JP5926266B2 - 切り替え可能な動作形態を有するレーザ走査顕微鏡 - Google Patents
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Description
要求が変化する生物学的試料での顕微鏡、例えば進入深度が制限されていて、強く散乱した媒体中の顕微鏡および/または動的なプロセスを観察するための生体セル顕微鏡、または拡散プロセスを顕微鏡的に分析する際には、散乱した媒体への進入深度、試料保護(ブリーチング、光毒性)、画像記録速度およびROI(関心領域)マニピュレーションに関する柔軟性に高い要求が存在する。
欠点は、レーザシステムが非常に高価であること、色素の選択が制限されること、試料負荷である。
ここでは所定の試料領域が目的通りにブリーチング(褪色)され、引き続きその回復特性を時間的に検知する。これに関して、蛍光がブリーチングするまで、試料の選択領域を目的通りにおよび高い強度で照射するためには個別スポットモード(シングルスポット)が必要である(特許文献3参照)。そして拡散過程による蛍光の回復が可能な限り高速の画像形成により測定される。そのためには、回復の勾配はブリーチングの終了直後が最大であるため、ブリーチング過程と画像形成過程とを高速に切り替えるのが有利である。
FMMでは励起レーザ光の半分が(直径で)位相変調される。顕微鏡対物レンズによるフォーカシングの際に、この半分の位相変調が焦点容積内に強度変調を引き起こす。この強度変調は、焦点上にあるピンホールの後での例えばロックイン検出によって検出することができる。この方法の利点は、弾動光子、すなわち散乱されない光子であって、焦点に光分布を形成する光子だけがこの変調信号に関与し、これらの光子が信号光子の時間的強度変調を引き起こすことである。例えば強く散乱した媒体内で何度も散乱した光子はしっかりした位相関係を失い、焦点内での時間に依存する干渉構造には寄与せず、ひいてはロックイン復調された信号には寄与しない。これにより散乱された光によるバックグランドが強く低減され、レーザ共焦点顕微鏡に比較的正確に試料を結像することのできる深度が上昇する。
FMMは、強く散乱した媒体内のレーザ走査顕微鏡(LSM)に対しては有利に使用することができ、多光子励起顕微鏡[特許文献2]に対する択一的手段を提供する。
しかしフレキシブルに使用可能なLSMについては、とりわけ生体セル研究での使用に対してさらなる要求が生じる。この要求の一部はLSM、とりわけ多光子励起顕微鏡の現行の形状と調和させるのが困難である。ここでは基準として、とくに記録速度(動的なプロセスの観察)と試料負荷(光毒性、動的なプロセスの長時間観察の際のブリーチング)を挙げられる。
本発明は、独立請求項の特徴部分によって特徴付けられる。
有利な改善形態は従属請求項の対象である。
図1は、LSMのフレキシブルなマルチモードアプローチのためのビーム切り替えおよびビーム変調を実行する構成を示す。図面および明細書に詳細に説明されたセグメント化されたEOM(s−EOM)によりマルチモードLSMが例えば、
・シングルスポットLSM
・マルチスポットLSM
・シングルスポットFMM
・マルチスポットFMM
・FRAPシステム
として駆動され、さらにこれらの動作状態の間を往復して高速に切り替えることができる。
S−EOMにはλ/2プレートP1とP2が前置および後置接続されている。
PBS1の反射方向には光シャッタS1と、レーザ光からマルチスポットを形成するためのMSモジュールとが設けられている。レーザ光はミラーを介してPBS2から走査モジュールを有する顕微鏡Mの方向に再び入力結合される。さらに透過方向で両方のPBSの間に第2の光シャッタS2を有利に配置することができる。
シャッタとS−EOMも同様に制御ユニットASと接続されており、制御ユニットは種々の動作モード間の切り替えを制御する。
したがって表1の個々の動作モードについて、レーザビームは図1に示したエレメントを介して以下のようにビーム経過する。
1. P1、EOM、P2、PBS1、S2、PBS2を介して方向Mに
2. P1、EOM、P2、PBS1、S1、MS、PBS2を介してMに
3. P1、EOM、P2、PBS1、S2、PBS2を介してMに
4. P1、EOM、P2、PBS1、S1、MS、PBS2を介してMに
5. P1、EOM、P2、PBS1、S2、PBS2を介してMに
図2は、電気光学的変調器(EOM)を示す。
励起光線の半分は、1つまたは複数のEOMの一部を逆極性に制御することにより異なって(逆相に)変調される。
電気光学的変調器は、二重屈折結晶内のポッケルス効果を利用する。ポッケルス効果では、電圧を結晶に印加することにより、その異方性屈折率が変化する。このことは、通過するレーザ光の偏光または位相を走査するのに利用される。ポッケルス効果はほとんど即時に生じ、これにより変調を結晶の種類と大きさに応じて非常に高速に行うことができる(最大数10MHz)。
並置される、または互いにずらし、向き合って配置される電極により形成される逆相の場E1、E2を有するEOMが図2に概略的に示されている。
EOMは、非特許文献1、非特許文献2によれば照明ビーム路、有利には拡張された(視準化された)ビーム区間に配置される。
図2の左では上方と下方の2つの半分ビームが、上側部分と下側部分とで逆相に極性付けられた電極により異なって変調される。
図2の右部分には側面図が概略的に示されており(左部分の矢印方向)、制御される区間は有利には互いに側面がずらされている。
逆相に極性付けられた実施例は、例えば結晶を変調すべきでないが、一方の側から他方の側へのクロストーク効果を回避すべき場合に有利である。逆相の制御により、さらに有利にはストローク間隔(逆に経過する振幅の間隔)が、単相の制御と比較して倍になる。所望の位相(ストローク)を区別する場合、これにより有利には結晶も短縮できる(伝搬長の短縮)。さらにEOMの制御される領域をずらして配置することにより、両方のビーム領域をオーバラップすることができる(半分を超えて)。
後で明らかになるように、EOMは別の動作モードでも同じ構成で、シングルスポット変形例での駆動のために、好ましくはFRAPのために驚くことには有利に使用できる。
交番電場を形成するための電極1と2は、結晶の下面に対応する対向電極を有する(分かりやすくするため図示されていない)。
・(異方性)等方性結晶軸に対して45°でレーザ偏光→光は(異方性)等方性伝搬方向に均等に分割される。電極に印加される電圧に応じて(異方性伝搬成分の遅延)、結晶から出た後に両方の成分が重なると新たな位相状態が調整される。これは半波遅延では例えば線形の90°回転、または四分の一波遅延では円偏光である。
Claims (10)
- 異なる複数の動作モード間で切り替えることのできるレーザ走査顕微鏡であって、
前記異なる複数の動作モード間で切り替えるために照明ビームの第1のビーム路に設けられた電気光学的変調器(EOM)と、
該電気光学的変調器に対して前置された調整可能な第1の偏光回転素子と、
該電気光学的変調器に対して後置された調整可能な第2の偏光回転素子と、
該電気光学的変調器に対して後置され、前記第1のビーム路から分岐する第2のビーム路を形成するための少なくとも1つの第1の偏光スプリッタとを備える、レーザ走査顕微鏡。 - 請求項1に記載のレーザ走査顕微鏡であって、
前記第1の偏光回転素子は、前記電気光学的変調器の動作モードに応じて調整され、
前記第2の偏光回転素子は、前記第1または前記第2のビーム路に応じて調整される、レーザ走査顕微鏡。 - 請求項1または2に記載のレーザ走査顕微鏡であって、
前記少なくとも1つの第1の偏光スプリッタに対して光方向で後置された第2の偏光スプリッタをさらに備え、
前記第2の偏光スプリッタは、前記第1および前記第2のビーム路の統合を行い、
前記電気光学的変調器は、少なくとも2つの動作状態(B1、B2)の間で切り替え可能であり、
前記少なくとも2つの動作状態の間で切り替えることは、
B1.偏光の切り替え、
B2.焦点変調(FMM)を形成するために電気光学的変調器の異なる領域を異なって変調することである、レーザ走査顕微鏡。 - 請求項1乃至3のいずれか1項に記載のレーザ走査顕微鏡であって、
前記第1および第2の偏光回転素子は、λハーフプレートである、レーザ走査顕微鏡。 - 請求項1乃至4のいずれか1項に記載のレーザ走査顕微鏡であって、
前記第2のビーム路には、照明ビームの形状を変更する光影響手段が設けられ、
前記光影響手段は、少なくとも2つの部分ビームへのビーム分割部を含む、レーザ走査顕微鏡。 - 請求項1乃至5のいずれか1項に記載のレーザ走査顕微鏡であって、
部分ビームは、互いに角度をなす、レーザ走査顕微鏡。 - 請求項3乃至6のいずれか1項に記載のレーザ走査顕微鏡であって、
前記第2のビーム路中で前記光影響手段の前方および前記第1のビーム路中で前記第1および前記第2の偏光スプリッタの間のうちの少なくとも一方には制御可能な光シャッタが設けられている、レーザ走査顕微鏡。 - 請求項1乃至7のいずれか1項に記載のレーザ走査顕微鏡の構成要素を備える、レーザ走査顕微鏡の照明ビーム路における構成要素群。
- 請求項1乃至8のいずれか1項に記載のレーザ走査顕微鏡のための方法であって、
前記レーザ走査顕微鏡は、前記異なる複数の動作モードを、
・シングルスポットレーザ走査顕微鏡として動作する動作モード
・マルチスポットレーザ走査顕微鏡として動作する動作モード
・シングルスポット焦点変調として動作する動作モード
・マルチスポット焦点変調として動作する動作モード
・光褪色後蛍光回復法システムとして動作する動作モード、のうちの少なくとも2つの動作モードの間で切り替える、方法。 - 請求項9に記載の方法であって、
前記動作モードの切り替えは、ブリーチング過程または試料領域のマニピュレーションの後に、レーザ走査顕微鏡のマルチスポットの照明ビームを形成するマルチスポットモードへの切り替えが即時に行われるように実行される、方法。
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