CN106199941A - 一种移频光场显微镜以及三维超分辨微观显示方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种移频光场显微镜，包括载物台、照明模块、显微模块、图像获取模块和图像处理模块，所述照明模块布置在载物台的下方，可以对样品进行不同角度地照射；所述图像获取模块获取各个角度光照射样品所得到的光场图像；所述图像处理模块通过对光场图像重聚焦得到各个深度的图像；得到每个深度的所有图像后，进行频谱迭代处理，得到各深度下的高分辨率图像；将得到的高分辨率图像进行滤波处理后，再通过不同深度的高分辨率图进行三维重构；本发明还公开了一种三维超分辨微观显示方法；本发明的显微镜和显示方法把频谱迭代处理与光场两种技术结合，提高了成像深度和分辨率，可以恢复出效果较好的带有深度的微观三维图像。

Description

一种移频光场显微镜以及三维超分辨微观显示方法
技术领域
本发明涉及显微领域，尤其涉及一种移频光场显微镜以及三维超分辨微观显示方法。
背景技术
随着显微技术的不断发展，人们获取微观世界信息的方式更加多元化，获得的信息量也不断提高。在几种感知方式中，光学感知是人们获得信息的最重要的渠道之一，可以在不破坏细胞活性的前提下，获得生物的信息。传统的光学显微只能获得不超过光学衍射极限的二维图像。
为了解决上述问题，有研究者提出了一些显微三维显示技术，例如公开号为CN1664558A的专利文献公开了一种微型三维自扫描共焦显微镜。双梳状直线扫描器由动子和二个作为定子的X向直线驱动器和Z向直线驱动器组成，第二微透镜位于动子上；点式光源发出的光经过第一微透镜后，成为准直激光束；准直激光束透过微型光学分束镜，经过微扫描反射镜反射后，由第二微透镜聚焦于样本；反射光或荧光沿原光路依次经过第二微透镜和微扫描反射镜反射后，返回到微型光学分束镜，被微光学分束镜反射的光经过第三微透镜和针孔，照射到微型光探测器；控制装置用于数据采集和处理，并控制双梳状直线扫描器在X、Y方向的焦点直线扫描。上述装置具有体积小、结构简单、稳定性好、动态特性的频率响应高和直接三维立体自扫描测量的特点。
又例如公开号为CN102607455A的专利文献公开了一种基于光学显微镜和变换光照的微观形貌三维测量方法。该方法根据光学显微镜在固定视点不同光照方向下拍摄得到的多张微观图像重建微观结构表面的三维形貌。其过程如下：首先采用UPS方法和表面可积性约束获得具有GBR歧义的表面反射率和法线方向；然后用基于最小熵的GBR消歧法得到无歧义的表面反射率和法线方向；为了减少噪声的影响，在马尔可夫随机场模型下，利用图割法进一步优化表面法线方向；最后，根据表面法线方向，采用积分的方法重建微观结构表面的三维形貌。
但是上述的显微镜技术在三维微观显示和超分辨显示这两方面往往不可兼得。
发明内容
本发明一种移频光场显微镜，克服现有光场显微技术中三维成像和分辨率彼此矛盾的现状。
一种移频光场显微镜，包括载物台、照明模块、显微模块、图像获取模块和图像处理模块，所述照明模块布置在载物台的下方，可以对样品进行不同角度地照射；
所述图像获取模块获取各个角度光照射样品所得到的光场图像；
所述图像处理模块通过对光场图像重聚焦得到各个深度的图像；得到每个深度的所有图像后，进行频谱迭代处理，得到各深度下的高分辨率图像；将得到的高分辨率图像进行滤波处理后，再通过不同深度的高分辨率图进行三维重构。
本发明结合移频超分辨显微技术利用光场技术和移频超分辨重建技术，提出了一种新型显微镜结构，同时解决了超分辨显示问题与三维重构问题，满足了用户需求。
为了提高光线率用率，优选的，所述显微模块的微透镜阵列采用蜂窝状排布。
优选的，所述微透镜阵列中的微透镜形状为圆形。圆形微透镜加工技术较为成熟，且可达到所需成像效果。
优选的，所述照明模块采用LED照明阵列，所述LED照明阵列的中心与显微模块的中心在同一光轴上。使用LED矩阵作为照明模块成本较低，且可以控制点亮各个LED，以此来得到各个角度照射样本后得到的光场图像。
为了充分体现频谱迭代处理的作用，提高成像的清晰度，优选的，所述LED照明阵列的数量大于5×5。
本发明还提供了一种三维超分辨微观显示方法，包括以下步骤：
(1)通过光学显微镜记录多个角度光照射样品时得到的光场图像；
(2)对步骤(1)得到的光场图像重聚焦得到各个深度的图像；
(3)对步骤(2)得到的各个深度的图像进行频谱迭代处理，得到各个深度下的高分辨率图像；
(4)将步骤(3)得到的高分辨率图像进行滤波处理；
(5)将步骤(4)处理后的不同深度的高分辨率图进行三维重构。
为了减少计算量，提高成像的清晰度，优选的，步骤(4)中，滤波处理采用盲卷积处理算法。
通过盲卷积处理算法对所得到的高分辨率图像进行滤波处理；由于波动性对微观物体影响较大，用的盲卷积处理算法对图像进行处理，和一般的反卷积算法不同，光场显微镜里的点扩散函数随着像点位置的变化而变化。如果想要对光场图像进行反卷积滤波处理，就要测得三维物体表面每一个点的点扩散函数。引入了光波的波动模型和玻恩近似来求出各个位置的点扩散函数，求出后对各个点进行反卷积运算，可以得到更清楚的物体三维表面信息。
光波的传递过程可以用f＝Hg表示，f表示记录的光场，H表示被记录的物体，算符g表示光波从物体到传感器表面的传播过程。对于被记录物体的每一点都有不同的深度，其光波到传感器表面的传播过程也有不同的表达式来表达，由于光场记录表面结构的三维信息，可以通过对f不同深度的积分运算确定物体表面的三维结构V＝∫fdxdy。把每一个可分辨的物体样品表面当作记录的体素V，物体真实的表面信息为O，因为知道每个体素的深度信息s，把光的PSF分布用泊松分布近似，将深度信息带入，可得到V＝O*PSF(s)。所以对V进行反卷积处理，可以算得每一个体素的表达，对记录的光场图像进行了滤波处理，从而得到了较为清晰的结果。
优选的，步骤(1)中，多个角度光照射是指矩阵排布的光源在样品下方分别进行照射。用阵列LED进行照明，可以得到我们后续处理所需要的，各个角度照射样品后散射到传感器上的光场信息。
本发明的有益效果：
本发明的显微镜和显示方法把频谱迭代处理与光场两种技术结合，提高了成像深度和分辨率，可以恢复出效果较好的带有深度的微观三维图像。
附图说明
图1为本发明的移频光场显微镜的结构示意图。
图2为本发明的三维超分辨微观显示方法的流程示意图。
图3为本发明方法的效果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。
本实施例的移频光场显微镜，包括照明模块，显微模块，光路连接耦合模块，光场获取模块，该显微镜微透镜阵列以蜂窝状排布，且每个微透镜后面有对映位置的CCD，该显微镜的照明模块使用LED矩阵照明，LED灯以矩形形状排列。
如图1所示，本实施例的移频光场显微镜包括：计算机1作为图像处理模块、CCD2、微透镜阵列3，可控制快门4，场镜5，物镜6，载物台7和LED矩阵8作为照明模块，每个微透镜后面有对映位置的CCD2；CCD2、微透镜阵列3、场镜5、物镜6、载物台7和LED矩阵8沿光路依次布置。
其中，图像获取模块包括CCD2和可控制快门4，显微模块包括微透镜阵列3、场镜5和物镜6；LED矩阵8采用数量为8×8。
LED矩阵8上不同位置的LED发出不同角度的照明光，本实施例中，LED灯每颗相距4mm，LED灯距离载物台平面相距8cm，照明光通过载物台7后，在NA小于0.1的物镜6可接受范围内的散射光被接收，通过场镜5后经过微透镜阵列3调制成光场信息，微透镜阵列3间距30um，焦距50um通过可控制快门4控制，微透镜阵列3发出的信息被CCD2接收。
可控制电子快门通过电路控制CCD2，计算机1控制可控制快门4的开闭、曝光量，可控制光场图像的采集。
如图2所示，本发明的三维超分辨微观显示方法包括以下步骤：
1、计算机1控制可控制快门4和LED矩阵8，通过CCD2记录了各个角度光照射样品所得到的光场图像；
2、记录的光场图像由于记录了光线的方向和强度信息，通过重聚焦可以得到各个深度的图像；
3、得到所需深度的所有图像后，进行FPM处理，可以得到对应深度下的高分辨率图像，对多个深度的重聚焦图像进行上述操作可以得到各个深度的高分辨率图像；
4、通过盲卷积处理算法对所得到的高分辨率图像进行滤波处理；由于波动性对微观物体影响较大，用的盲卷积处理算法对图像进行处理，和一般的反卷积算法不同，光场显微镜里的点扩散函数随着像点位置的变化而变化。如果想要对光场图像进行反卷积滤波处理，就要测得三维物体表面每一个点的点扩散函数。引入了光波的波动模型和玻恩近似来求出各个位置的点扩散函数，求出后对各个点进行反卷积运算，可以得到更清楚的物体三维表面信息。
光波的传递过程可以用f＝Hg表示，f表示记录的光场，H表示被记录的物体，算符g表示光波从物体到传感器表面的传播过程。对于被记录物体的每一点都有不同的深度，其光波到传感器表面的传播过程也有不同的表达式来表达，由于光场记录表面结构的三维信息，可以通过对f不同深度的积分运算确定物体表面的三维结构V＝∫fdxdy。把每一个可分辨的物体样品表面当作记录的体素V，物体真实的表面信息为O，因为知道每个体素的深度信息s，把光的点扩散函数(PSF)分布用泊松分布近似，将深度信息带入，可得到V＝O*PSF(s)。所以对V进行反卷积处理，可以算得每一个体素的表达，对记录的光场图像进行了滤波处理，从而得到了较为清晰的结果。
5、将不同深度的高分辨率图像进行三维重构，完成微观三维图像显示。
如图3所示，对比可以得到，经过本实施例的三维超分辨微观显示方法处理后的重聚焦光场图像(右)分辨率要远远大于原始光场图像(左)重聚焦的分辨率。

Claims (8)

1.一种移频光场显微镜，包括载物台、照明模块、显微模块、图像获取模块和图像处理模块，其特征在于，
所述照明模块布置在载物台的下方，可以对样品进行不同角度地照射；
所述图像获取模块获取各个角度光照射样品所得到的光场图像；
所述图像处理模块通过对光场图像重聚焦得到各个深度的图像；得到每个深度的所有图像后，进行频谱迭代处理，得到各深度下的高分辨率图像；将得到的高分辨率图像进行滤波处理后，再通过不同深度的高分辨率图进行三维重构。
2.如权利要求1所述的移频光场显微镜，其特征在于，所述显微模块的微透镜阵列采用蜂窝状排布。
3.如权利要求2所述的移频光场显微镜，其特征在于，所述微透镜阵列中的微透镜形状为圆形。
4.如权利要求1所述的移频光场显微镜，其特征在于，所述照明模块采用LED照明阵列，所述LED照明阵列的中心与显微模块的中心在同一光轴上。
5.如权利要求4所述的移频光场显微镜，其特征在于，所述LED照明阵列的数量大于5×5。
6.一种三维超分辨微观显示方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过光学显微镜记录多个角度光照射样品时得到的光场图像；
(2)对步骤(1)得到的光场图像重聚焦得到各个深度的图像；
(3)对步骤(2)得到的各个深度的图像进行频谱迭代处理，得到各个深度下的高分辨率图像；
(4)将步骤(3)得到的高分辨率图像进行滤波处理；
(5)将步骤(4)处理后的不同深度的高分辨率图进行三维重构。
7.如权利要求1所述的三维超分辨微观显示方法，其特征在于，步骤(4)中，滤波处理采用盲卷积处理算法。
8.如权利要求1所述的三维超分辨微观显示方法，其特征在于，步骤(1)中，多个角度光照射是指矩阵排布的光源在样品下方分别进行照射。
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