JP3618481B2

JP3618481B2 - レーザ走査型顕微鏡

Info

Publication number: JP3618481B2
Application number: JP22478096A
Authority: JP
Inventors: 祐仁荒井
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1996-08-27
Filing date: 1996-08-27
Publication date: 2005-02-09
Anticipated expiration: 2016-08-27
Also published as: US5945669A; JPH1068657A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、点光源であるレーザビームで試料を２次元走査して得られた濃淡情報から試料画像を形成するレーザ走査型顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レーザ走査型顕微鏡は、点光源であるレーザビームを対物レンズを介して試料のＸ軸及びＹ軸方向に走査しながら照射し、試料からの透過光、反射光又は蛍光を再び対物レンズ、光学系を介して検出器で検出して二次元像の濃淡情報を得るようにしたものである。この濃度情報の２次元分布をＸ−Ｙ走査位置に対応させてＣＲＴディスプレイ等の表示装置に輝点の分布として表示することで画像化する。検出光学系の試料と共役な位置に照明光または被測定光の回折限界以下の径を持つ絞りを設けることにより、焦点の合っている面の情報のみを検出する共焦点光学系を備えた共焦点レーザ走査型顕微鏡もレーザ走査型顕微鏡に含まれる。レーザ走査型顕微鏡の検出系は典型的には次のように構成されている。すなわち、試料からの透過光、反射光及び又は蛍光を電気信号に光電変換する検出器に、フォトダイオードや光電子増倍管等を用いて適当な感度を当該検出器に設定する。検出器から光量の強弱に応じて出力される出力電圧（電流）信号を増幅回路に導いて増幅する。
【０００３】
増幅回路の出力信号には、背景光や電気的なオフセットなどの像の位置によらず常に一定の値となるオフセット成分と、試料の分布に応じて変化する信号成分とが含まれる。このうち、像の位置によらず一定の値となる信号成分は測定のダイナミックレンジを狭める要因になるため、オフセット減算回路により取り除いている。そして、試料の分布に応じて変化する信号成分を取り出した電圧信号をＡ／Ｄ変換回路でデジタルデータに変換し、メモリに保存する。
【０００４】
このようにして得られたデータは、画像の濃淡が検出器からの出力信号の強弱すなわち検出された光の強度を表し、その２次元分布が各点での光の強度を表している。
【０００５】
このようなレーザ走査型顕微鏡において、好適なコントラストの画像を得るためには、検出器の感度、増幅回路の増幅率、オフセット減算回路のオフセット量などの測定パラメータを適宜調整する必要がある。この調整が適当でない場合、例えばオフセット量の設定が不十分な場合はオフセット成分がＡ／Ｄ変換回路のダイナミックレンジの大半を占めてしまったり、逆に信号成分までを減算してしまうといった不具合を生じる。
【０００６】
また、光電変換器の感度又は増幅回路の増幅率を過大に設定すると、信号がＡ／Ｄ変換回路のダイナミックレンジを越えて飽和し、逆に過小に設定するとの振幅が不十分で測定対象が像として観察できない等の不具合を生じる。
【０００７】
従来のレーザ走査型顕微鏡では、得られた画像を目視しながら各測定パラメータの設定を順次調整していく方法がとられていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、すべてのパラメータを調整するのは多大な時間と、ある程度の熟練を要する。例えば、試料からの蛍光を測定するような場合には、測定パラメータの調整に時間が掛かっていると蛍光色素の褪色を招くなど測定対象にダメージを与えたり、測定のスループットを低下させるなどの問題がある。
【０００９】
なお、特開平５−３３６４０５号公報などにおいて、各パラメータの設定を自動的に最適化する手法が提案されている。しかしながら、同公開公報記載によれば、適当な光電変換器の感度、増幅器の増幅率、オフセット減算回路のオフセッ卜量であらかじめ測定対象となる試料を測定し、そのデータから最適なパラメータを算出する手法を採っているため、ある程度の時間の短縮と調整のばらつきは減少するものの、実際の測定までにはある程度時間がかかり、試料に不要なダメージを与えるなどの問題が依然として残されている。
【００１０】
また、特願平６−３０３５０６号には、測定パラメータをサンプリングクロックに同期して、つまり画像の画素毎にダイナミックに変化させて、コントラスト強調、補正などの効果を得られるようにした方法が提案されている。しかしながら、この方法においても、各パラメータの値や適応位置等はあらかじめ設定しておく必要があり、その設定値は一旦画像を測定しなければ最適値を与えることができなかった。
【００１１】
本発明は、以上のような実情に鑑みてなされたもので、測定画像の画質に影響を及ぼす各種測定パラメータの設定を行うことなく、好適なコントラストで、かつ広いダイナミックレンジの画像が得られるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために以下のような手段を講じた。
【００１３】
本発明のレーザ走査型顕微鏡は、試料からの信号光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記光電変換手段の信号光に対する感度又は電気信号に対する増幅率を設定する感度調整手段と、前記光電変換手段の出力信号が予め設定された基準値に近付くように前記感度調整手段を制御する感度制御手段とを備え、前記光電変換手段に設定された感度又は増幅率を前記濃淡情報に相当する測定値に変換して使用する。
【００１４】
本発明によれば、光電変換手段の出力信号が予め設定された基準値に近付くように前記感度調整手段を制御することにより、信号光の光強度が高ければ光電変換手段の感度又は増幅率が低くなるように制御され、信号光の光強度が小さければ感度又は増幅率が高くなるように制御される。
【００１５】
このように、光電変換手段の感度又は増幅率が信号光の光強度に対応した情報を持つので、光電変換手段に設定された感度又は増幅率を濃淡情報に相当する測定値として使用することにより、感度、増幅率、オフセット量などの測定パラメータを設定すること無く、好適なコントラストと広いダイナミックレンジの画像が得られることになる。
【００１６】
本発明のレーザ走査型顕微鏡は、前記光電変換手段からの出力信号と、前記光電変換手段の感度又は増幅率とから、前記濃淡情報に相当する測定値を求める。
【００１７】
本発明によれば、応答速度の速い出力信号と、この出力信号を測定した際の感度又は増幅率とから光量を算出することで、高速な被測定光の変動にも追従できる測定を実現することができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
（第１の実施の形態）
図１は第１の実施の形態に係る共焦点レーザ走査型顕微鏡の測光装置の構成図である。この測光装置を図２に示す共焦点レーザ走査型顕微鏡に適用した実施の形態について説明する。まず、共焦点レーザ走査型顕微鏡の構成から説明する。
この共焦点レーザ走査型顕微鏡は、レーザ発振器１を射出した照明光を、ビームエキスパンダ２およびビームスプリッタ又はダイクロイックミラーなどの光路分割素子３で偏向してガルバノメータスキャナなどを用いたＸ及びＹ方向スキャナ４，５に入射し、Ｘ及びＹ方向スキャナ４，５で２次元走査するように偏向する。Ｙ方向スキャナ５を射出した照明光は、瞳投影レンズ６、結像レンズ７を介して対物レンズ８に入射し、試料９を２次元走査する。
【００２２】
試料９からの透過光はコレクタレンズ１０、リレーレンズ１１を介して透過光検出用の測光回路１２にて検出される。また、試料９からの反射光及び又は蛍光は照明光と同じ光路をたどって光路分割素子３に到達し、該光路分割素子３および共焦点光学系１４を透過して測光回路１７，１８へ導かれる。
【００２３】
次に、測光回路１２，１７，１８の構成について説明する。なお、３つの測光回路１２，１７，１８は基本的に同じ構成を有しているので、以降の説明では特に区別しないものとする。
【００２４】
この測光回路は、光電変換素子２０の出力を増幅回路２１を通してフィードバック回路２２に入力し、フィードバック回路２２で光電変換出力がリファレンス信号３０と一致するように制御した感度設定信号を生成して高圧電源２３に与える。高圧電源２３が感度設定信号に応じて光電変換素子２０に印加する感度設定電圧を分圧回路１９を介して取り出してＡ／Ｄ変換回路２５でデジタル信号に変換する。このＡ／Ｄ変換回路２５から出力されるデジタル信号値を測定値としてメモリ回路２６に保存する。リファレンス信号３０は制御用ＣＰＵ２７からＤ／Ａ変換器２８へ入力したデジタル信号をアナログ信号に変換することによって生成される。Ａ／Ｄ変換回路２５でのサンプリングはサンプリングクロック回路２９から与えられるサンプリングクロックに同期して行われ、メモリ回路２６から測定値を読み出して表示手段３０に表示する。なお、光電変換素子２０は一般的によく使用される光電子増倍管を使用している。光電子増倍管は印加電圧によって感度を調節することができる。
【００２５】
この測定回路では、試料９からの被測定光は光電変換素子２０に入射し、その光量と光電変換素子２０に設定されている感度に応じた電気信号に変換され増幅回路２１へ出力される。増幅回路２１で増幅された信号は、フィードバック回路２２に導かれリファレンス信号３０と比較される。その結果が、感度設定用の高電圧電源２３にフィードバックされる。すなわち、増幅回路２１からの出力信号が常にＤ／Ａ変換回路２８からのリファレンス信号３０と同等になるよう制御される。
【００２６】
例えば、増幅回路２１の出力信号レベルがリファレンス信号レベルより低い場合は、フィードバック回路２２は高電圧電源２３に対して現在より高い感度に設定するような電圧設定信号を出力する。逆に、増幅回路２１の出力信号レベルがリファレンス信号レベルより高い場合は、フィードバック回路２２は高電圧電源２３に対して感度を下げるような電圧設定信号を送出する。
【００２７】
ここで、フィードバック制御の内容は、比例、微分、積分などの制御を光電変換素子２０から高電圧電源２３までの系の特性を考慮して選択する必要がある。
リファレンス信号３０は、制御用ＣＰＵ２７がＤ／Ａ変換回路２８に与えるデジタル値で決まることはすでに説明した通りであるが、そのデジタル値は光電変換素子２０の入力光量に対して出力電流が直線的に得られる領域であることが望ましい。
【００２８】
光電変換素子２０に光電子増倍管を用いた本例では、光電子増倍管の入力光量に対する出力電流の特性は図３に示すようになる。同図に示す区間（ａ）が入力光量に対して出力電流が直線的に得られる領域である。
【００２９】
光電子増倍管の場合、高電圧電源２３の電圧（光電子増倍管への印加電圧）に対して、図４に示すように電流増倍率（感度と同義）が変化するが、高電圧の上昇に伴って入射光量がゼロの状態での出力である暗電流が上昇するという特性を持っている。図３において（ｂ）の区間がこの暗電流が発生する部分に当たる。
従って、リファレンス値を決定するに当たっては、高電圧電源２３の上限での暗電流を考慮しなければならない。決定した出力電流により得られる増幅回路２１の出力電圧を求めることで理想的なリファレンス値を定めることができる。
【００３０】
このようにして設定された高電圧電源２３の出力電圧を分圧回路２４を介してＡ／Ｄ変換回路２５によりサンプリングクロック回路２９により発生されるクロックに同期してサンプリングし、ディジタルデータに変換し、メモリ回路２６に保存する。サンプリングクロックの速度は、前記フィードバック系の応答速度、ｘ方向スキャナ４の速度、要求される画像の解像（画素数）などを考慮して決定する。
【００３１】
このようにしてメモリ回路２６に保存されたデータは各画素に対応した光電変換素子２０の感度データに相当する。すなわち、試料９の明るい部分では光電変換素子２０の感度は低く、逆に暗い部分では感度が高いといったデータが保存されている。
【００３２】
メモリ回路２６に保存されたデータをそのまま濃淡情報として表示手段３０に表示すると、試料９の明るい部位では表示輝度が低く、試料９の暗い部位は表示輝度が高くなるので、実際の試料９のネガ画像のようになってしまう。
【００３３】
そこで、メモリ回路２６に保存された光電子増倍管２０の感度に相当するデータから、入力された光量に相当するデータに変換する処理を行う必要がある。光電変換素子２０として光電子増倍管を用いたとすると、各画素での感度Ｇ（ｘ，ｙ）は、メモリ回路２６に保存されたデータ（高電圧電源の値）をＶ（ｘ，ｙ）、光電子増倍管の構造による係数をα、ａを定数として一般に次式で表すことができる。
Ｇ（ｘ，ｙ）＝ａ・Ｖ（ｘ，ｙ） ^α …式（１）
また、与えられたリファレンス信号３０をＩｒｅｆとすれば、各画素における相対光量Ｉ（ｘ，ｙ）は、ｂを定数として，以下の式から求めることができる。
【００３４】

使用しているＣＰＵの性能によっては、このような演算処理を制御用ＣＰＵ２７に行わせることが可能である。ただし、単位時間当たりの処理データ量が多い場合、又は高速な処理速度が要求される場合などは、図１のなかに破線で示すデータ処理回路３１を別途設けることになる。又は、上記演算処理をメモリ回路２６に保存する前に行うように構成する。
【００３５】
このような実施の形態によれば、光電変換素子２０の出力電流がリファレンス値と一致するように光電変換素子２０の感度をフィードバック制御し、その感度データをメモリ回路２６に保存して光量情報として取得するようにしたので、これまでのレーザ走査型顕微鏡で必要とされてきた測定パラメータの設定を必要とせず、広いダイナミックレンジ、具体的には光電変換素子の感度調整範囲を最大限使用した測定を実現することができる。
【００３６】
（第２の実施の形態）
次に、第２の実施の形態に係る測光装置について説明する。
【００３７】
図５は第２の実施の形態に係る測光装置の回路構成図である。図５において第１の実施の形態と同等の機能については同一番号を付している。
【００３８】
第１の実施形態で述べたように、システムの測定速度を決定するサンプリングクロックの速度は、光電変換素子２０、増幅回路２１、フィードバック回路２２、高電圧電源２３を含むフィードバックループの応答速度に左右される。一般的に、光電変換素子２０を構成する光電子増倍管、増幅回路２１、フィードバック回路２２などの応答速度はマイクロ秒単位であるのに対して、高電圧電源２３の応答速度はミリ秒単位になってしまう。
【００３９】
そこで、本実施形態では光電子像倍管２０の感度を決定する高電圧電源の出力電圧値および測光値の両方を採用する構成としている。
【００４０】
第１の実施形態で述べたように、リファレンス値前後において光電変換素子２０からの出力信号は入力光量に対して直線的に変化する。従って、任意の点での増幅回路２１からの出力をＳ（ｘ，ｙ）、そのときの光電子増倍管の感度（高電圧電源２３の出力電圧値）をＶ（ｘ，ｙ）、光電子増倍管の構造による係数をαとすれば、任意の点における相対光量Ｉ（ｘ，ｙ）は式（３）より求めることができる。
【００４１】
Ｉ（ｘ，ｙ）＝Ｓ（ｘ，ｙ）／Ｖ（ｘ，ｙ） ^α …式（３）
このように、応答速度の速い増幅回路２１からの測光データと、このデータを測定した際の光電子増倍管２０の感度データとから光量を算出することで、高速な被測定光の変動にも追従できる測定を実現することができる。式（３）の演算はデータ処理回路３３において実行し、ここでの演算により取得された測定値はメモリ回路２６に保存する。
【００４２】
このような実施の形態よれば、測定パラメータの設定を必要とせず、広いダイナミックレンジで測定ができ、かつ高速な測定を同時に実現することができる。
以上の２つの実施の形態の中では、光電変換素子２０として光電子増倍管を用いているが、アバランシェダイオードなど素子自体の感度を可変できる光電変換素子であればそのまま置き換えて実施することが可能である。さらに、フォトダイオードやフォトトランジスタなど素子自体の感度を可変できない素子であっても、増幅回路２１の増幅率を可変とすることで同様の効果を得ることができる。
またフィードバック回路２２は各Ａ／Ｄ変換回路の後方に配置し、ディジタルフィードバック制御を行う構成としても同様の効果が得られることはいうまでもない。
【００４３】
以上、本発明について実施の形態に基づいて説明してきたが、以下の発明が含まれる。
【００４４】
（１）レーザビームで試料を２次元走査して得られた濃淡情報から試料画像を形成するレーザ走査型顕微鏡において、
試料からの信号光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記光電変換手段の信号光に対する感度又は電気信号に対する増幅率を設定する感度調整手段と、前記光電変換手段の出力信号が予め設定された基準値に近付くように前記感度調整手段を制御する感度制御手段とを備え、
前記感度制御手段により前記光電変換手段の出力信号を一定に保つよう制御したときの前記感度制御手段の出力を測定値とすることを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
【００４５】
（２）レーザビームで試料を２次元走査して得られた濃淡情報から試料画像を形成するレーザ走査型顕微鏡において、
試料からの信号光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記光電変換手段の信号光に対する感度又は電気信号に対する増幅率を設定する感度調整手段と、前記光電変換手段の出力信号が予め設定された基準値に近付くように前記感度調整手段を制御する感度制御手段と、前記光電変換手段への入力光量に対して出力電流が直線的に得られる領域に対応した基準値を前記感度制御手段に対して指示する手段とを具備したことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
【００４６】
（３）上記（１）又は（２）のレーザ走査型顕微鏡において、
光電変換手段は、
試料からの信号光が入射する光電子増倍管と、この光電子増倍管の出力信号を増幅する増幅回路とを有して構成され、
感度調整手段は、
外部から制御可能な高電圧を前記光電子増倍管に印加する高電圧電源から構成され、
感度制御手段は、
前記増幅回路からの出力信号と光電子増倍管の所定の感度に対応した基準値とを比較して、その偏差に応じた電圧設定値を前記高電圧電源へ出力するフィードバック回路を含んで構成された
ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
【００４７】
（４）上記（１）又は（２）のレーザ走査型顕微鏡において、
光電変換手段は、
試料からの信号光が入射する光電子増倍管と、この光電子増倍管の出力信号を増幅する増幅回路とを有して構成され、
感度調整手段は、
前記増幅回路に増幅率を決める信号を供給する電圧印加回路を含んで構成され、
感度制御手段は、
前記増幅回路からの出力信号と増幅回路の所定の増幅率に対応した基準値とを比較して、その偏差に応じた電圧設定値を前記増幅回路へ出力するフィードバック回路を含んで構成された
ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
【００４８】
（５）上記（３）のレーザ走査型顕微鏡において、
前記高電圧電源の出力電圧を検出する電圧検出回路と、この電圧検出回路で検出された電圧値をＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換回路と、このＡ／Ｄ変換回路から出力される電圧データを保存するメモリ回路と、このメモリ回路に保存された電圧データを相対光量の測定値に変換する処理手段と、この処理手段で変換された測定値を可視化表示する表示手段とを具備する。
【００４９】
（６）上記（３）のレーザ走査型顕微鏡において、
前記高電圧電源の出力電圧を検出する電圧検出回路と、この電圧検出回路で検出された電圧値をＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換回路と、このＡ／Ｄ変換回路から出力される電圧データを相対光量の測定値に変換するデータ処理回路と、このデータ処理回路の出力を保存するメモリ回路と、このメモリ回路のデータを読み出して可視化表示する表示手段とを具備する。
【００５０】
【発明の効果】
以上詳記したように本発明によれば、入射光量に応じた電気信号を出力する回路の感度、増幅率、オフセット量などの測定パラメータを設定すること無く、好適なコントラストと広いダイナミックレンジの画像が得られるレーザ走査型顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１の実施の形態に係る共焦点レーザ走査型顕微鏡の測光回路の構成図である。
【図２】第１の実施の形態に係る共焦点レーザ走査型顕微鏡の全体図である。
【図３】光電子増倍管の入射光量に対する出力電流特性を示す図である。
【図４】光電子増倍管の印加電圧に対する感度特性及び暗電流出力特性を示す図である。
【図５】第２の実施の形態に係る測光回路の構成図である。
【符号の説明】
１…レーザ発振器
２…ビームエキスパンダ
３…光路分割素子
４，５…スキャナ
８…対物レンズ
９…試料
１２，１７，１８…測光回路
２０…光電変換素子
２１…増幅回路
２２…フィードバック回路
２３…高電圧電源
２４…分圧回路
２５…Ａ／Ｄ変換回路
２６…メモリ回路

Claims

レーザビームで試料を２次元走査して得られた濃淡情報から試料画像を形成するレーザ走査型顕微鏡において、
試料からの信号光を電気信号に変換する光電変換手段と、
前記光電変換手段の信号光に対する感度又は電気信号に対する増幅率を設定する感度調整手段と、
前記光電変換手段の出力信号が予め設定された基準値に近付くように前記感度調整手段を制御する感度制御手段とを備え、
前記光電変換手段に設定された感度又は増幅率を前記濃淡情報に相当する測定値に変換して使用することを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
請求項１記載のレーザ走査型顕微鏡において、
前記光電変換手段からの出力信号と、前記光電変換手段の感度又は増幅率とから、前記濃淡情報に相当する測定値を求めることを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。