JP5162781B2 - 顕微鏡組立物 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に共焦点走査型顕微鏡法の顕微鏡組立物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
上述したような種類の顕微鏡組立物が、実際的な用途から知られており、さまざまな実施形態がある。このような顕微鏡組立物の一実施例は、検査対象の試料が光ビームを用いて走査される共焦点走査型顕微鏡によって構成される。
【０００３】
照射光は一般に、ビームスプリッタを介して結合される。光ビームの焦点は、１つの試料面に走査装置を用いて移動される。これは一般に、傾斜された２枚のミラーを用いて実行され、ミラーの偏光軸は一般に、互いに垂直に位置するため、一方のミラーはＸ軸方向に偏光し、他方のミラーはＹ軸方向に偏光する。ミラーの傾斜は、たとえば検流計位置決め素子の助けによって実現される。
【０００４】
一般的であるこのような「デスキャン（ｄｅｓｃａｎ）」配置構成において、試料から来る蛍光または反射光は、ビームスプリッタで同一の走査ミラーによって戻され、それを通過してから、背後に検出器が位置する検出絞りの上に焦点を結ぶ。焦点領域から直接出ていない検出光は、異なる光経路を取り、検出絞りを通過しないため、試料の走査によって点基準が得られ、３次元画像を生じる。本願明細書では、対物レンズ側、すなわち、顕微鏡光学系によって照射および検出が行われる。
【０００５】
透過光配置構成において、たとえば、集光器側、すなわち試料の後に配置される集光器側で蛍光または透過光（透過励起光）を検出することもできる。その場合には、検出される光ビームは、走査ミラーを介して検出器へ通らない。この種の配置構成は、「非デスキャン（ｎｏｎ−ｄｅｓｃａｎ）」配置構成と呼ばれる。
【０００６】
透過光配置構成において、すでに述べたデスキャン配置構成の場合のように、集光器側の検出絞りは、３次元解像度を実現するために蛍光の検出用として必要であると思われる。
【０００７】
しかし、２光子励起の場合には、励起確率は光子密度または強度の平方に依存するため、集光器側の検出絞りが不要である場合もある。但し、集光器側の検出絞りが隣接領域より焦点においてはるかに大きい場合である。その結果、きわめて強い検出対象の蛍光が焦点領域から高い確率で得られ、焦点領域からの蛍光光子と隣接領域からの蛍光光子との間に、絞り配置構成を用いると、さらなる微分が不要となる。
【０００８】
２光子励起に関して、蛍光光子の発生が少ないことが特に仮定されている場合には、検出光経路に沿って一般に光をあまり失わない非デスキャン配置構成が重要である。
【０００９】
しかし、このように蛍光が観測される場合であっても、生体プレパラートにおいてラベル付けしないことから、たとえば、細胞の輪郭をあまり十分に検出することはできない。したがって、抽出対象の明確な結果を得ることができると思われる透過光を同時に観測することが望ましい。
【００１０】
一方で対物レンズ側の蛍光検出、他方で集光器側の透過光検出を行うことができる顕微鏡組立物は存在する。
【００１１】
しかし、これに関連して、対物レンズ側の蛍光検出から集光器側の透過光検出への切換えおよび集光器側の透過光検出から対物レンズ側の蛍光検出への切換えには、ミラーおよびフィルタを機械的に交換しなければならない機械的な切換え動作を必要とする。これは試料を破壊するような衝撃を試料に与える恐れがある。特に、微量ピペット配置構成を用いる実験はほぼ除外される。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、最初に述べたような類の顕微鏡組立物において、多種多様な実験、特に微量ピペット配置構成を用いる実験をそれぞれの場合において高い検出レベルかつ高信頼性で行うことができる顕微鏡組立物を提供することを目的とする。
上述の目的は、請求項１の特徴を有する顕微鏡組立物によって実現される。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明によって認識されることは、蛍光および透過光検出器の巧みな配置構成によって、上述の目的を驚くほど簡素な方法で実現されることである。このために、蛍光および透過光検出器は、蛍光および透過光を同時検出することができるように配置される。透過光検出と蛍光検出との切換えはもはや必要ではないため、標本または試料に対する機械的な衝撃は防止される。したがって、高レベルの検出は、きわめて敏感な試料の場合であっても、透過光検出および蛍光検出の両方の観点から実現される。
【００１４】
したがって、本発明による顕微鏡組立物は、多種多様な実験、特に微量ピペット配置構成を用いる実験をそれぞれの場合において高い検出レベルかつ高信頼性で行うことができるような顕微鏡組立物を提供する。
【００１５】
具体的な実施形態において、少なくとも１つの蛍光検出器は、光源と反対方向に面する試料の面側に配置されてもよい。あるいは、またはこれに加えて、少なくとも１つの透過光検出器が、光源と反対方向に面する試料の面に配置されてもよい。
【００１６】
さらに、透過光および蛍光のための集光器が、光源と反対方向に面する試料の面に配置されてもよい。特に効果的な集光のために、集光器のアパーチャは、光源と試料との間に配置される対物レンズのアパーチャより大きくてもよい。この種の集光器が存在する場合には、検出器の対応する配置構成に関して、蛍光および透過光の「集光器側の」検出ということができる。
【００１７】
蛍光および透過光の個別の検出に関して、透過光および蛍光は、光源と反対方向に面する試料の面に分散することができてもよく、集光器を通過した後であれば好ましい。これによって、透過光から蛍光を物理的に分離することになる。このようにすることで、異なる検出器の対応する光出力を個別に測定することができる。
【００１８】
具体的には、少なくとも１つのカラービームスプリッタを分割のために使用してもよい。これに関連して、異なる波長または波長領域を分離することができるようにするために、１つのスプリッタの背後に別のスプリッタに来るようにして複数のカラービームスプリッタを配置してもよい。
【００１９】
この別法として、少なくとも１つの半透明ミラーを分割のために使用してもよい。このようなミラーは、ミラーの背後に配置される帯域フィルタまたは遮断フィルタを備えていてもよい。ミラーが分離構成要素として使用される場合であっても、このような複数のミラーは１つのミラーの背後に別のミラーが来るように配置してもよく、任意にミラーの後に帯域フィルタまたは遮断フィルタを備えていてもよい。また、これによって、蛍光を複数のスペクトル領域に分割することができる。
【００２０】
カラービームスプリッタまたはミラーの使用の別法として、たとえば、ドイツ国特許第ＤＥ １９９ ０２ ６２５ Ａ１号に記載されるマルチバンド検出器を分割のために使用してもよい。この種のマルチバンド検出器はまた、蛍光を複数のスペクトル領域に分割することができる。
【００２１】
顕微鏡の特に小型の実施形態において、蛍光および透過光は同一の検出器で検出することができてもよい。しかし、最も明確で可能な微分のために、蛍光および透過光は異なる検出器で検出することができてもよい。
【００２２】
本発明による顕微鏡組立物は、特に干渉コントラスト顕微鏡法のために使用される。この目的のために、第１の偏光素子が光源と試料との間に配置されてもよく、第２の偏光素子が試料の後に配置されてもよい。第１の偏光素子は、対物レンズの前、第２の偏光素子は集光器の後であれば好ましい。偏光素子は、プリズムによって特に簡素な方法で構成されてもよい。これに関連して、ウォラストンプリズムが特に適している。
【００２３】
直線偏光面のいかなる回転が生じたかを決定するために、偏光フィルタを透過光検出器の前に配置してもよい。偏光フィルタは、偏光素子の影響を受けることなく、照射光ビームを遮断するように向けられなければならない。
【００２４】
本発明による顕微鏡組立物はまた、透過光型コントラスト顕微鏡法に使用されてもよい。そのような目的のために、セクタ光学系、セクタ偏向光学系、セクタ絞り、セクタ位相絞りまたはセクタ位相フィルタをビーム経路に配置してもよい。セクタ光学系、セクタ偏向光学系、セクタ絞り、セクタ位相絞りまたはセクタ位相フィルタをビーム経路のフーリエ平面に配置してもよい。そのような目的のために、セクタ光学系、セクタ偏向光学系、セクタ絞り、セクタ位相絞りまたはセクタ位相フィルタを透過光検出器の直前にあるフーリエ平面に配置してもよい。
【００２５】
これによって、たとえばＤｏｄｔ法またはホフマン法を実現することができると思われる。これに関連して、１光子励起では共焦点によって実現することはできないが、蛍光もまた同時に観測することができる。
【００２６】
顕微鏡組立物のさらに詳細な実施形態に関して、追加光源が（集光器がある場合には集光器側の）光源と反対方向に面する試料の面に配置されてもよい。結果として、試料は、任意に集光器側に照射されてもよく、次に、検出器が（対物レンズ側の）光源に面する試料の面に配置されてもよい。追加光源は、簡素な方式では白色光源であってもよい。
【００２７】
位相コントラストに関して、セクタ光学系、セクタ偏向光学系、セクタ絞り、セクタ位相絞りまたはセクタ位相フィルタは、追加光源に関連していてもよい。特に好ましい方式では、セクタ光学系、セクタ偏向光学系、セクタ絞り、セクタ位相絞りまたはセクタ位相フィルタは、追加光源前のフーリエ平面に配置されてもよい。
【００２８】
走査装置は、光源に面する試料の面に配置されてもよい。追加光源によって発生される光はまた、透過光検出器またはスキャナ検出器に当たる前に、走査装置によって偏光されてもよい。この目的のために、少なくとも１つの透過光検出器は、光源と反対方向に面する試料の面に配置されてもよく、試料と反対方向に面する走査装置の面にあれば好ましい。
【００２９】
特に好都合な方式において、レーザが光源として使用されてもよい。しかし、他の適切な光源もまた考えることができる。
【００３０】
本発明による顕微鏡組立物は、多光子励起によって発生された蛍光および／または１光子励起または第２高調波発生（ＳＨＧ）によって発生された蛍光および透過光の１つ以上の波長領域の同時検出に特に適している。
【００３１】
特定の用途において、本発明による顕微鏡組立物はまた、試料に衝撃を与えることが避けられない機械的な切換え動作（たとえばビームスプリッタまたはフィルタの置換または交換）を必要とすることなく、異なる波長領域の蛍光および透過光を連続的に、すなわち同時にではなく検出するために使用されてもよい。したがって、顕微鏡組立物はまた、たとえばマイクロマニピュレータ、微量ピペットなどの外部からの影響を受ける試料を用いた用途において、異なる蛍光スペクトル領域および／または透過光の連続検出に特に適している。
【００３２】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明による顕微鏡組立物の第１の典型的な実施形態の概略図を示している。
【００３３】
顕微鏡組立物は、共焦点レーザ走査型顕微鏡である。顕微鏡は、レーザとして構成される光源１を有する。光源１は、メインビームスプリッタ３を経て走査装置４に反射される照射光ビーム２を放射する。走査装置４は、顕微鏡光学系または対物レンズ５によって、試料６を通るように照射光ビーム２を誘導する。試料６を通過する透過光も試料６で発生される蛍光も、集光器７および偏光ミラー８を経て第１のカラービームスプリッタ９に供給される。
【００３４】
第１のカラービームスプリッタ９は、蛍光のスペクトルの低い方の波長領域１０を分割し、それを蛍光検出器１１へ反射する。蛍光のスペクトルの高い方の波長領域１３は、カラービームスプリッタ１２を経て別の蛍光検出器１４に反射される。透過光１５は、直進前方に配置される透過光検出器１６に到達する。
【００３５】
したがって、顕微鏡組立物は、検査対象である試料６を照射するための光源１、試料６において発生した蛍光１０，１３を検出するための２つの蛍光検出器１１，１４および試料６を通過する透過光１５を検出するための透過光検出器１６を有する。
【００３６】
蛍光検出器１１，１４および透過光検出器１６は、蛍光１０，１３および透過光１５を同時に検出することができるように配置される。試料６は、光源１に面する上面６ａおよび光源１と反対方向に面する底面６ｂを規定する。
【００３７】
図１に示された顕微鏡組立物はさらに、対物レンズ側に配置された検出器１７を備える。
【００３８】
両方の蛍光検出器１１，１４は、光源１と反対方向に面する試料６の面に配置される。透過光検出器１６も光源１と反対方向に面する試料６の面に配置される。
【００３９】
図２は、本発明による顕微鏡組立物の第２の典型的な実施形態の概略図を示している。
【００４０】
図２に示された顕微鏡組立物は、図１の顕微鏡組立物に実質的に対応し、図１ですでに記載した構成要素に対応する構成要素は、同一の参照符号を用いてラベル付けされる。
【００４１】
図２に示される顕微鏡組立物は、特に同時蛍光検出を備えた微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法に適している。そのような目的のために、顕微鏡組立物は、偏光プリズム１８として構成される２つの偏光素子を有する。偏光プリズム１８は、いわゆるウォラストンプリズムによって構成される。一方の偏光プリズムは、光源１と試料６との間、さらに正確には対物レンズ５の前に配置される。第２の偏光プリズム１８は、試料６の後、さらに正確には集光器７の後に配置される。
【００４２】
微分干渉コントラストによって、同時蛍光検出に関して、位相対象物を観測することができる。（レーザとして構成される）光源１の直線偏光された励起光は、第１の偏光プリズム１８の助けによって対物レンズ５の前に２つの部分ビームに分割される。次に、２つの部分ビームは、わずかに異なる経路に沿って試料６を通過し、第２の偏光プリズム１８の助けによって集光器７の後に再結合される。
【００４３】
これは、２つの部分ビームが異なる長さの光路に沿って進む場合には、透過光検出器１６の前の偏光フィルタ１９によって分析される直線偏光面の回転では、ビームが結合された後であることを示している。
【００４４】
偏光フィルタ１９は、偏光プリズム１８を介さずに直接通過する照射光ビームを遮断するように向けられなければならない。
【００４５】
図３は、本発明による顕微鏡組立物の第３の典型的な実施形態の概略図を示している。
【００４６】
ここに示される顕微鏡組立物は、図１の顕微鏡組立物に実質的に対応し、図１ですでに記載した構成要素に対応する構成要素は、同一の参照符号を用いてラベル付けされる。
【００４７】
図３に示される顕微鏡組立物は、特に位相コントラスト顕微鏡法のために使用されることができる。そのような目的のために、顕微鏡組立物は、透過光検出器１６の前のフーリエ平面に配置されるセクタ絞り２０を有する。蛍光１０，１３は同時に観測することができる。
【００４８】
Ｄｏｄｔ法は、セクタ絞り２０を用いて実現されることができる。セクタ絞り２０の別法として、たとえば、ホフマン法を使用することができるようなセクタ偏向光学系も使用することができ、蛍光１０，１３を同時に観測することができる。しかし、１光子励起を利用して、蛍光１０，１３を共焦点によって観測することはできない。
【００４９】
図４は、本発明による顕微鏡組立物の第４の典型的な実施形態の概略図を示している。
【００５０】
図４に示される顕微鏡組立物は、図１の顕微鏡組立物に実質的に対応し、図１ですでに記載した構成要素に対応する構成要素は、同一の参照符号を用いてラベル付けされる。
【００５１】
図４に示される顕微鏡組立物において、試料６はまた、追加光源２１によって集光器側で照射される。したがって、追加光源２１は、光源１と反対方向に面する試料６の面に配置される。したがって、追加の逆ビーム光路はここに存在する。
【００５２】
追加光源２１は、位相コントラストのために、追加光源２１の前のフーリエ平面においてそれに関連するセクタ絞り２０を有する。追加光源２１は試料６を通過する照射光ビーム２２を発生し、照射光ビーム２２は検出器１７によって検出される。検出の前に、照射光ビーム２２は、走査装置４によって走査動作を経験する。透過光検出器１７はまた、「スキャナ検出器」とも呼ばれる。このスキャナ検出器１７は、たとえば、Ｄｏｄｔ光またはホフマン光を検知することができる。
【００５３】
本発明による顕微鏡組立物は、特に２光子励起の場合に使用されてもよい。この場合には、焦点領域からの蛍光光子および隣接領域からの蛍光光子との間にある絞り配置構成を用いて、いずれの微分も不要であるためである。さらに、顕微鏡組立物は、偏光プリズムを用いた干渉コントラスト顕微鏡法およびセクタ絞りの助けによって透過光型コントラスト顕微鏡法にも適している。
【００５４】
顕微鏡組立物は、機械的な切換え動作を行うことなく、異なる蛍光のスペクトル領域および／または透過光の連続検出のために使用されることができる。したがって、顕微鏡組立物は、微量ピペット、マイクロマニュピレータなどの用途に特に適している。
【００５５】
本発明による顕微鏡組立物のさらに好都合な実施形態に関して、反復を避けるために、明細書の一般的な部分および添付の請求項を参照されたい。
【００５６】
最後に、本発明による顕微鏡組立物の上述した典型的な実施形態は、請求項の教示をしているに過ぎず、典型的な実施形態に限定されるわけではない。本発明にはさまざまな実施形態がある。図面を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による顕微鏡組立物の第１の典型的な実施形態を示す概略図。
【図２】２つの偏光プリズムを有する本発明による顕微鏡組立物の第２の典型的な実施形態を示す概略図。
【図３】セクタ絞りを有する本発明による顕微鏡組立物の第３の典型的な実施形態を示す概略図。
【図４】追加光源を有する本発明による顕微鏡組立物の第４の典型的な実施形態を示す概略図。
【符号の説明】
１ 光源
２ 照射光ビーム
３ メインビームスプリッタ
４ 走査装置
５ 対物レンズ
６ 試料
７ 集光器
８ ミラー
９ カラービームスプリッタ
１０ 波長領域
１１ 蛍光検出器
１２ カラービームスプリッタ
１３ 波長領域
１４ 蛍光検出器
１５ 透過光
１６ 透過光検出器
１７ 透過光検出器
１８ 偏光プリズム
１９ 偏光フィルタ
２０ セクタ絞り
２１ 追加光源
２２ 照射光ビーム

Claims (5)

1. 特に共焦点走査型顕微鏡法用の顕微鏡組立物であって、検査対象の試料（６）を照射するための光源（１）と、前記試料（６）の蛍光画像を観測するために該試料（６）において発生された蛍光（１０，１３）を検出する少なくとも１つの蛍光検出器（１１，１４）と、前記試料（６）の透過画像を観測するために該試料（６）を通過する透過光（１５）を検出する少なくとも１つの透過光検出器（１６）とを備え、
   前記試料（６）が、前記光源（１）に面する上面（６ａ）および前記光源（１）と反対方向に面する底面（６ｂ）を規定し、少なくとも１つの蛍光検出器（１１，１４）が前記光源（１）と反対方向に面する前記試料（６）側に配置され、少なくとも１つの透過光検出器（１６）が前記光源（１）と反対方向に面する前記試料（６）側に配置されており、
   前記蛍光検出器（１１，１４）および前記透過光検出器（１６）が、共に前記光源（１）と反対方向に面する前記試料（６）側で、前記蛍光（１０，１３）および前記透過光（１５）の同時検出を可能にするように配置され、該蛍光（１０，１３）および透過光（１５）の検出出力に基づき、前記蛍光画像と前記透過画像を同時に観測することを特徴とする顕微鏡組立物。
2. 集光器（７）を通過した後に、前記透過光（１５）および前記蛍光（１０，１３）が、前記光源（１）と反対方向に面する前記試料（６）側で分割され得る請求項１記載の顕微鏡組立物。
3. 追加光源（２１）が、前記光源（１）と反対方向に面する前記試料（６）側に配置される請求項１記載の顕微鏡組立物。
4. 前記追加光源（２１）が、白色光源であることを特徴とする請求項３記載の顕微鏡組立物。
5. 少なくとも１つの検出器（１７）が、前記光源（１）に向かって面する前記試料（６）の側であって、前記試料（６）の上面（６ａ）の側に設けられる走査装置（４）の側に配置されることを特徴とする請求項４記載の顕微鏡組立物。

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