫描,成像速度相对较慢;结构光照明显微成像技术成像系统较为复杂且成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成像速度快、分辨率高、宽视场、调制精度高的快速调制荧光偏振显微成像装置及方法。
实现本发明目的的技术解决方案为:一种基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置,包括光源,沿光源出射光束方向依次同轴设置的激发滤光片、液晶偏振旋转器和二向色镜,沿二向色镜反射光方向依次同轴设置的物镜、置于载物台上的待测生物荧光染色样品,以及沿所述反射光经二向色镜透射的方向依次同轴设置的发射滤光片、第一波片、检偏器、成像透镜、相机;所述相机与计算机连接,液晶偏振旋转器通过液晶控制器与计算机连接;
所述光源发出的光束经激发滤光片滤波后进入液晶偏振旋转器,之后经二向色镜反射并透过物镜后对载物台上的待测生物荧光染色样品进行照明,激发产生的荧光经物镜、二向色镜透射后,依次通过发射滤光片、第一波片、检偏器、成像透镜进入相机,在此过程中,计算机通过液晶控制器驱动液晶偏振旋转器工作以对光源出射光束的偏振角度进行调制,并控制相机采集待测生物荧光染色样品的荧光图像。
进一步地,所述激发滤光片的中心波长与待测生物荧光染色样品所采用的染色物质的激发波长一致。
进一步地,所述发射滤光片的中心波长与待测生物荧光染色样品所采用的染色物质的发射波长一致。
进一步地,所述液晶偏振旋转器包括沿光源出射光束方向依次同轴设置的线偏振片、液晶相位延迟器和第二波片。
基于上述基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置的成像方法,包括以下步骤:
步骤1、搭建基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置;
步骤2、打开光源,其出射光束经激发滤光片形成窄带入射激发光,计算机驱动液晶偏振旋转器工作将所述窄带入射激发光调制为具有一定偏振角度的线偏振光,该线偏振光经二向色镜反射及物镜后入射到置于载物台上的待测生物荧光染色样品,激发产生荧光,该荧光经物镜、二向色镜透射后,依次通过发射滤光片、第一波片、检偏器、成像透镜进入sCMOS相机,计算机控制sCMOS相机采集待测生物荧光染色样品的荧光图像;
步骤3、计算机驱动液晶偏振旋转器对窄带入射激发光的偏振角度进行周期性调制,同时控制sCMOS相机采集图像,获得一系列待测生物荧光染色样品荧光图像并保存至计算机;
步骤4、计算机对所述一系列待测生物荧光染色样品荧光图像进行计算处理,获得待测生物荧光染色样品的各荧光参数图像,所述荧光参数包括荧光偏振度、各向异性、相位差以及方位角。
进一步地,步骤4所述计算机对所述一系列待测生物荧光染色样品荧光图像进行计算处理,获得待测生物荧光染色样品的各荧光参数图像,所述荧光参数包括荧光偏振度、各向异性、相位差以及方位角,所采用的公式分别为:
式中,P为荧光偏振度,A为荧光各向异性,I||为窄带入射激发光偏振角度与检偏器平行状态下的光强图像,I⊥为窄带入射激发光偏振角度与检偏器垂直状态下的光强图像;δ为荧光相位差,为荧光方位角,αi为液晶偏振旋转器调制的某一偏振角度,Ii为偏振角度αi对应的入射激发光激发出的荧光光强,N为液晶偏振旋转器调制的偏振角度的个数。
本发明与现有技术相比,其显著优点为:1)装置结构简单:采用液晶偏振旋转器对入射激发光的偏振状态进行快速调制,通过高量子效率的sCMOS相机记录不同偏振状态下激发出的带有不同偏振特性的荧光图像;该装置基于宽场荧光显微镜,结构较为简单;2)调制成像速度快:采用液晶相位延迟器对入射激发光的偏振状态进行调制,液晶相位延迟器响应时间在50ms以内,整体成像过程在1秒以内;3)调制精度高:采用液晶相位延迟器对入射激发光的偏振状态进行调制,液晶相位延迟器最大延迟相位可达2π以上,可实现对光束偏振角度的全周期360°覆盖调制;4)分辨率高:基于荧光偏振特性,通过记录不同偏振状态下激发出的荧光偏振图像,可计算获得多幅参数图像,相较于传统光强图像,拥有更高分辨率与对比度;5)宽视场:本发明装置基于普通宽场荧光显微装置,相对其他点扫描成像方法,具有更大的成像视场。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1为本发明基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置的结构示意图。
图2为一个实施例中液晶偏振旋转器的偏振调制效果曲线示例图。
图3为一个实施例中液晶相位延迟器的相位延迟曲线示例图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本申请进行进一步详细说明。应当理解,此处描述的具体实施例仅仅用以解释本申请,并不用于限定本申请。
结合图1,本发明提出了一种基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置,包括光源1,沿光源1出射光束方向依次同轴设置的激发滤光片2、液晶偏振旋转器6和二向色镜7,沿二向色镜7反射光方向依次同轴设置的物镜8、置于载物台9上的待测生物荧光染色样品,以及沿上述反射光经二向色镜7透射的方向依次同轴设置的发射滤光片10、第一波片11、检偏器12、成像透镜13、相机14;相机14与计算机16连接,液晶偏振旋转器6通过液晶控制器15与计算机16连接;
光源1发出的光束经激发滤光片2滤波后进入液晶偏振旋转器6,之后经二向色镜7反射并透过物镜8后对载物台9上的待测生物荧光染色样品进行照明,激发产生的荧光经物镜8、二向色镜7透射后,依次通过发射滤光片10、第一波片11、检偏器12、成像透镜13进入相机14,在此过程中,计算机16通过液晶控制器15驱动液晶偏振旋转器6工作以对光源1出射光束的偏振角度进行调制,并控制相机14采集待测生物荧光染色样品的荧光图像。
上述基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置,采用液晶偏振旋转器对入射激发光的偏振状态进行快速调制,通过高量子效率的sCMOS相机记录不同偏振状态下激发出的带有不同偏振特性的荧光图像,之后基于不同偏振角度下的系列荧光图像,计算出包括荧光各向异性、偏振度、相位差以及方位角等荧光参数的图像。该装置基于普通宽场荧光显微装置实现,相对其他点扫描成像方法,结构较为简单,且具有更大的成像视场。
进一步地,在其中一个实施例中,激发滤光片2的中心波长与待测生物荧光染色样品所采用的染色物质的激发波长一致。
采用本实施例的方案,能提高采集到的荧光图像的分辨率和对比度等。
进一步地,在其中一个实施例中,发射滤光片10的中心波长与待测生物荧光染色样品所采用的染色物质的发射波长一致。
采用本实施例的方案,能提高采集到的荧光图像的分辨率和对比度等。
进一步地,在其中一个实施例中,液晶偏振旋转器6包括沿光源1出射光束方向依次同轴设置的线偏振片3、液晶相位延迟器4和第二波片5。
采用本实施例的方案,结构简单,仅通过调节液晶相位延迟器即可实现对入射激发光偏振状态的快速调制。
进一步地,在其中一个实施例中,第一波片11、第二波片5均采用四分之一波片。
进一步地,在其中一个实施例中,液晶相位延迟器4的最大延迟相位(延迟相位曲线示例如图3所示,能延迟11.5左右的弧度)大于等于2π,响应时间小于50ms。
采用本实施例的方案,结合液晶相位延迟器毫秒级的电光调制速度和全波长的相位延迟量,可实现对光束偏振角度的全周期360°覆盖高精度调制(如图2所示),且调制速度快,整体成像过程在1秒以内。
进一步地,在其中一个实施例中,相机14具体采用sCMOS相机,且该sCMOS相机的量子效率大于等于90%。
采用本实施例的方案,能提高采集到的荧光图像的分辨率和对比度等。
基于上述基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置的成像方法,包括以下步骤:
步骤1、搭建基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置;
步骤2、打开光源1,其出射光束经激发滤光片2形成窄带入射激发光,计算机16驱动液晶偏振旋转器6工作将窄带入射激发光调制为具有一定偏振角度的线偏振光,该线偏振光经二向色镜7反射及物镜8后入射到置于载物台9上的待测生物荧光染色样品,激发产生荧光,该荧光经物镜8、二向色镜7透射后,依次通过发射滤光片10、第一波片11、检偏器12、成像透镜13进入sCMOS相机14,计算机16控制sCMOS相机14采集待测生物荧光染色样品的荧光图像;
步骤3、计算机16驱动液晶偏振旋转器6对入射激发光的偏振角度进行周期性调制,同时控制sCMOS相机14采集图像,获得一系列待测生物荧光染色样品荧光图像并保存至计算机16;
步骤4、计算机16对一系列待测生物荧光染色样品荧光图像进行计算处理,获得待测生物荧光染色样品的各荧光参数图像,上述荧光参数包括荧光偏振度、各向异性、相位差以及方位角。
进一步地,在其中一个实施例中,步骤4中计算机16对一系列待测生物荧光染色样品荧光图像进行计算处理,获得待测生物荧光染色样品的各荧光参数图像,荧光参数包括荧光偏振度、各向异性、相位差以及方位角,所采用的公式分别为:
式中,P为荧光偏振度,A为荧光各向异性,I||为窄带入射激发光偏振角度与检偏器12平行状态下的光强图像,I⊥为窄带入射激发光偏振角度与检偏器12垂直状态下的光强图像;δ为荧光相位差,为荧光方位角,αi为液晶偏振旋转器6调制的某一偏振角度,Ii为偏振角度αi对应的入射激发光激发出的荧光光强,N为液晶偏振旋转器6调制的偏振角度的个数。
综上,本发明利用荧光标记物在线偏振光的激发下表现出的偏振特性,采用液晶偏振旋转器快速调制入射激发光的偏振状态,通过高量子效率的sCMOS相机获得待测生物荧光染色样品的不同微纳结构位置的荧光偏振图像,之后基于不同偏振角度下的系列荧光偏振图像,计算出包括荧光各向异性、偏振度、相位差以及方位角等荧光参数的图像。本发明所采用的液晶偏振旋转器,结合液晶相位延迟器毫秒级的电光调制速度和全波长的相位延迟量,提高了装置偏振调制精度和整体成像速度,此外基于宽场显微成像的照明方式,使本发明具有更大的成像视场,且通过系列荧光偏振图像,能够计算获得相较于传统荧光图像具有更高分辨率和对比度的多种荧光参数图像。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置,其特征在于,包括光源(1),沿光源(1)出射光束方向依次同轴设置的激发滤光片(2)、液晶偏振旋转器(6)和二向色镜(7),沿二向色镜(7)反射光方向依次同轴设置的物镜(8)、置于载物台(9)上的待测生物荧光染色样品,以及沿所述反射光经二向色镜(7)透射的方向依次同轴设置的发射滤光片(10)、第一波片(11)、检偏器(12)、成像透镜(13)、相机(14);所述相机(14)与计算机(16)连接,液晶偏振旋转器(6)通过液晶控制器(15)与计算机(16)连接;
所述光源(1)发出的光束经激发滤光片(2)滤波后进入液晶偏振旋转器(6),之后经二向色镜(7)反射并透过物镜(8)后对载物台(9)上的待测生物荧光染色样品进行照明,激发产生的荧光经物镜(8)、二向色镜(7)透射后,依次通过发射滤光片(10)、第一波片(11)、检偏器(12)、成像透镜(13)进入相机(14),在此过程中,计算机(16)通过液晶控制器(15)驱动液晶偏振旋转器(6)工作以对光源(1)出射光束的偏振角度进行调制,并控制相机(14)采集待测生物荧光染色样品的荧光图像。
2.根据权利要求1所述的基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置,其特征在于,所述激发滤光片(2)的中心波长与待测生物荧光染色样品所采用的染色物质的激发波长一致。
3.根据权利要求1所述的基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置,其特征在于,所述发射滤光片(10)的中心波长与待测生物荧光染色样品所采用的染色物质的发射波长一致。
4.根据权利要求1所述的基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置,其特征在于,所述液晶偏振旋转器(6)包括沿光源(1)出射光束方向依次同轴设置的线偏振片(3)、液晶相位延迟器(4)和第二波片(5)。
5.根据权利要求1或4所述的基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置,其特征在于,所述第一波片(11)、第二波片(5)均采用四分之一波片。
6.根据权利要求4所述的基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置,其特征在于,所述液晶相位延迟器(4)的最大延迟相位大于等于2π,响应时间小于50ms。
7.根据权利要求1所述的基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置,其特征在于,所述相机(14)具体采用sCMOS相机,且该sCMOS相机的量子效率大于等于90%。
8.基于权利要求1至7任意一项所述的基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置的成像方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、搭建基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像装置;
步骤2、打开光源(1),其出射光束经激发滤光片(2)形成窄带入射激发光,计算机(16)驱动液晶偏振旋转器(6)工作将所述窄带入射激发光调制为具有一定偏振角度的线偏振光,该线偏振光经二向色镜(7)反射及物镜(8)后入射到置于载物台(9)上的待测生物荧光染色样品,激发产生荧光,该荧光经物镜(8)、二向色镜(7)透射后,依次通过发射滤光片(10)、第一波片(11)、检偏器(12)、成像透镜(13)进入sCMOS相机(14),计算机(16)控制sCMOS相机(14)采集待测生物荧光染色样品的荧光图像;
步骤3、计算机(16)驱动液晶偏振旋转器(6)对窄带入射激发光的偏振角度进行周期性调制,同时控制sCMOS相机(14)采集图像,获得一系列待测生物荧光染色样品荧光图像并保存至计算机(16);
步骤4、计算机(16)对所述一系列待测生物荧光染色样品荧光图像进行计算处理,获得待测生物荧光染色样品的各荧光参数图像,所述荧光参数包括荧光偏振度、各向异性、相位差以及方位角。
9.根据权利要求8所述的基于液晶的快速调制荧光偏振显微成像方法,其特征在于,步骤4所述计算机(16)对所述一系列待测生物荧光染色样品荧光图像进行计算处理,获得待测生物荧光染色样品的各荧光参数图像,所述荧光参数包括荧光偏振度、各向异性、相位差以及方位角,所采用的公式分别为:
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