JPH11326775A

JPH11326775A - 多光子励起レ―ザ顕微鏡

Info

Publication number: JPH11326775A
Application number: JP11061495A
Authority: JP
Inventors: Masaharu Tomioka; 正治富岡
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1998-03-11
Filing date: 1999-03-09
Publication date: 1999-11-26
Anticipated expiration: 2019-03-09
Also published as: JP4406108B2

Abstract

(57)【要約】【課題】光路上に選択的に配置可能な光学部材の光路長
に応じて、容易に最適な条件で観察が可能なレーザ顕微
鏡を提供する。【解決手段】多光子励起走査型レーザ顕微鏡は、波長幅
を有するパルスレーザビームを発振するレーザ光源４を
有する。パルスレーザビームの照射により標本Ｓは多光
子励起現象で蛍光する。レーザビームの光路を形成する
光学系３は、プレチャープコンペンセータ６と、走査光
学ユニット７と、光路上に択一的に配置可能な倍率の異
なる複数の対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃと、を有
する。光学系３は、対物レンズのいずれを選択した場合
にも、断面Ｓ’におけるレーザビームのパルス幅を一定
にするための補正機構２２を有する。補正機構２２は、
光路上に択一的に配置可能な複数の補正板２３ａ、２３
ｂ、２３ｃを有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はパルスレーザビーム
を観察対象である標本に照射するタイプのレーザ顕微鏡
に関し、特に、標本の多光子吸収による化学反応及び蛍
光を検出するための多光子励起走査型レーザ顕微鏡に関
する。

【０００２】

【従来の技術】多光子励起法は、通常の１光子（単光
子）で行われる励起を多光子で行う方法である。例えば
２光子励起法では、４００ｎｍ（単光子）の波長で行っ
ていた蛍光励起が倍の波長８００ｎｍで行われる。この
波長８００ｎｍでは２光子を用いて蛍光励起が行われ
る。

【０００３】通常、蛍光顕微鏡に使用される水銀ランプ
や連続発振のレーザでは、単位時間当たりの光子密度が
低いため、多光子励起現象を引き起こすためには、莫大
な光強度が必要とされる。更に、光学系や標本へのダメ
ージが大きくなる等の問題を解決しなければ実用には適
さない。

【０００４】このため、多光子励起法の光源としては、
例えばサブピコ秒のパルスレーザビームを発振可能なも
のが用いられる。これは多光子励起現象がその単位面
積、単位時間当たりの光子密度の２乗にほぼ比例した確
率で発生するためである。このため、サブピコ秒のパル
スレーザビームでは、複数の光子が存在する確率が高く
なる。

【０００５】例えば、特表平５−５０３１４９号公報に
は、サブピコ秒のパルスレーザビームを出射するレーザ
光源と、このレーザ光源から出射されたパルスレーザビ
ームで標本面（焦点面）を走査するための走査光学ユニ
ットとを組合わせた２光子励起走査型レーザ顕微鏡が記
載される。

【０００６】一方、多光子励起に用いられるレーザ光源
から出射されるサブピコ秒のパルスレーザビームは、完
全に単色でなく、そのパルス幅と相関を持つある波長幅
を有する。一般的に、光は、光学系を通過する場合、波
長が短いほど媒質中での速度は遅く、波長が長いほど媒
質中での速度は速くなる特性を有する。従って、上述の
如くパルスレーザビームが波長幅を有していると、パル
スレーザビームが光学系を通過する際、波長によって通
過時間に差が生じる。その結果、光学系に入射する前の
パルス幅に比べ、光学系を通過した後のパルス幅が時間
軸方向に広がってしまう。

【０００７】多光子励起現象が生じる確率は、光子密度
に依存するため、光学系の標本面（焦点面）上でのパル
ス幅の広がりは、多光子励起現象が発生する確率を低下
させる。従って、標本面上でパルス幅をなるべく広がら
ないようにすることが望まれる。

【０００８】このような問題を解決するための一般的な
方法として、所謂プレチャープコンペンセーションが知
られている。プレチャープコンペンセーションは、パル
スレーザビームをプリズムペア若しくはグレーティング
ペアに通すことにより、短い波長側の光を先に出す、言
い換えれば長い波長側の光を遅らせるという方法であ
る。

【０００９】この方法は、例えば文献「Femtosecond pu
lse width control in microscopyby two-photon absor
ption autocorrelation; G.J. Brakenhoff, M. Muller
& J. Squier; J. of Microscopy, Vol. 179, Pt. 3, Se
ptember 1995, pp. 253-260」に記載される。詳しい説
明は省略するが、この文献には、プレチャープコンペン
セータとして使用されるプリズムペア若しくはグレーデ
イングペアを移動調整することにより標本面でのパルス
レーザビームのパルス幅を任意に可変できることが記載
される。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかし、多光子励起走
査型レーザ顕微鏡が、択一的に使用される複数の対物レ
ンズを有する場合、対物レンズが夫々異なる光路長を有
するため、プレチャープコンペンセータによる補正の程
度も各対物レンズに応じて異なってくる。即ち、プレチ
ャープコンペンセータを、ある１つの対物レンズに合わ
せて標本面におけるパルスレーザビームのパルス幅が最
小となるように調整しても、他の対物レンズの場合は標
本面におけるパルス幅が広がってしまう。ここで、本明
細書において、単に光路長という場合は、光学素子の幾
何学的長さではなく、光学素子が形成する光路の光学的
長さを意味するものとする。

【００１１】この走査型レーザ顕微鏡においても、顕微
鏡観察と同様に、先ず広範囲の観察が可能な低倍率の対
物レンズを使用して標本における観察対象を検索し、こ
の後に細部を観察するための高倍率の対物レンズに切替
えて使用するのが一般的である。この際、対物レンズを
切替えることによって標本面でのパルスレーザビームの
パルス幅が変化すると、最適な条件で多光子励起現象を
引き起こすことができなくなる。

【００１２】もし、この問題をプレチャープコンペンセ
ータの調整により対応しようとすると、その調整に費や
す時間に比例して標本から発せられる蛍光が褪色してし
まうという問題が発生する。標本の蛍光の褪色を防ぐ対
策としては、プレチャープコンペンセータの調整時に観
察視野内から標本を移動するといった方法が考えられ
る。この方法では、プレチャープコンペンセータの調整
後に再び観察視野内に標本を移動しなければならない。
しかし、標本を移動前と全く同じ位置に戻すことは非常
に困難であるため、この方法は観察及び測定に対して実
用的ではない。

【００１３】本発明の目的は、波長幅を有するパルスレ
ーザビームを使用する多光子励起レーザ顕微鏡におい
て、光路上に選択的に配置可能な光学部材の光路長に応
じて、容易に最適な条件で観察することを可能とするこ
とである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明の第１の視点は、
多光子励起レーザ顕微鏡において、観察対象の標本を配
置するための配置部と、多光子励起現象により蛍光を発
するように前記標本を励起するためのパルスレーザビー
ムを出射するためのレーザ光源と、前記標本の蛍光を検
出するための検出器と、前記レーザ光源から前記標本へ
前記パルスレーザビームを導くために前記パルスレーザ
ビームの光路を形成する光学系と、を具備し、前記光学
系は、前記パルスレーザビームが前記光学系を通過する
際に、前記パルスの波長幅に起因して生じる前記パルス
レーザビームのパルス幅の広がりを抑制するため、前記
光路上に配設されたプレチャープコンペンセータと、前
記光路上に選択的に配置可能な光学部材と、前記光学部
材の光路長に対応し、前記光学系の焦点面における前記
パルスレーザビームのパルス幅が一定となるように前記
光路の光路長を補正するための光学的補正手段を具備す
る補正機構と、を有することを特徴とする。

【００１５】本発明の第２の視点は、第１の視点の多光
子励起レーザ顕微鏡において、前記光学系は、前記標本
を前記パルスレーザビームで走査するための走査機構を
更に有することを特徴とする。

【００１６】本発明の第３の視点は、第１の視点の多光
子励起レーザ顕微鏡において、前記光学部材は、前記標
本に対して前記パルスレーザビームを集光するように、
前記光路上に択一的に配置可能な複数の対物レンズであ
ることを特徴とする。

【００１７】本発明の第４の視点は、第１の視点の多光
子励起レーザ顕微鏡において、前記光学部材は、前記標
本に対して前記パルスレーザビームを集光するように、
前記光路上に択一的に配置可能な複数の対物レンズと、
前記プレチャープコンペンセータと前記対物レンズとの
間に挿脱自在に設けられた平坦な光学素子とであること
を特徴とする。

【００１８】本発明の第５の視点は、第４の視点の多光
子励起レーザ顕微鏡において、前記平坦な光学素子は、
ノマルスキー式の透過光観察用の光学素子であること
と、前記顕微鏡は、前記パルスレーザビームの前記標本
を透過した透過光を検出するための光学系及び検出器を
更に具備することとを特徴とする。

【００１９】本発明の第６の視点は、第１の視点の多光
子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正手段は、
前記光学部材の切替えに連動して切替えられることを特
徴とする。

【００２０】本発明の第７の視点は、第１の視点の多光
子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正手段は、
前記光路上の前記パルスレーザビームが平行光束で且つ
前記光束の角度変化がない位置に配置されることを特徴
とする。

【００２１】本発明の第８の視点は、第１の視点の多光
子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正手段は、
前記光学部材の光路長に応じて、前記光路の光路長が一
定となるように前記光路上に択一的に配置可能な複数の
光学的補正素子であることを特徴とする。

【００２２】本発明の第９の視点は、第１の視点の多光
子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正手段は、
前記光学部材の光路長に応じて、異なる電圧を印加する
ことにより、前記光路の光路長が一定となるように調整
可能な光学的補正素子であることを特徴とする。

【００２３】本発明の第１０の視点は、第１の視点の多
光子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正手段
は、前記光学部材の光路長に応じて、異なる圧力を印加
することにより、前記光路の光路長が一定となるように
調整可能な光学的補正素子であることを特徴とする。

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て図面を参照して説明する。なお、以下の説明におい
て、略同一の機能及び構成を有する構成要素について
は、同一符号を付し、重複説明は必要な場合にのみ行
う。

【００２５】図１は本発明の実施の形態に係る多光子励
起走査型レーザ顕微鏡１を示す構成図である。

【００２６】顕微鏡１は、標本Ｓに対して照射するパル
スレーザビームを出射するためのレーザ光源４と、レー
ザ光源４と標本Ｓとの間でレーザビームを案内するため
の光路を形成する光学系３とを有する。光学系３は、標
本Ｓを配置するためのステージ１５を有する顕微鏡本体
２内の光学素子も含む多数の光学素子により構成され
る。

【００２７】顕微鏡１は、床からの振動を排除するため
の除振台２６上に配設される。除振台２６上には、２つ
の架台２７、２８が配設される。架台２７上には、レー
ザ光源４、ビームコリメータ５及びプレチャープコンペ
ンセータ６が配設される。架台２８上には、走査光学ユ
ニット７及び補正機構２２が配設される。走査光学ユニ
ット７及び後述するフォトマルチプライヤ２１は、操作
パネル３１を有するコンピュータ３０に接続される。

【００２８】レーザ光源４は、近赤外域の波長で、サブ
ピコ秒の極短パルスＱＰを発振する。波長幅の広さは、
パルス幅の大きさに反比例するため、ここで使用される
極短パルスＱＰは、数ナノメータ程度の波長幅を有す
る。

【００２９】レーザ光源４からのレーザビームＱの光路
上にビームコリメータ５及びプレチャープコンペンセー
タ６が配置される。ビームコリメータ５は、レーザ光源
４から出射されたレーザビームＱを平行光束にコリメー
トする。プレチャープコンペンセータ６は、レーザビー
ムＱが光学系３を通過する際に、パルスの波長幅に起因
して生じるパルス幅の広がりを打ち消すように予め調整
するために使用される。具体的には、プレチャープコン
ペンセータ６は、例えばプリズム等の光学素子６ａ〜６
ｄから構成され、入射されたコリメート済みのレーザビ
ームＱに対して、短波長ほど先となるように波長順にプ
レチャープコンペンセータ６から出射させる作用を有す
る。

【００３０】走査光学ユニット７は、プレチャープコン
ペンセータ６から出射されたレーザビームＱにより標本
Ｓの断面（焦点面）Ｓ’を走査するためのものである。
この走査光学ユニット７の出射側には、リレーレンズ
８、光路折り曲げユニット９を介して顕微鏡本体２が配
設される。なお、これらリレーレンズ８、光路折り曲げ
ユニット９及び顕微鏡本体２は、光軸が一致するように
配置される。

【００３１】顕微鏡本体２は除振台２６上に固定された
コ字形状の筐体１１を有する。コ字形状の筐体１１の上
部には結像レンズ１２が配設され、且つ結像レンズ１２
の下方側に倍率の異なる複数の対物レンズ、例えば３つ
の対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃを取り付けたレボ
ルバ１３が回転自在に配設される。対物レンズ１４ａ、
１４ｂ、１４ｃは、択一的に光軸上に配置可能となるよ
うに構成される。レボルバ１３の下方には、標本Ｓを載
置するためのステージ１５が配設される。ステージ１５
は、筐体１１に対して上下に位置調整可能に取付けられ
る。

【００３２】標本Ｓは極短パルスＱＰのレーザビームＱ
が照射されると、多光子励起現象により蛍光を発する。
走査光学ユニット７には、標本Ｓで生じた蛍光とプレチ
ャープコンペンセータ６から出射されたレーザビームＱ
とを分離するためのダイクロイックミラー１６が配設さ
れる。

【００３３】ダイクロイックミラー１６を透過するレー
ザビームＱの光路上には、互いに直交した方向にレーザ
ビームＱを走査駆動するための一対のガルバノミラー１
７、１８と、走査駆動されたレーザビームＱを顕微鏡本
体へ導くためのリレーレンズ８とが配置される。

【００３４】一方、ダイクロイックミラー１６によって
分離される蛍光検出のための光路上には、集光レンズ１
９、ピンホール２０、及びフォトマルチプライヤ２１が
配置される。集光レンズ１９は標本Ｓからの蛍光をピン
ホール２０に集光させるために使用される。ピンホール
２０は標本Ｓと共役な位置に配置され、標本からの光に
含まれる焦点面以外の雑光を除去する。なお、多光子励
起走査型レーザ顕微鏡においては、対物レンズ１４ａ、
１４ｂ、１４ｃの焦点面、つまり標本Ｓの断面Ｓ’での
み多光子励起現象が生じるので、ピンホール２０は走査
光学ユニット７に必ずしも必要でない。

【００３５】対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃは夫々
異なる光路長を有する。このため、プレチャープコンペ
ンセータ６を、対物レンズの１つに合わせて断面Ｓ’
（光学系３の焦点面）における極短パルスＱＰのパルス
幅が最小となるように調整しても、対物レンズを切替え
た場合は断面Ｓ’におけるパルス幅が広がる可能性があ
る。この問題に対応するために、対物レンズ１４ａ、１
４ｂ、１４ｃのいずれを選択した場合にも、断面Ｓ’に
おけるパルス幅が一定で且つ最小となるように光学系３
の光路長を補正するように補正機構２２が配設される。
なお、前述の如く、本明細書において、単に光路長とい
う場合は、光学素子の幾何学的長さではなく、光学素子
が形成する光路の光学的長さを意味するものとする。

【００３６】具体的には、本実施の形態において、補正
機構２２は走査光学ユニット７と共通の筐体内に配設さ
れる。補正機構２２は、平行光束にコリメートされたレ
ーザビームＱの光路上に択一的に配置可能な補正板２３
ａ、２３ｂ、２３ｃを具備する。補正板２３ａ、２３
ｂ、２３ｃは、夫々対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃ
に対応して光路長が設定された同一のガラス材からな
る。対応する対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃと補正
板２３ａ、２３ｂ、２３ｃとのペアのいずれが使用され
た場合にも、レーザ光源４から断面Ｓ’（光学系３の焦
点面）の光路長が同一となるように設定される。

【００３７】図２に示す如く、補正板２３ａ、２３ｂ、
２３ｃは回転可能なターレット２４に取付けられる。タ
ーレット２４を回転させることにより、補正板２３ａ、
２３ｂ、２３ｃが光学系３の光軸上に択一的に配置可能
となる。

【００３８】次に、図１に示す多光子励起走査型レーザ
顕微鏡の作用について説明する。

【００３９】レーザ光源４から極短パルスＱＰのレーザ
ビームＱが出射されると、このパルスレーザビームＱ
は、先ずビームコリメータ５により平行光束に変換され
る。次に、レーザビームＱは、プレチャープコンペンセ
ータ６に入射して、断面Ｓ’でレーザビームＱのパルス
幅が最小になるように調整されて走査光学ユニット７に
導入される。

【００４０】次に、走査光学ユニット７に導入されたレ
ーザビームＱは、各対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃ
に対応するいずれか１つの補正板２３ａ、２３、２３
ｃ、例えば、対物レンズ１４ａに対応した補正板２３ａ
を通過し、この対物レンズ１４ａに対応して断面Ｓ’に
おけるレーザビームＱのパルス幅が一定となるように整
形される。

【００４１】次に、レーザビームＱは、走査光学ユニッ
ト７のダイクロイックミラー１６に入射する。ダイクロ
イックミラー１６を透過したレーザビームＱは、一対の
ガルバノミラー１７、１８で反射され、続いて、リレー
レンズ８、光路折り曲げユニット９を通って顕微鏡本体
２の光学系に入射する。

【００４２】顕微鏡本体２に入射したレーザビームＱ
は、結像レンズ１２によって、対物レンズ１４ａ、１４
ｂ、１４ｃの１つ、例えば対物レンズ１４ａの瞳径を満
足するような光束径に変換されて対物レンズ１４ａに導
入される。次に、このように対物レンズ１４ａに導入さ
れたレーザビームＱは、その対物レンズ１４ａにより、
ステージ１５上に載置された断面Ｓ’に集光される。

【００４３】標本Ｓは、パルスレーザビームＱの照射に
より、断面Ｓ’において２光子励起現象により部分的に
励起される。これにより、標本Ｓの断面Ｓ’からは、染
色した蛍光色素に応じた蛍光が発せられる。この蛍光
は、再び対物レンズ１４ａに取り込まれ、結像レンズ１
２、光路折り曲げユニット９、リレーレンズ８、一対の
ガルバノミラー１８、１７を通してダイクロイックミラ
ー１６に入射し、パルスレーザビームＱと分離される。

【００４４】蛍光は、ダイクロイックミラー１６によっ
て反射され、集光レンズ１９によってピンホール２０に
集光される。そして、ピンホール２０を通過した蛍光の
みがフォトマルチプライヤ２１に入射する。このフォト
マルチプライヤ２１は、蛍光を受光してその光量に応じ
た電気信号をコンピュータ３０に対して出力する。

【００４５】上述の操作と共に、走査光学ユニット７の
一対のガルバノミラー１７、１８がＸＹ方向に駆動さ
れ、レーザビームＱで断面Ｓ’がＸＹ方向に走査され
る。コンピュータ３０は、この走査により得られるフォ
トマルチプライヤ２１の出力信号をガルバノミラー１
７、１８の走査駆動に同期させることで、標本Ｓの断面
Ｓ’の２次元画像を構築することができる。

【００４６】このようにして、標本Ｓの２次元画像を得
る際、その用途に応じてレボルバ１３を回転させ、対物
レンズ１４ａを、対物レンズ１４ｃ（または対物レンズ
１４ｂ）に切替える場合がある。この場合、対物レンズ
の切替と略同時に補正機構２２のターレット２４を回転
させることで、対物レンズ１４ｃに対応する補正板２３
ｃを平行光束にコリメートされたパルスレーザビームＱ
の光路上に配置する。

【００４７】上述の如く、補正板２３ａ、２３ｂ、２３
ｃは、対応する対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃと組
合わされた場合、断面Ｓ’におけるパルス幅が一定とな
るように設定される。従って、例えば、対物レンズ１４
ａと補正板２３ａとを用いて初期段階（装置セットアッ
プ時）に断面Ｓ’でのレーザビームＱのパルス幅を最小
に調整すれば、その後、他の対物レンズと補正板とのペ
アを使用した場合にも、プレチャープコンペンセータ６
の調整は不要となる。即ち、対応する対物レンズ１４
ａ、１４ｂ、１４ｃと補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃと
のペアのいずれが使用された場合にも、常に断面Ｓ’に
おけるパルス幅を一定で且つ最小とすることができる。

【００４８】従って、図１に示す多光子励起走査型レー
ザ顕微鏡によれば、いずれの対物レンズ１４ａ、１４
ｂ、１４ｃを切替えて使用した場合にも、最適な条件で
多光子励起現象を引き起こすことができる。また、瞬時
に最適な状態で観察が開始できるため、蛍光の褪色を最
小限に抑えることができ、作業効率が向上する。また、
各補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、平行光束にコリメ
ートされたレーザビームＱの光路上に挿入されるので、
各補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃが各対物レンズ１４
ａ、１４ｂ、１４ｃの性能を劣化させることなく、シス
テム全体の光学性能を容易に維持できる。

【００４９】なお、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、
手動による切替の他に、対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１
４ｃの切替に電気的または機械的に連動して切替えるよ
うにすることもできる。この場合、装置の操作が簡単と
なり、作業効率が向上すると共に、各補正板２３ａ、２
３ｂ、２３ｃの誤挿入が発生しなくなる。例えば、これ
らの切替の電気的に完全に連動させる機構としては、図
１に破線で示すようなものを採用することができる。

【００５０】即ち、この連動機構においては、レボルバ
１３及びターレット２４が夫々ステップモータ３２、３
３で駆動される。また、ステップモータ３２、３３の回
転軸に夫々エンコーダ３４、３５が連結される。これら
の部材３２〜３５はコンピュータ３０に接続される。ま
た、コンピュータ３０に、いずれの対物レンズ１４ａ、
１４ｂ、１４ｃを使用するかを選択入力するための操作
パネル３１が配設される。これにより、操作パネル３１
からの入力に基づいて、対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１
４ｃと補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃとを連動して自動
的に切替えることができる。

【００５１】また、上述した切替機構の他、例えば、レ
ボルバに取付けられる対物レンズの位置及び倍率を予め
設定しておき、手動によるレボルバの回転時に、切替え
られた対物レンズに対応した補正板を判別し、補正板を
切替えるようにしてもよい。

【００５２】補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、レーザ
ビームＱが平行光束で且つ光束の角度変化がない位置、
例えばレーザ光源４からダイクロイックミラー１６まで
の間の位置で光路上に配置することが望ましい。このた
め、プレチャープコンペンセータ６と走査光学ユニット
７との間の位置（図１に示す位置）の他、例えばビーム
コリメータ５とプレチャープコンペンセータ６との間に
設置することができる。

【００５３】また、図３に示す如く、各補正板２３ａ、
２３ｂ、２３ｃは、各対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４
ｃの光学系が無限遠系であれば、レボルバ１３または対
物レンズに内蔵することも可能であり、機械的に連動す
る機構の代用とすることもできる。この構成によれば、
装置構成がシンプルとなると共に安価となり、且つ誤動
作の心配もなくなる。

【００５４】また、上記実施の形態では、補正板に同一
のガラス材を用い、板厚を変えることで光路長を変化さ
せていたが、本発明はこれに限定されるものではない。
例えば、同じ板厚に形成した補正板のガラス材を変える
ことで屈折率を変化させ、光路長を設定することができ
る。この場合、各補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、幾
何学的寸法が全く同じになるので、補正機構２２に取り
付けるための部品を共通化できる。

【００５５】図４乃至図６は補正機構２２の変更例に係
る補正機構４１、４６、５１を示す概略図である。

【００５６】図４に示す補正機構４１は、補正板２３
ａ、２３ｂ、２３ｃを夫々矩形のブロック４２に取付け
た例である。矩形のブロック４２は矩形の回転子４３に
着脱自在に固定される。この場合、回転子４３の回転に
より、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃが光学系３の光軸
上に択一的に配置可能となる。

【００５７】図５に示す補正機構４６は、補正板２３
ａ、２３ｂ、２３ｃをスライド可能なスライダ４７に取
付けた例である。この場合、スライダ４７の直線動作に
より、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃが光学系３の光軸
上に択一的に配置可能となる。

【００５８】図６に示す補正機構５１においては、駆動
部５３による電気的或いは物理的な外部作用により、異
なる光路長を光路上に択一的に提供可能な単一の光学的
補正素子５２が使用される。光学的補正素子５２として
は、電圧の印加により光路長が変化する平行平面板（Ｅ
ＯＤ素子）や、圧力の印加により光弾性を利用して光路
長が変化する平行平面板を使用することができる。

【００５９】図７は図１に示す顕微鏡１にノマルスキー
式の透過光観察機能を追加した場合の変更例を示す概略
図である。

【００６０】この変更例においては、偏光子６１及びノ
マルスキープリズム等に代表される複屈折素子６２がス
ライダ（図示せず）に取付けられ、走査光学ユニット７
の内部で且つダイクロイックミラー１６よりプレチャー
プコンペンセータ６側の光路上に一体的に挿脱自在とな
る。この場合、フォトマルチプライヤ２１による蛍光の
検出のみを行う際、偏光子６１及び複屈折素子６２を光
路上から外すと光路長が変わってしまう。この問題に対
応するため、偏光子６１及び複屈折素子６２の光路長に
対応した補正板２３ｄが、ターレット２４とは別体で且
つ補正機構２２の一部をなすスライダ２４ａに取付けら
れる。補正板２３ｄは、偏光子６１及び複屈折素子６２
が光路上から外れるのに連動して光路上に挿入される。

【００６１】また、顕微鏡本体２の筐体１１の下部に
は、ステージ１５の開口１５ａの下方に位置するよう
に、複屈折素子（ノマルスキープリズム）６５及び偏光
子６６が取付けられる。更に、顕微鏡本体２の筐体１１
には、偏光子６６を通過した透過光を反射し且つ検出す
るためのミラー６７及び検出器６８が取付けられる。

【００６２】偏光子６１、複屈折素子６２、６５及び偏
光子６６は、部分的に屈折率が僅かに異なる無色透明の
物体や、微少な段差を有する不透明物体の表面など、目
では検出できない位相情報を、偏光干渉により、干渉色
のコントラストを付けて可視化する。従って、前述のフ
ォトマルチプライヤ２１で検出される蛍光から得られる
情報に加えて、検出器６８で検出される透過光から得ら
れる情報から、標本Ｓの構造を立体的に捉えることがで
きる。

【００６３】なお、フォトマルチプライヤ２１による蛍
光の検出のみが必要な場合は、上部側の偏光子６１及び
複屈折素子６２を光路上から外せばよい。また、これに
連動して偏光子６１及び複屈折素子６２の光路長に対応
した補正板２３ｄを光路上に挿入する。これにより、ノ
マルスキー式の透過光観察機能と、フォトマルチプライ
ヤ２１による蛍光検出とを切替えて使用する顕微鏡であ
っても、常に断面Ｓ’におけるパルス幅が一定で且つ最
小とすることができる。なお、図示の構成に代え、偏光
子６１及び複屈折素子６２の光路長を考慮した補正板
（図示せず）を、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃに加え
てターレット２４上に配設するようにしてもよい。

【００６４】また、図７図示の顕微鏡においては、ノマ
ルスキー式の透過光観察をおこなうための平坦な偏光子
６１及び複屈折素子６２に対応する補正板２３ｄに関し
て述べているが、本発明はこれに限られるものではな
く、他の平坦な光学素子に関しても、これに対応した補
正板を配設する場合に適用することができる。

【００６５】また、上述の実施の形態及び変更例におい
ては、標本ＳをパルスレーザビームＱで走査するための
走査機構として、レーザビームＱを走らせるための一対
のガルバノミラー１７、１８等を有する走査光学ユニッ
ト７を使用している。しかし、標本Ｓの走査は、標本Ｓ
とレーザビームＱとを相対的に移動させることにより達
成できるものであるから、この走査には種々の機構を採
用することができる。例えば、レーザビームＱを静止さ
せ、顕微鏡本体２のステージ１５を走査のために駆動す
るような走査機構を使用してもよい。

【００６６】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、パ
ルスレーザビームを使用すると共に複数の対物レンズを
有する多光子励起レーザ顕微鏡において、光路上に選択
的に配置可能な光学部材の光路長に応じて、容易に最適
な条件で観察が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施の形態に係る多光子励起走査型レ
ーザ顕微鏡を示す構成図。

【図２】図１に示す顕微鏡で使用される光路長の補正機
構を示す概略平面図。

【図３】光路長の補正機構の変更例を示す概略側面図。

【図４】光路長の補正機構の別の変更例を示す概略平面
図。

【図５】光路長の補正機構の更に別の変更例を示す概略
平面図。

【図６】光路長の補正機構の更に別の変更例を示す概略
側面図。

【図７】図１に示す顕微鏡にノマルスキー式の透過光観
察機能を追加した場合の変更例を示す概略図。

【符号の説明】

１：顕微鏡、２：顕微鏡本体３：光学系４：レーザ光源５：ビームコリメータ６：プレチャープコンペンセータ７：走査光学ユニット１２：結像レンズ１３：レボルバ１４ａ、１４ｂ、１４ｃ：対物レンズ１５：ステージ１６：ダイクロイックミラー１７、１８：ガルバノミラー１９：集光レンズ２０：ピンホール２１：フォトマルチプライヤ２２、４１、４６、５１：補正機構２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ：補正板２４：ターレット３０：コンピュータ３１：操作パネル３２、３３：ステップモータ３４、３５：エンコーダ５２：光学的補正素子６１：偏光子６２、６５：複屈折素子６６：偏光子６７：ミラー６８：検出器Ｓ：標本

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】観察対象の標本を配置するための配置部
と、多光子励起現象により蛍光を発するように前記標本を励
起するためのパルスレーザビームを出射するためのレー
ザ光源と、前記標本の蛍光を検出するための検出器と、前記レーザ光源から前記標本へ前記パルスレーザビーム
を導くために前記パルスレーザビームの光路を形成する
光学系と、を具備し、前記光学系は、前記パルスレーザビームが前記光学系を通過する際に、
前記パルスの波長幅に起因して生じる前記パルスレーザ
ビームのパルス幅の広がりを抑制するため、前記光路上
に配設されたプレチャープコンペンセータと、前記光路上に選択的に配置可能な光学部材と、前記光学部材の光路長に対応し、前記光学系の焦点面に
おける前記パルスレーザビームのパルス幅が一定となる
ように前記光路の光路長を補正するための光学的補正手
段を具備する補正機構と、を有することを特徴とする多
光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項２】前記光学系は、前記標本を前記パルスレー
ザビームで走査するための走査機構を更に有することを
特徴とする請求項１に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項３】前記光学部材は、前記標本に対して前記パ
ルスレーザビームを集光するように、前記光路上に択一
的に配置可能な複数の対物レンズであることを特徴とす
る請求項１に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項４】前記光学部材は、前記標本に対して前記パ
ルスレーザビームを集光するように、前記光路上に択一
的に配置可能な複数の対物レンズと、前記プレチャープ
コンペンセータと前記対物レンズとの間に挿脱自在に設
けられた平坦な光学素子とであることを特徴とする請求
項１に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項５】前記平坦な光学素子は、ノマルスキー式の
透過光観察用の光学素子であることと、前記顕微鏡は、
前記パルスレーザビームの前記標本を透過した透過光を
検出するための光学系及び検出器を更に具備することと
を特徴とする請求項４に記載の多光子励起レーザ顕微
鏡。
【請求項６】前記光学的補正手段は、前記光学部材の切
替えに連動して切替えられることを特徴とする請求項１
に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項７】前記光学的補正手段は、前記光路上の前記
パルスレーザビームが平行光束で且つ前記光束の角度変
化がない位置に配置されることを特徴とする請求項１に
記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項８】前記光学的補正手段は、前記光学部材の光
路長に応じて、前記光路の光路長が一定となるように前
記光路上に択一的に配置可能な複数の光学的補正素子で
あることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起レー
ザ顕微鏡。
【請求項９】前記光学的補正手段は、前記光学部材の光
路長に応じて、異なる電圧を印加することにより、前記
光路の光路長が一定となるように調整可能な光学的補正
素子であることを特徴とする請求項１に記載の多光子励
起レーザ顕微鏡。
【請求項１０】前記光学的補正手段は、前記光学部材の
光路長に応じて、異なる圧力を印加することにより、前
記光路の光路長が一定となるように調整可能な光学的補
正素子であることを特徴とする請求項１に記載の多光子
励起レーザ顕微鏡。