JP6511433B2 - ランダムアクセス誘導放出抑制（ｓｔｅｄ）顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、撮像技術、特に、アッベ回折限界を解決することができる、高速で超解像の顕微鏡技術に関する。

生物材料の研究のために開発された技術の間で、多重格子（ＭＰ）顕微鏡はそのような材料を撮像するのに必須のツールとなってきている。疾病関連の遺伝子を導入した動物モデルと、電位感受性あるいはカルシウム感受性の指示薬等の、一般に符号化された細胞機能の分子蛍光探り針とを組み合わせることにより、現在、ＭＰ顕微鏡は生きている脳細胞を研究するための最適な手段であると考えられている。

ニューロンは、ミリ秒範囲の膜電位の変化により情報を伝達する。脳活動の記録には異なる空間スケール、すなわち３次元の高い時間分解能で機能できる解像技術が要求される。実際に、たとえニューロン単体の活動を考えたとしても、ニューロン信号は樹状突起及び軸索のセグメントを介して空間及び時間的に別々に分配される。

脳機能のある程度大きなスケール態様が個々のニューロンの電気特性に起因するかもしれないことが示されている。それにも拘わらず、近接配置されたニューロンは活動パターンが大きく相違する一方、十分に離れた細胞が軸索処理を介して互いに影響することにより同一の機能回路に属していることがある。したがって、脳機能を組織的に分析するための効率的な手法として、脳容量の隅々まで多くの細胞の電気的な活動を同時にモニターすることが必要とされる。

高速の液体レンズ、可変ミラー、時間空間多重送信、アキシコン又は平坦な照明下での撮像、ホログラフィースキャニング、及び、シヌソイド及び非線形共鳴を使用したピエゾスキャニングを含む数々の技術が、脳細胞を３次元（３Ｄ）測定するために開発されている。慣性のない音響光学デフレクター（ＡＯＤ）は、米国特許公開第2007/0201123号明細書に記載されるように、機械的な動きなしにレーザ光のランダムアクセス撮像及び高速変更集光を行うために使用されてきた。ＭＰ顕微鏡を、このような２次元（２Ｄ）又は３次元（３Ｄ）のビームスキャニング（ランダムアクセス多重格子顕微鏡−ＲＡＭＰ）の組み合わせは、脳機能を研究するための最も適切なアプローチの１つであることを示している。

光学スキャニング固有の利点にも拘わらず、ＭＰ顕微鏡は回折によって制限される空間分解能があり、相対的に高い励起波長値の障害を受ける。これにより、ＲＡＭＰ顕微鏡の空間分解能は改良されなければならないが、それは高時間分解能に影響せずに改良されている。

現在、回折限界を克服し、蛍光顕微鏡の空間分解能を増大させるための最適な手法の１つが誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）技術である。そのような手法の基本的な原理は、隣接する要素が誘導放出処理によって時間的に連続して放出するような予め決められたサンプルの座標で、自然蛍光放出を抑制することに基づいている。最も一般的なＳＴＥＤの構成は、誘導放出を誘導する異なる波長の第２レーザ光に重畳された、規則正しく集光された励起レーザ光を出力し、ドーナツ状の焦点形状等の少なくとも１つの強度ゼロ地点を有する。

２００９年、多重格子ＳＴＥＤ顕微鏡技術が提案され、ＳＴＥＤの超分解能を備えた２光子励起（２ＰＥ）の利点を組み合わせている。ＳＴＥＤ顕微鏡の最近の改良は２光子励起と１光子励起のために同一波長を使用することである。これにより、そのような超分解能顕微鏡のデザイン及び撮像構成が共に簡略化される（米国特許公開第2009/0121153号明細書及び米国特許公開第2011/0031411号明細書参照）。

米国特許公開第2007/0201123号明細書 米国特許公開第2009/0121153号明細書 米国特許公開第2011/0031411号明細書

本発明の１つの目的は、超分解能顕微鏡又はリソグラフィ装置が、それぞれ高速現象又はナノ構造物品の生成の研究を可能とするためのスキャニングシステム提供することである。

本発明の他の目的は、迅速に異なる手法で、所定容量内の予め決められた複数の位置で２つの光ビームの焦点を方向付けることができる光学スキャニングシステムを提供することである。

これら及び他の目的は本発明に係る光学スキャニングシステムによって達成される。
すなわち、光学スキャニングシステムは、
第１及び第２光ビームを案内する光学システムと、
前記第１及び第２光ビームを直接種々の方法で偏向する偏向手段と、
を備え、
前記偏向手段は、少なくとも１つの音響光学デフレクターを備え、前記光学システムは、前記第１及び第２光ビームが前記少なくとも１つの音響光学デフレクターを介して反対方向に伝播させるように配置され、前記少なくとも１つの音響光学デフレクターは、同時に又はパルスシーケンスで前記第１及び第２光ビームを偏向するために操作可能である。

本発明は、蛍光顕微鏡及び脳細胞の機能イメージングの分野に関して特別に発明されたものではあるが、実際には、ナノ印刷技術、ナノ加工、光学情報検索及び記憶装置、及び、高速の現況を含む他の分野等、他の分野でも有用である。

本発明によれば、２つの光ビームがランダムアクセススキャニングシステムに反対側から入り、各ＡＯＤ要素を介して反対方向に伝播する。この構成はＡＯＤの最大偏向効率を活用し、両光ビームがＡＯＤによって要求される偏光に合致し、同一波長を有する。これにより、各ＡＯＤ要素のための１つの音響制御波長で十分である。ＡＯＤ要素の数に依存して、種々の方向でスキャニングすることができるシステムを提供することもできる。すなわち、単一のＡＯＤで、１次元（１Ｄ）のスキャンを実行できる一方、４つのＡＯＤで、３次元（３Ｄ）のスキャンを実行できる。

本発明の好ましい実施形態では、本発明は、ターゲット材料内に含まれる励起性化学種の分子を励起した状態とするために、ターゲット材料に照射する装置に関する。この装置は、
本発明に係る光学スキャニングシステムであって、前記第１光ビームが前記分子を励起状態へと励起させるのに適しており、前記第２光ビームが前記励起状態の前記励起分子の数を抑制するのに適した光学スキャニングシステムと、
前記第１及び第２光ビームが前記ターゲット材料に、それぞれ移動可能で、部分的に重なる照射領域を形成するように、前記第１及び第２光ビームを前記ターゲット材料に方向付ける手段と、
を備える。

本発明の特に好ましい実施形態では、ＲＡＭＰ技術と単一波長の２光子励起ＳＴＥＤ（ＳＷ ２ＰＥ−ＳＴＥＤ）技術を組み合わせた光学方式を提供し、結果として「ランダムアクセス誘導放出抑制（ＲＡＳＴＥＤ）顕微鏡」として定義される高速超分解能顕微鏡が得られる。そのような技術は、従来のレーザスキャニングシステムの相対的に長い時間を必要とすることなしに、サンプル中の関心物の状態の超分析撮像のための手法を提供する。また、そのような高速スキャニングは、ニューロン内での電気信号伝達等の現象を観察するために必要とされる。

一定周波数の音波を有する従来技術に係る音響光学デフレクターの回路図である。 本発明に係る２つの対向伝播光ビームを偏向する一定周波数の音波を有する音響光学デフレクターの回路図である。 好ましい２次元ランダムアクセス多重光子超解像ＳＴＥＤ顕微鏡の回路図である。 顕微鏡の解像度を改良するために、図３に係る顕微鏡のビーム整形装置に適用されるべき好ましい位相マスクの略図を示す。 好ましい３次元ＡＯＤスキャニングシステムの回路図である。

本発明に係るシステムのさらなる特徴及び利点は、単に限定されない例として提供された添付図面を参照して、後述する本発明の実施形態の詳細な説明から明らかとなるであろう。

まず図１を参照すると、ドライバ装置１４０は音響光学デフレクター（ＡＯＤ）を介して伝送される音波１３０を生成する。音波１３０は一定の周波数を有し、ＡＯＤ１００を通過して伝送される。またＡＯＤ１００は、その一部が１２０によって示される入射光ビーム１１０を受信し、回折されるか、又は、偏向されて、光ビーム１１０と音波１３０の間に相互作用を及ぼす。偏向光ビーム１２０が角度θで偏向されるが、それは音波の周波数に依存している（この原理のより詳細な論考は、ここで参照文献として引用した米国特許公開第2007/0201123号明細書で提供される。）。したがって、音波１３０の周波数の変化は、入射光ビームが偏向される角度θを変更する。運動量保存の法則で示されるように、偏向光ビーム１２０は、音波１３０が伝播する（すなわちドライブ装置１４０から離れる）のと同一方向に偏向される。

ＡＯＤ１００が伝送方向に対して対称であるので、第２光ビーム１１０ｂが第１光ビーム１１０とは反対側でＡＯＤ１００内に入ると、この第１光ビーム１１０に対して同時に又はパルスシーケンスで、各入射ビーム１１０，１１０ｂの一部１２０，１２０ｂが回折又は偏向されて、それぞれ角度θ及びθｂで、音波１３０と光ビーム１１０及び１１０ｂの間に相互作用をもたらす。

図３は好ましいランダムアクセスＳＴＥＤ顕微鏡の略図を示す。

前述の顕微鏡は、光源１０、特にレーザ源、例えば、調整可能なパルスの超高速Ｔｉ、すなわちサファイアレーザを備え、それは１４０ｆｓのパルス幅を有する８０Ｍｈｚの繰り返し周波数で駆動する。光源１０は、半波プレート１６を通過する偏向した光ビーム１５を放射し、２つの光ビーム１１０及び１１０ｂを得るために偏向ビームスプリッター１７を通過する。第１光ビーム１１０が多重光子励起ビームとしてふるまう一方、第２光ビーム１１０ｂは抑制ビームとしてふるまう。２つのビームのパルスは、サンプルに到達する際に同期しなければならないため、遅延ライン２１は第２光ビーム１１０ｂの光路に沿って設けられている。さらに第２光ビーム１１０ｂは、２５０ｐｓのパルス長に到達するために、パルス伸張装置２２によって引き延ばされている。伸張装置は、３つの２０ｃｍのガラス棒と、１００ｍの単一モードの定偏波（ＰＭ）光ファイバーとによって実現されるのが好ましい。光ファイバーの出力は、そこでの偏光が第１光ビーム１１０の偏光と合致するように回転される。しかしながら、光子やプリズムを使用する等、他の伸張装置による実現も可能である。

第１光ビーム１１０の時間分散の前置補償を実現するため、プリチャープ装置２３が前記光ビームの光路に沿って配置されている。好ましくは、そのような装置は光子によって実現されてもよいが、プリズムに基づいてもよい。

好ましくは、励起ビームのパルス長は１ｐｓ以下、特に好ましい態様では、焦点位置で１５０ｆｓと等しい。また、好ましくは、抑制ビームのパルス長は５０ｐｓ以上、特に好ましい態様では、２００ｐｓと２ｎｓの間である。

前述の構成要素は、前述の特徴を有する、同期可能なパルス１１０及び１１０ｂを備えた２つの光ビームを生成する生成ブロック３０を形成する。単一のレーザ源の代替手段として、生成ブロックは幾つかの光源を有するシステムを備えてもよい。

２つのミラーセット３５のそれぞれを介して、光ビーム１１０及び１１０ｂは音響光学デフレクター（ＡＯＤ）に基づいて２次元のランダムアクセス光学スキャニングシステム８０に進入する。光ビーム１１０及び１１０ｂは同一偏光及び同一波長を有し、２つの偏光ビームスプリッター８１によってスキャニングシステムに合流する。好ましくは、第１光ビーム１１０は、予め決められたｘ軸に沿ってスキャンすることを意図した第１ＡＯＤ１００．１に衝突した後、ｙ軸に沿ってスキャンするために、９０度回転された第２ＡＯＤ１００．２、続いて光子又は他のＡＯＤによって実現される４５度回転された空間分散補償要素８３に衝突する。この位置で、ビームスプリッター８１を介してスキャニングシステム８０を出る際、第１光ビーム１１０は、このシステム内に侵入した方向と直交する偏光を有する。このため、スキャニングシステム８０は奇数個の複屈折要素を備える。しかしながら、空間分散補償要素８３は４５度回転されるので、間にＡＯＤ又は光子を有する２つの半波プレートを備える。一連のＡＯＤに基づく単一のビームスキャニングシステムのより詳細な論考は、ここで参照文献として引用された米国特許公開第2007/0201123号明細書で提供される。

第２光ビーム１０２は、３つの要素１００．１，１００．２及び８３を通過し、逆順で、すなわち、まず要素８３、続いて要素１００．２、最後に要素１００．１の順で通過する第１光ビームに対して反対方向に伝送する。

スキャニングシステム８０を離れた第２光ビーム１１０ｂは、ビーム整形装置４０、好ましくはボルテックス位相プレートを通過する。位相マスクのある公知の例が図４に示されており、４１はボルテック位相マスクを示し、４２は同心位相マスクを示し、４３は半月位相マスクを示す。これらのマスクは位相プレート又は空間光学モジュレータで得られてもよい。半月位相マスクは１次元スキャニングシステムで使用されるのが好ましいが、同心位相マスクは３次元スキャニングシステムで使用される。いずれの場合であっても、全ての組み合わせが可能である。

２つの光ビーム１１０及び１１０ｂは、９０度毎に光ビーム１１０ｂの偏光を回転させる半波プレート４５と、偏光ビームスプリッター４６とによって合流する。合流したビームは、互いに直交する線形偏光を有し、光ビームの円形偏光を得るために、短路ビームスプリッター５１と１／４波プレート５２を介して対物レンズ５０に向かって方向付けされ、蛍光サンプル６０に焦点を合わせる。サンプルによって放射された蛍光６３は、対物レンズ５０によって集められ、ビームスプリッター５１を通過した後、検出器７０、好ましくは光電子増倍管で必要とされる。

スキャニングシステム８０は、（各ＡＯＤに関係するそれぞれのドライブ装置を制御する）コンピュータ７５によって制御され、コンピュータは検出器７０によって必要とされる画像を復元して表示する。

また、図３は、全てのＡＯＤを光学的に位置決めするように機能するレンズシステム７７と共役面での位相マスクを示す。

図５は、３次元ランダムアクセススキャニングユニットの実施例を示す。図３に示すものに対応する部位は同様な参照符号によって示されている。

図５に示す実施例は、水平及び軸方向の２つのビーム１１０及び１１０ｂの焦点でスキャンを実行することができる４つのＡＯＤ１００．１，１００．２，１００．３，１００．４と、空間分散補償とを備え（この関連として米国特許公開第2007/0201123号明細書参照）、半波プレート８４が奇数の複屈折要素を得るために挿入されている。

Claims (9)

1. 第１及び第２光ビーム（１１０，１１０ｂ）をガイドするための一対の光学要素（８１）と、
   前記第１及び又は第２光ビームを、方向変更可能な手法で偏向するための偏向手段と、
   を備え、
   前記偏向手段は、少なくとも１つの音響光学デフレクター（１００．１，１００．２，１００．３，１００．４）を備え、
   前記一対の光学要素は、前記第１及び第２光ビームが前記少なくとも１つの音響光学デフレクターを介して反対方向に伝播させるように配置され、前記少なくとも１つの音響光学デフレクターは、同時又はパルスシーケンスで、前記第１及び第２光ビームを偏向するために制御可能である光学スキャニングシステム（８０）。
2. 前記第１及び第２光ビームを生成するための生成手段（３０）を備え、
   前記生成手段は、第１及び第２光ビームが前記少なくとも１つの音響光学デフレクター内に進入する際、同一の波長と偏光を有するように設計されている請求項１に記載のシステム。
3. ターゲット材料に含有される励起性化学種の分子を励起状態に励起させるために、ターゲット材料を照射するための装置であって、
   請求項１又は２に記載の光学スキャニングシステム（８０）と、
   前記第１及び第２光ビームが前記ターゲット材料上にそれぞれ移動可能で部分的に重なった照射領域を形成するように、前記第１及び第２光ビームを前記ターゲット材料上に方向付けるための手段と、
   を備えた装置。
4. 前記光学スキャニングシステム（８０）は、前記偏向手段が、少なくとも１つの音響光学デフレクター（１００．１，１００．２，１００．３，１００．４）を備え、前記一対の光学要素が、前記第１及び第２光ビームが前記少なくとも１つの音響光学デフレクターを介して反対方向に伝播させるように配置され、前記少なくとも１つの音響光学デフレクターは、同時又はパルスシーケンスで、前記第１及び第２光ビームを偏向するために制御可能である、請求項３に記載の装置。
5. 前記光学スキャニングシステムは、前記第１光ビームが前記励起性化学種の分子を前記励起状態に励起させるのに適合し、前記第２光ビームが前記励起状態の励起分子の数を抑制するのに適合する、請求項３又は４に記載の装置。
6. 誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）光学顕微鏡のための装置を備え、
   前記第１光ビームは短パルス励起ビームで構成され、前記第２光ビームは長パルス励起ビームで構成されている請求項３から５のいずれか１項に記載の装置。
7. 前記励起ビームのパルス長は１ｐｓ以下であり、抑制ビームのパルス長は、５０ｐｓ以上である請求項６に記載の装置。
8. 励起ビームと抑制ビームは共に、前記スキャニングシステム内への進入時、線形状に偏光されている請求項６又は７に記載の装置。
9. 抑制ビームを整形し、光学スキャニングシステムの後と、前記第１及び第２光ビームが一緒になる前とで活性平面に配置されるビーム整形装置（４０）を備えた請求項６から８のいずれか１項に記載の装置。

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