CN112711130A - 基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像方法和装置 - Google Patents

基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像方法和装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像装置，包括产生激发光束的照明系统，收集样品发出荧光信号的探测系统，以及用于控制和信号处理的计算机，所述的照明系统包括依次布置的：激光器，发出激光光束；电光调制模块，用于控制激光光束在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间的快速转换；相位调制器件，对圆偏振光进行相位调制，形成照明样品并激发荧光的实心光斑和空心光斑。本发明还公开了一种基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像方法，实现了实心和空心光斑的快速转换，在很大程度上提升了荧光差分显微成像系统的成像速度。

Description

基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像方法和装置
技术领域
本发明属于共聚焦显微成像领域，特别涉及到一种基于电光调制技术实现快速相位调制荧光差分显微成像的方法和装置。
背景技术
传统的远场荧光显微技术由于受到衍射极限的限制，其能够实现的分辨率总是很难低于二分之一波长，因此在生物医学、纳米技术以及材料等领域的应用受到很大的限制。为了突破这一限制，从上个世纪90年代开始，相关研究人员便提出了很多超分辨显微技术，例如受激辐射损耗超分辨显微技术(STED)，单分子定位超分辨显微技术(SMS)等。在这些超分辨显微技术中，荧光差分显微技术(FED)是近期提出的超分辨显微技术，以共聚焦显微成像技术为基础，通过两个特定的激发光斑扫描待测样品得到两幅图像，并对得到的两幅图像进行差分实现图像分辨率的提升。实验证明荧光差分显微成像技术在远场可以实现小于四分之一波长的分辨率，并且具有较高的信噪比，此外由于无需高功率的照明光，可以在很大程度上减小光漂白和光损伤。
然而，荧光差分显微成像技术存在成像速度受到限制无法对时间分辨率要求较高的运动样品成像，以及成像过程中可能出现运动伪影的问题。荧光差分显微成像系统中通常使用0到2π的涡旋相位板或加载相同0到2π的涡旋相位图案的空间光调制器调制一个与之同向的圆偏振光，得到所需的空心光斑，如公开号CN 110118726 A和CN 105510290 A的申请文件公开的技术方案。由于成像过程中需要用实心和空心光斑分别对待测样品进行扫描，当使用涡旋相位板作为相位调制方式时，需要用分光棱镜将光束分成两路，一路经过涡旋相位板调制为空心光斑，另一路不经过相位调制为实心光斑，这样会在一定程度上增加系统的复杂性，并提升系统的调节难度；当使用空间光调制器作为相位调制方式时，通常通过改变空间光调制器表面加载的相位调制图案实现实心和空心光斑之间的转换，由于空间光调制器的响应时间限制，以及用软件程序控制空间光调制器加载的相位调制图案在0到2π的涡旋相位调制图案和无相位调制图案之间转换需要时间，导致实心和空心光斑的转换过程需要一定的时间，用实心光斑和空心光斑分别扫描待观测样品会花费较长时间并会出现运动伪影的现象，从而限制了荧光差分显微成像技术的成像速度以及对运动待测样品的观测。要提升该技术的成像速度，解决这一问题的关键便是减少实心和空心光斑转换所需的时间
发明内容
本发明提供了一种基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像装置。本装置结构紧凑简单，基于普通荧光差分显微成像系统即可进行改装；实现了实心和空心光斑的快速转换，在很大程度上提升了荧光差分显微成像系统的成像速度。
本发明在传统的荧光差分显微成像系统(图1和图2)的基础上，提出了利用电光调制技术实现照明光偏振状态的改变，由于不同旋向的圆偏振光经过同一0到2π的涡旋相位调制后其分布情况存在差异，分别为实心和空心光斑，由于电光调制器具有很高的响应速度，工作频率最高可以达到100MHz，因此能够实现实心和空心光斑之间的高速转换，从而减少系统成像所需的时间，进而实现荧光差分显微成像的速度提升。
一种基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像装置，包括产生激发光束的照明系统，收集样品发出荧光信号的探测系统，以及用于控制和信号处理的计算机，所述的照明系统包括依次布置的：
激光器，发出激光光束；
电光调制模块，用于控制激光光束在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间的快速转换；
相位调制器件，对圆偏振光进行相位调制，形成照明样品并激发荧光的实心光斑和空心光斑。
优选的，所述的电光调制模块包括用于调制激发光偏振状态的电光调制器和用于控制电光调制器的高电压驱动模块，所述高电压驱动模块受控于所述计算机。
优选的，所述激光器和电光调制模块间设有用于将激发光调整为与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°的偏振片和用于调制其振幅状态的1/4波片，调节后的激光光束为右旋圆偏振光。
优选的，光束通过电光调制器，当电光调制器不施加控制电压时光束的偏振状态不发生变化，当电光调制器施加大小为电光调制器的半波电压Vπ大小的电压时，光束转换为左旋圆偏振光，通过施加具有一定间隔的大小为Vπ的高频脉冲电压，可以实现光束在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间的快速转换。
优选的，所述相位调制器件为0到2π的涡旋相位板。
并列优选的，所述相位调制器件为加载0到2π的涡旋相位调制图案的空间光调制器。
本发明的装置中，照明系统包括依次设置的：
作为光源的激光器，发出激光光束；
用于保证激光出射偏振方向不变的保偏光纤；
由于将经保偏光纤单模输出的激光光源准直扩束的准直镜；
用于将激发光调整为与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°的偏振片和用于调制其振幅状态的1/4波片；
用于调制激发光偏振状态的电光调制器，以及用于控制电光调制器的高电压驱动模块；
用于实现相位调制的0到2π涡旋相位调制模块；
用于调节激光光路，使光路变得紧凑的反射镜；
用于调整激光偏振方向的1/2波片；
用于调整激光相位使相位受到调制的入射光变成圆偏振光的1/4波片；
用于反射激发光、透射荧光的二色镜；
用于实现对样品扫描的振镜系统；
用于实现对激光光束扩束和点扫描的4f系统，包括扫描镜和场镜；
用于聚焦激发光并收集荧光的物镜。
具体地，收集样品发出荧光信号的探测系统，包括：
用于滤除经样品面反射回来的激光，仅使荧光样品发出的荧光通过参与成像的滤波片；
用于将荧光样品发出的荧光会聚到探测器阵列上的透镜；
由多个光电探测器组成，用于将探测到的光信号转换为电信号并传送到计算机的探测器阵列。
同时，计算机还用于控制激光光源、电光调制器、相位调制器、振镜系统和探测阵列。
基于上述的装置，本申请还提供基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像方法，包括：
激光器发出的激光光束在准直后调节为右旋圆偏振光；
通过电光调制模块控制激光光束在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间的快速转换；
对圆偏振光进行相位调制，形成照明样品并激发荧光的实心光斑和空心光斑；
收集荧光信号，分别得到实心光斑和空心光斑的图像，差分处理后得到显微成像结果。
优选的，所述的电光调制模块包括用于调制激发光偏振状态的电光调制器和用于控制电光调制器的高电压驱动模块，所述高电压驱动模块受控于所述计算机。
优选的，光束通过电光调制器，当电光调制器不施加控制电压时光束的偏振状态不发生变化，当电光调制器施加大小为电光调制器的半波电压Vπ大小的电压时，光束转换为左旋圆偏振光，通过施加具有一定间隔的大小为Vπ的高频脉冲电压，可以实现光束在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间的快速转换。
优选的，利用相位调制器件对圆偏振光进行相位调制，所述相位调制器件为0到2π的涡旋相位板或加载0到2π的涡旋相位调制图案的空间光调制器。
本发明的原理如下：
本发明在传统的荧光差分显微成像系统的基础上，准直扩束后激光首先经过偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°的偏振片调节为线偏振光，再经过光轴方向与电光调制器的调制方向一致的1/4波片调节为右旋圆偏振光，右旋圆偏振光进入电光调制器。激光在电光调制器的控制下实现在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间的快速转换，在经过0到2π的涡旋相位板调制后，激光根据和涡旋相位板的旋向是否一致分别调制得到空心和实心光斑，用实心和空心光斑分别对样品进行扫描并将得到的成像结果按一定比例相减得到荧光差分显微成像结果。
电光调制器的工作原理为电光效应，即电光材料在直流或交流电场的作用下其折射率发生变化的现象，对于各向异性的电光材料，电场会影响材料在各个方向上的折射率分布。在外电场作用下，电光材料的折射率n(E)是外电场振幅E的函数，并随着E的变化而发生微小变化，可以写为：
Figure BDA0002754786020000051
这一效应称为普克尔效应，这些材料称为普克尔媒介或普克尔盒，系数称为普克尔系数或线性电光系数。任何一个偏振光可以分解成两个正交的偏振分量，在各向异性的介质中，这两个偏振分量一般被分解到折射率椭球的两个主折射率轴上，设两个偏振分量所对应的折射率分别为n1和n2，则它们的传播速度分别为c0/n1和c0/n2，其中c0为真空中的光波速度。由于两个分量传播速度的差异，使一个分量传播到器件的另一端时，在时间上会超前或落后于另一个偏振分量，从而构成相位延迟，改变出射光的偏振态。当在各向异性材料上施加外电场E时，对于普克尔效应，光通过长度为L的调制器时，两个偏振分量产生的相位差为：
Figure BDA0002754786020000052
对于外加电场方向和光的传播方向垂直的横向调制器，其电场E＝V/d，V为所加电压，d为两个电极之间的距离，可以把相位差的表达式写为：
Figure BDA0002754786020000053
其中Γ0＝k0(n1-n2)L为器件自身所具有的相位差，半波电压为
Figure BDA0002754786020000061
相位延迟量和所加电压成线性关系，当电压为Vπ时，相位延迟量为π。
圆偏振光由传播方向相同，振动方向相互垂直且相位差恒定为
Figure BDA0002754786020000062
的两平面偏振光叠加组成。2个组成分量的偏振方向和电光调制器的2个折射率分量平行的右旋圆偏振光经过外加电压等于半波电压Vπ的电光调制器，引入π的相位延迟量，2个分量之间的相位差从
Figure BDA0002754786020000063
改变为
Figure BDA0002754786020000064
转变为左旋圆偏振光。若是左旋圆偏振光，则2个分量之间的相位差从
Figure BDA0002754786020000065
改变为
Figure BDA0002754786020000066
转变为右旋圆偏振光。
在显微成像系统中，显微物镜焦点附近的光斑强度分布通常受到偏振状态，输入光斑形状，透镜结构和相位板结构的影响。当使用一个高数值孔径的显微物镜时，根据矢量衍射理论，可以将焦点附近的电场向量分布表示为：
Figure BDA0002754786020000067
Figure BDA0002754786020000068
其中
Figure BDA0002754786020000069
是点
Figure BDA00027547860200000610
处的电场向量，
Figure BDA00027547860200000611
是原点在焦点处的柱坐标分布，C是归一化的常量，
Figure BDA00027547860200000612
是输入光的振幅函数，通常可以表示为1或基本高斯函数的变形，
Figure BDA00027547860200000613
是表示成像透镜结构的3×3矩阵，通常可以表示为
Figure BDA00027547860200000614
[px；py；pz]是表示输入光偏振状态的单位矩阵向量。
在荧光差分显微成像系统中，通过使用相位板或空间光调制器可以对输入光引入相位延迟，从而改变光斑的能量分布，可以将焦点附近的电场向量分布表示为：
Figure BDA00027547860200000615
Figure BDA00027547860200000616
其中
Figure BDA00027547860200000617
是引入的相位延迟。通常用0到2π的涡旋相位板产生空心光斑，其引入的相位延迟可以表示为
Figure BDA0002754786020000071
通过代入上述公式，可以得到当输入光分别为左旋圆偏振光和右旋圆偏振光时，在焦点处得到的光斑在水平面的分布分别为实心光斑和空心光斑。
将电光调制技术和荧光差分显微成像技术相结合，利用电光调制器实现输入光在左旋圆偏振光和右旋圆偏振光之间的快速转换，在经过涡旋相位板或空间光调制器后得到的光斑在实心光斑和空心光斑之间快速转换。在很短时间内得到待测样品在实心光斑和空心光斑两种模式下照明得到的图像，从而在很大程度上减少了荧光差分显微成像所需的时间。
相对于现有的技术，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)在传统的荧光差分显微成像系统的基础上进行了简单的改进，系统较为简单，且适用于一切荧光差分显微成像系统；
(2)利用电光调制技术实现激发光偏振状态的快速转换，只需控制电光调制器的施加电压即可实现，操作简单且所需时间短；
(3)利用电光调制技术实现激发光偏振状态的快速转换，减少了激发光在实心和空心两种分布状态下转换所需的时间，实现了荧光差分显微成像速度的提升，从而实现实时成像。
附图说明
图1为传统的基于共聚焦成像系统和振镜扫描的荧光差分显微成像系统装置示意图，采用0到2π的涡旋相位板6作为相位调制器件；
图2为传统的基于共聚焦成像系统和振镜扫描的荧光差分显微成像系统装置示意图，采用空间光调制器20作为相位调制器件；
图3为本发明中基于电光调制技术的荧光差分显微成像系统装置实例图，采用0到2π的涡旋相位板6作为相位调制器件；
图4为本发明中基于电光调制技术的荧光差分显微成像系统装置实例图，采用空间光调制器20作为相位调制器件；
图5为本发明中采用的电光调制器的对输入光偏振调制的示意图，显示了输入光两个偏振态之间引入的相位延迟随着施加电压的变化；
图6为当输入光为左旋圆偏振光时经过右旋的0到2π的涡旋相位调制后得到的光斑强度分布示意图，其中，(a)为水平平面光斑分布示意图，(b)为纵向平面光斑分布示意图；
图7为当输入光为右旋圆偏振光时经过右旋的0到2π的涡旋相位调制后得到的光斑强度分布示意图，其中，(a)为水平平面光斑分布示意图，(b)为纵向平面光斑分布示意图；
图8为荧光差分显微成像中利用实心光斑照明得到的点扩散函数减去空心光斑照明得到的点扩散函数得到一个更小的实心点扩散函数的过程示意图，其中，(a)为实心光斑照明得到的点扩散函数示意图；(b)为空心光斑照明得到的点扩散函数示意图；(c)为相减后半高全宽更小的点扩散函数示意图。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
如图3所示为一种基于电光调制技术和0到2π的涡旋相位板相位调制的荧光差分显微成像系统装置示意图，包括：638nm激光器1，准直透镜2，偏振片3，1/4波片4，反射镜5，电光调制器23，高电压驱动模块24，反射镜5，0到2π的涡旋相位板6，1/2波片7，1/4波片8，二色镜9，振镜扫描系统10，扫描透镜11，场镜12，反射镜13，高数值孔径的物镜14，样品15，滤波片16，透镜17，探测器阵列18，计算机19。
其中偏振片3用于将激发光的偏振状态调整至偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°，1/4波片4用于将激发光调整为圆偏振光，便于电光调制器的调制；0到2π的涡旋相位板6用于将圆偏振光调制为空心光斑或实心光斑；1/2波片7和1/4波片8用于将经过调制的激发光的偏振状态调节为圆偏振光；扫描透镜11和场镜12组成4f系统，用于使激发光的光束大小和物镜14的数值孔径相匹配，并保证在物镜入瞳位置为平行光；滤波片16的通光波段需要匹配样品的荧光波段；振镜扫描系统10的驱动需要和电光调制器的驱动信号相匹配，对于每一个成像单元，获取实心和空心两种照明情况下的成像结果后，再控制振镜扫描系统对下一个成像单元扫描成像。
采用图3所示装置实现荧光差分显微成像的过程如下：
(1)激光器1发出的激发光经过准直透镜2准直并扩束后，经偏振片3后变成偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°的线偏振光，线偏振光经1/4波片4后调节变成圆偏振光；
(2)圆偏振光经反射镜5反射后进入电光调制器23进行偏振调制，在高电压驱动模块24的控制下，当驱动电压为0时激发光为右旋圆偏振光，当驱动电压为电光调制器的半波电压Vπ大小时激发光转变为左旋圆偏振光，随着驱动电压的变化，激发光在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间快速转换，电光调制器可以在0.1-100MHz的共振频率之间工作，通常以20MHz作为工作频率，可以让激发光在1μs转换20次，从而实现实时扫描FED成像；
(3)圆偏振光经反射镜5反射后进入0到2π的涡旋相位板6进行相位调制，当圆偏振光的旋向和涡旋相位板的旋向一致时得到空心光斑，当圆偏振光的旋向和涡旋相位板的旋向不一致时得到实心光斑；被调制相位后的激发光经过1/2波7和1/4波片8补偿后面的二色镜9，振镜扫描系统10以及反射镜13造成的相位差并调节使调制后的激发光为圆偏振光；激发光在经过二色镜9反射后进入振镜扫描系统10，在最终样品面实现二维扫描；从振镜扫描系统10出来的激发光经过扫描透镜11和场镜12组成的4f系统，调节光束大小使其与物镜14的数值孔径大小相匹配；激发光经过物镜聚焦后得到衍射极限限制的激发光斑，激发光斑聚焦到荧光样品15上；
(4)在实心和空心光斑两种模式下快速转换的激发光照明荧光样品15后激发样品产生荧光，产生的荧光经过物镜收集后经过反射镜13，场镜12，扫描透镜11以及振镜扫描系统10后入射到二色镜9上；二色镜9使荧光透射；透射的荧光经滤波片16滤除样品反射的激发光以及其他杂散光，只让荧光出射；出射的荧光经透镜17会聚后聚焦到探测器阵列18处；探测器阵列将光信号转换为电信号并将电信号传送至计算机19处；
(5)计算机19将探测器阵列18中每个探测器单元探测得到的信号做相应的图像处理后得到在实心或空心照明模式下一个物点所对应的成像结果，计算机19通过高电压驱动模块24控制电光调制器23实现激发光在实心和空心照明模式下的快速转换，计算机19得到两种照明模式下一个物点所对应的2种成像结果，按一定比例进行相减处理后得到一个物点对应的最终图像；
(6)振镜扫描系统10与计算机19相连，通过计算机19控制振镜扫描系统对样品进行二维扫描，得到样品对应的二维图像。
实施例2
如图4所示为一种基于电光调制技术和空间光调制器相位调制的荧光差分显微成像系统装置示意图，包括：638nm激光器1，准直透镜2，偏振片3，1/4波片4，电光调制器23，高电压驱动模块14，反射镜5，空间光调制器20，反射镜21，反射镜22，1/2波片7，1/4波片8，二色镜9，振镜扫描系统10，扫描透镜11，场镜12，反射镜13，高数值孔径的物镜14，样品15，滤波片16，透镜17，探测器阵列18，计算机19。
其中偏振片3用于将激发光的偏振状态调整至偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°，1/4波片4用于将激发光调整为圆偏振光，便于电光调制器的调制；空间光调制器20通过加载0到2π的涡旋相位调制图案，用于将圆偏振光调制为空心光斑或实心光斑；反射镜21和反射镜22用于压缩光路；1/2波片7和1/4波片8用于将经过调制的激发光的偏振状态调节为圆偏振光；扫描透镜11和场镜12组成4f系统，用于使激发光的光束大小和物镜14的数值孔径相匹配，并保证在物镜入瞳位置为平行光；滤波片16的通光波段需要匹配样品的荧光波段；振镜扫描系统的驱动需要和电光调制器的驱动信号相匹配，对于每一个成像单元，获取实心和空心两种照明情况下的成像结果后，再控制振镜扫描系统对下一个成像单元扫描成像。
采用图4所示装置实现荧光差分显微成像的过程如下：
(1)激光器1发出的激发光经过准直透镜2准直并扩束后，经偏振片3后变成偏振方向与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°的线偏振光，线偏振光经1/4波片4后调节变成圆偏振光；
(2)圆偏振光进入电光调制器23进行偏振调制，在高电压驱动模块24的控制下，当驱动电压为0时激发光为右旋圆偏振光，当驱动电压为电光调制器的半波电压Vπ大小时激发光转变为左旋圆偏振光，随着驱动电压的变化，激发光在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间快速转换；
(3)圆偏振光经反射镜5反射后进入计算机19控制加载了0到2π的涡旋相位调制图案的空间光调制器20进行相位调制，当圆偏振光的旋向和涡旋相位调制图案的旋向一致时得到空心光斑，当圆偏振光的旋向和涡旋相位调制图案的旋向不一致时得到实心光斑；被调制相位后的激发光经过反射镜21和反射镜22反射后经过1/2波片7和1/4波片8补偿反射镜21和反射镜22，以及后面的二色镜9，振镜扫描系统10和反射镜13造成的相位差并调节使调制后的激发光为圆偏振光；激发光在经过二色镜9反射后进入振镜扫描系统10，在最终样品面实现二维扫描；从振镜扫描系统10出来的激发光经过扫描透镜11和场镜12组成的4f系统，调节光束大小使其与物镜14的数值孔径大小相匹配；激发光经过物镜14聚焦后得到衍射极限限制的激发光斑，激发光斑聚焦到荧光样品15上；
(4)在实心和空心光斑两种模式下快速转换的激发光照明荧光样品15后激发样品产生荧光，产生的荧光经过物镜14收集后经过反射镜13，场镜12，扫描透镜11以及振镜扫描系统10后入射到二色镜9上；二色镜9使荧光透射；透射的荧光经滤波片16滤除样品反射的激发光以及其他杂散光，只让荧光出射；出射的荧光经透镜17会聚后聚焦到探测器阵列18处；探测器阵列将光信号转换为电信号并将电信号传送至计算机19处；
(5)计算机19将探测器阵列18中每个探测器单元探测得到的信号做相应的图像处理后得到在实心或空心照明模式下一个物点所对应的成像结果，计算机19通过高电压驱动模块24控制电光调制器23实现激发光在实心和空心照明模式下的快速转换，计算机19得到两种照明模式下一个物点所对应的2种成像结果，按一定比例进行相减处理后得到一个物点对应的最终图像；
(6)振镜扫描系统10与计算机19相连，通过计算机控制振镜扫描系统对样品进行二维扫描，得到样品对应的二维图像。
如图5所示，电光调制器的驱动电压的不同会在输入光两个偏振态之间引入不同的相位延迟，对于右旋圆偏振光，当电光调制器的驱动电压大小为电光调制器的半波电压Vπ时，会在输入光的两个偏振状态之间引入π大小的相位延迟，则右旋圆偏振光会转变为左旋圆偏振光，当驱动电压大小为0时，在输入光的两个偏振状态之间的相位延迟为0，依旧为右旋圆偏振光，通过施加具有间隔的大小为Vπ的高频脉冲电压，能够实现光束在左旋圆偏振光和右旋圆偏振光两个状态之间的快速转换。
如图6所示，当输入光为左旋圆偏振光时，经过右旋的0到2π的涡旋相位调制后得到实心光斑，根据矢量衍射理论计算得到实心光斑在光学系统焦点附近的具体分布情况，实心光斑在水平平面的分布情况如图6(a)所示，在纵向平面的分布情况如图6(b)所示。
如图7所示，当输入光为右旋圆偏振光时，经过右旋的0到2π的涡旋相位调制后得到空心光斑，根据矢量衍射理论计算得到空心光斑在光学系统焦点附近的具体分布情况，空心光斑在水平平面的分布情况如图7(a)所示，在纵向平面的分布情况如图7(b)所示。
如图8所示，用实心点扩散函数减去空心点扩散函数得到一个更小的实心点扩散函数的过程，左旋圆偏振光经过右旋的0到2π的涡旋相位调制后得到的实心光斑照明荧光样品后激发样品产生荧光的实心点扩散函数如图8(a)所示，右旋圆偏振光经过右旋的0到2π的涡旋相位调制后得到的空心光斑照明荧光样品后激发样品产生荧光的空心点扩散函数如图8(b)所示，将两种荧光信号相减后得到最终成像结果，实心点扩散函数与空心点扩散函数相减后得到的半高全宽更小的实心点扩散函数如图8(c)所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像装置，包括产生激发光束的照明系统，收集样品发出荧光信号的探测系统，以及用于控制和信号处理的计算机，其特征在于，所述的照明系统包括依次布置的：
激光器，发出激光光束；
电光调制模块，用于控制激光光束在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间的快速转换；
相位调制器件，对圆偏振光进行相位调制，形成照明样品并激发荧光的实心光斑和空心光斑。
2.根据权利要求1所述的基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像装置，其特征在于，所述的电光调制模块包括用于调制激发光偏振状态的电光调制器和用于控制电光调制器的高电压驱动模块，所述高电压驱动模块受控于所述计算机。
3.根据权利要求2所述的基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像装置，其特征在于，所述激光器和电光调制模块间设有用于将激发光调整为与电光调制器的晶体光轴方向夹角为45°的偏振片和用于调制其振幅状态的1/4波片，调节后的激光光束为右旋圆偏振光。
4.根据权利要求3所述的基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像装置，其特征在于，光束通过电光调制器，当电光调制器不施加控制电压时光束的偏振状态不发生变化，当电光调制器施加大小为电光调制器的半波电压Vπ大小的电压时，光束转换为左旋圆偏振光，通过施加具有间隔的大小为Vπ的高频脉冲电压，可以实现光束在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间的快速转换。
5.根据权利要求1所述的基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像装置，其特征在于，所述相位调制器件为0到2π的涡旋相位板。
6.根据权利要求1所述的基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像装置，其特征在于，所述相位调制器件为加载0到2π的涡旋相位调制图案的空间光调制器。
7.一种基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像方法，根据权利要求1-6任一项中的相位调制荧光差分显微成像装置，其特征在于，包括：
激光器发出的激光光束在准直后调节为右旋圆偏振光；
通过电光调制模块控制激光光束在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间的快速转换；
对圆偏振光进行相位调制，形成照明样品并激发荧光的实心光斑和空心光斑；
收集荧光信号，分别得到实心光斑和空心光斑的图像，差分处理后得到显微成像结果。
8.根据权利要求1所述的基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像方法，其特征在于，所述的电光调制模块包括用于调制激发光偏振状态的电光调制器和用于控制电光调制器的高电压驱动模块，所述高电压驱动模块受控于所述计算机。
9.根据权利要求8所述的基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像方法，其特征在于，光束通过电光调制器，当电光调制器不施加控制电压时光束的偏振状态不发生变化，当电光调制器施加大小为电光调制器的半波电压Vπ大小的电压时，光束转换为左旋圆偏振光，通过施加具有一定间隔的大小为Vπ的高频脉冲电压，可以实现光束在右旋圆偏振光和左旋圆偏振光之间的快速转换。。
10.根据权利要求1所述的基于电光调制技术的相位调制荧光差分显微成像方法，其特征在于，利用相位调制器件对圆偏振光进行相位调制，所述相位调制器件为0到2π的涡旋相位板或加载0到2π的涡旋相位调制图案的空间光调制器。
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