JPH09297269A - 走査型画像入力装置及び走査型プローブ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ライン毎に光電変換回路のオフセット電圧を検
出してリアルタイムに黒レベルの安定した画像を得られ
るようにすること。 【解決手段】標本３９を光学的に２次元走査して得られ
た該標本３９からの光を光電変換回路３１で受光して輝
度信号に変換し、この輝度信号を画像処理して標本画像
の情報を取得する走査型画像入力装置であり、走査期間
中に光電変換回路３１に標本３９からの光が入射しない
部分を使用して光電変換回路３１の出力に含まれる信号
から画像の黒レベルの補正量を検出し、この検出した補
正量に基づいて輝度信号を補正する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標本上を光で２次
元走査して標本画像を形成する走査型画像入力に係り、
特に共焦点走査型光学顕微鏡を含む走査型プローブ顕微
鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】光学顕微鏡は、ステージ上に載置したプ
レパラート上の標本を対物レンズで拡大して観測する構
造となっており、一般に標本に対する照明はランプ等の
光源からの光をコンデンサレンズを用いて標本の観察領
域全体に均等になるようにして照明する構造を採用して
いた。しかしながら、照明系としてこのような構造を採
用した場合、フレア等の問題があり、また、低コントラ
ストの標本を観察するにあたっては大変見ずらいものと
なってしまうという問題がある。

【０００３】これらの問題を改善するものとして、点状
光投射型（スポット光投射型）の光学顕微鏡である共焦
点走査型光学顕微鏡が提案された。この共焦点走査型光
学顕微鏡はレーザ光源等の点光源を対物レンズを介して
観察標本に点状に照射し、これにより観察標本の透過光
または反射光もしくは点状光を照射したことにより標本
から発生した蛍光を、再び対物レンズ、光学系を介して
点状に結像し、これを検出器で検出して像の濃淡情報を
得るようにしたものである。

【０００４】これだけでは点状光源が照射された点の濃
淡情報しか得られないので、標本をｘ軸及びｙ軸の方向
に移動して２次元面内で機械的に移動させるｘ−ｙ走査
方式や、光路をスキャン走査する走査光学系など、標本
と照射点位置とを相対的に２次元走査し、このｘ−ｙ走
査に同期してＣＲＴディスプレイ等の表示装置によりｘ
−ｙ走査位置に対応した各点位置に前記濃度情報の信号
と対応する輝点を表示することで、画像として観察でき
るようにしている。

【０００５】以上は共焦点走査型光学顕微鏡の原理構成
である。具体的には、レーザ光で走査されている標本か
らの透過光、反射光あるいは蛍光を検出器である光電子
増倍管やフォトダイオード等の光電変換器により電気信
号に変換したものをＡ／Ｄ変換回路によって量子化して
からメモリに記憶している。このように共焦点走査型光
学顕微鏡は、標本像情報を光電変換器で電気信号に変換
してからディジタル信号に変換してメモリに記憶する光
電信号処理回路を備えている。

【０００６】図４に上記共焦点走査型光学顕微鏡におい
て光電変換されたアナログ信号を量子化するまでの回路
構成を示している。光電変換回路１に入射した光が光電
変換回路１で電気信号に変換され、この電気信号がＡ／
Ｄ変換回路２で量子化された後にメモリ３にディジタル
値として記憶される。さらに、このディジタル値はディ
ジタル減算器４で減算処理された後に画像化される。

【０００７】例えば、図５に示される標本を走査する場
合、共焦点走査型光学顕微鏡の光学系が図５の標本の一
番高い表面に合焦しているとすれば、光電変換回路１か
らは図２（ｃ）に示すような信号が発生する。すなわ
ち、合焦面では光電変換回路１に入射する光量が増加す
るために信号レベルが高く、合焦面の前後の走査領域で
は光電変換回路１に入射する光量が無くなるために信号
レベルが０になる。この信号レベルの低くなる部分が最
終的な画像の黒レベルとなる。画像で黒レベルとは、光
電変換回路へ光が入射しない状態における光電変換回路
１の出力に相当するものであり、回路ではオフセット電
圧となる。

【０００８】一般に画像の黒レベルは光電変換回路に使
用される光電変換素子やオペアンプの出力の温度依存性
によって変動する。このため、ディジタル減算回路４の
出力に着目すると、図６に示すように複数ラインの走査
の間に、１ライン目からｎライン目まで画像の黒レベル
が変動している。そこで、ｎライン目のデータ取得が完
了後に黒レベルの補正を実施している。なお、図６では
縦軸をディジタル減算回路出力をアナログ値に換算して
表示している。

【０００９】上記の黒レベル補正は、シャッタを閉じる
などの方法によって光電変換回路１の入射光を遮断した
状態でデータをメモリ３に取り込み、ディジタル減算器
４において遮光時のデータを現在の入力データで減算す
ることにより実現される。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記し
たような黒レベル補正方式では、遮光時のデータを取り
込むため光電変換回路１を遮光する機械的動作を必要と
するので、高速走査時に１フレーム毎、特に１ライン走
査毎に画像の黒レベルの補正を実施することが困難であ
る。

【００１１】したがって、通常は連続走査の開始直前ま
たは直後に補正を実施することになるが、これでは連続
走査中の画像の黒レベルの変動は除去できない。本発明
は、上記のような実情に鑑みてなされたもので、標本走
査中に光電変換回路への入射光を機械的に遮光すること
なく画像の黒レベルを補正でき、走査速度の高速な共焦
点走査型光学顕微鏡においてもリアルタイムの画像の黒
レベル補正を実現し、黒レベルの安定した画像を得られ
る走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するために以下のような手段を講じた。本発明は、標
本を光学的に２次元走査して得られた該標本からの光を
光電変換回路で受光して輝度信号に変換し、この輝度信
号を画像処理して標本画像の情報を取得する走査型画像
入力装置において、走査期間中に前記光電変換回路に標
本からの光が入射しない部分を使用して前記光電変換回
路の出力に含まれる信号から画像の黒レベルの補正量を
検出し、この検出した補正量に基づいて前記輝度信号を
補正するようにした。

【００１３】本発明によれば、走査期間中に光電変換回
路に標本からの光が入射しない部分では、光電変換回路
の出力に画像の黒レベルに相当する回路のオフセット電
圧が現れるので、このオフセット電圧を検出して黒レベ
ルの補正量としている。したがって、シャッタ開閉のよ
うな機械的動作をする必要が無いため、高速走査中であ
ってもライン毎に黒レベルの補正ができるものとなる。

【００１４】標本をプローブ光で２次元走査して得られ
た該標本からの光を光電変換回路で受光して輝度信号に
変換し、この輝度信号を画像処理して標本画像の情報を
取得する走査型プローブ顕微鏡において、前記光電変換
手段へ標本からの光が入射しない部分を走査していると
きリセット信号を発生するリセット手段と、前記リセッ
ト信号が入力したときに前記光電変換手段から出力され
ている信号値を保持するボトム検出手段と、前記光電変
換手段から出力された輝度信号から前記ボトム検出手段
で保持されている信号値を減算する減算手段とを備え
る。

【００１５】本発明によれば、光電変換手段の出力に含
まれる信号から画像の黒レベルの補正量を検出して恒常
的に補正を行うことができ、走査速度の高速な共焦点走
査型光学顕微鏡においても画像の黒レベル補正を実現
し、黒レベルの安定した画像が得られる。

【００１６】前記リセット手段は、各走査ラインの先頭
位置にて光電変換手段へ標本からの光が入射しない部分
を走査しているものとしてリセット信号を発生する。標
本上を光ビームで２次元走査して得られる該標本からの
光を検出し、この光を画像処理して標本画像を得る共焦
点走査型光学顕微鏡において、該標本からの光を光電変
換する光電変換手段と、この光電変換手段で得られるア
ナログ値の信号の高域成分を除去するローパスフィルタ
と、ローパスフィルタの出力として得られるアナログ値
の最低値を保持するボトム検出回路と、該光電変換手段
の出力として得られたアナログ値から該ボトム検出手段
の出力値を減算する減算回路を具備するようにしてい
る。

【００１７】この結果、光電変換回路の出力に含まれる
信号から画像の黒レベルの補正量を検出して恒常的に補
正を行うことにより、走査速度の高速な共焦点走査型光
学顕微鏡においても画像の黒レベル補正を実現し、黒レ
ベルの安定した画像が得られる。

【００１８】標本上を光ビームで２次元走査して得られ
る該標本からの光を光電変換回路で受光して輝度信号に
変換し、この輝度信号を画像処理して標本画像を得る共
焦点走査型光学顕微鏡において、前記標本から前記光電
変換手段への入射光が０になる非合焦部分を走査してい
るときリセット信号を発生するリセット手段と、前記リ
セット信号が入力したとき前記光電変換手段から出力さ
れている信号値を保持するボトム検出手段と、前記光電
変換手段から出力された輝度信号から前記ボトム検出手
段で保持されている信号値を減算する減算手段とを備え
る。

【００１９】各ラインの走査開始直後に非合焦部分が存
在していれば、この光部分では電変換手段への入射光が
０になるので、各ラインの走査開始直後にリセット信号
を発生させることによりライン毎に黒レベル補正が実施
できることになる。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を共焦点走査型光学
顕微鏡装置に適用した場合の実施の形態について説明す
る。図１は画像の黒レベルを補正する黒レベル補正処理
回路部の構成を示しており、図３はその黒レベル補正処
理回路を備えた共焦点走査型光学顕微鏡装置の光学系全
体の構成を示している。先ず、共焦点走査型光学顕微鏡
装置の光学系について説明する。

【００２１】レーザ光源１１から出射されたレーザビー
ムを、スポット投影レンズ１２に通過して適宜集光さ
せ、光路上に配置したダイクロイックミラー１３で標本
側に反射する。標本側に反射されたレーザビームを、紙
面に直交する方向の回転軸を中心にして回動するガルバ
ノミラー１４に入射し、ガルバノミラー１４で反射され
たレーザビームを瞳投影レンズ１５で対物像面に結像し
た後、光路切り換えミラー１６へ入射する。従って、レ
ーザビームは回動するガルバノミラー１４によって光路
切り換えミラー１６の位置で図中の上下方向に走査され
ることになる。

【００２２】光路切り換えミラー１６で標本側へ反射さ
せたレーザビームを対物レンズ１７へ入射することによ
り標本１８に結像させる。よって、標本１８上に結像さ
れたレーザビームは、ガルバノミラー１４を走査駆動す
ることにより標本１８面で図中の左右方向に走査され
る。

【００２３】レーザビームをガルバノミラー１４による
光学偏向照射で左右方向に走査すると同時に、標本１８
を載置した走査ステージ１９を紙面と直交する方向に移
動走査させることにより、標本１８面をレーザビームに
て２次元走査することができる。

【００２４】しかして、標本１８からの反射光、又は標
本１８上の細胞が予め蛍光色素によって生化学的に標識
されている場合はレーザビームにより励起されて放射さ
れた蛍光は、前述した光路を逆に戻り、対物レンズ１
７、光路切り換えミラー１６、瞳投影レンズ１５、ガル
バノミラー１４を経てダイクロイックミラー１３を図中
上方へ透過する。ダイクロイックミラー１３を透過した
反射光または蛍光は、バリアフィルタ２１ａを透過し、
集光レンズ２２ａにて受光素子２３ａの受光面に集光さ
れる。

【００２５】一方、標本１８によって散乱された散乱光
は、この標本１８を下方へ透過した光と共にコンデンサ
レンズ２４で集光し、ビームスプリッタ２５で反射した
後にリングスリット２６に入射する。

【００２６】このリングスリット２６は、標本１８から
の透過光を遮光し、散乱光のみを透過させて、受光素子
２７の受光面へ入射させる。なお、上記光路切り換えミ
ラー１６は顕微鏡本体に対して挿脱自在に設けられるも
ので、この光路切り換えミラー１６を取り外すことで標
本１８の画像を観察光学系２８へ導くことが可能であ
り、透過照明光学系２９や落射照明光学系３０による照
明を観察者に提供することで、標本１８の透過像や落射
像を肉眼で顕微鏡観察したり、テレビカメラや写真撮影
装置で顕微鏡撮影することができるように構成されてい
る。

【００２７】このような、機械的、光学的構成を有する
共焦点走査型光学顕微鏡装置においては、標本１８上を
レーザビームで２次元走査することで、この標本１８か
ら得られた反射光、蛍光及び散乱光を、受光素子２３
ａ，受光素子２７の２系統（チャンネル）の光電変換素
子により検出する。

【００２８】次に、黒レベル補正処理回路部の構成につ
いて図１を参照して説明する。光電変換回路３１は、上
記した光学系における受光素子２３ａまたは受光素子２
７を含む光電変換回路である。以下、光電変換回路３１
に受光素子２３ａが含まれている場合を例に説明する。

【００２９】光電変換回路３１は、受光した光の輝度に
応じた電圧を有するアナログ値の輝度信号を出力する。
光電変換回路３１から出力される輝度信号の高域成分を
ローパスフィルタ３２で除去した後にボトム検出回路３
３に入力する。ローパスフィルタ３２のカットオフ周波
数は、ナイキスト周波数よりも低い範囲で、着目する雑
音の帯域によって決定する。例えば、水平周波数の約２
倍に設定すればライン毎に黒レベルが補正される。

【００３０】ボトム検出回路３３は、輝度信号の最低値
（ボトム）を検出して出力し、該最低値の出力をリセッ
ト回路３４から次のリセット信号が入るまで保持する回
路である。具体的には、共焦点走査型光学顕微鏡におい
ては、非合焦位置をレーザ走査しているとき光電変換回
路３１の入射光が０になることを利用して、非合焦位置
をレーザ走査しているときリセット信号を入力して光電
変換回路３１の出力をボトム（オフセット）として検出
するものである。図２（ａ）に示す分布特性を持った標
本を走査するのであれば、各ランイの先頭において非合
焦部分が存在するので、各ランイ先頭位置においてリセ
ット信号を発生させるものとする。

【００３１】光電変換回路３１で得た輝度信号及びボト
ム検出回路３３で得た当該輝度信号の最低値はそれぞれ
減算回路５に入力している。減算回路５は、光電変換回
路３１の輝度信号からボトム検出回路３３で保持する最
低値をアナログ減算する回路である。減算回路５で得た
減算結果はＡ／Ｄ変換回路３６で量子化してから画像デ
ータとしてメモリ３７に記憶する。

【００３２】このメモリ３７に記憶された輝度信号は、
そのまま例えばＣＲＴ及びその駆動回路で構成される画
像処理部に直接送られて画像表示に用いられる。以上の
ように構成された共焦点走査型光学顕微鏡において、図
５に示すような四角錐台の標本３９をレーザ走査したと
きに、受光素子２３ａで受光される標本３９からの反射
光を量子化するまでの信号処理について図２（ａ）〜
（ｅ）のタイムチャートを参照して説明する。

【００３３】図２（ａ）は四角錐台の標本３９のｘライ
ン走査方向の走査位置と標本３９の高さ分布との関係を
示している。今、レーザ光源１１及びガルバノミラー１
４を制御することにより対物レンズ１７より出射される
レーザビームがｘライン走査の走査開始位置（図中ｘラ
イン走査方向の左端）に入射しているとする。

【００３４】図２（ｂ）に示すように、ｘライン方向の
走査開始位置からｘライン走査を開始した直後にリセッ
ト回路３４からボトム検出回路３３に対してリセット信
号を入力する。

【００３５】図２（ａ）に示す例の場合、ｘライン走査
を開始してから所定距離は標本３９が存在しない非合焦
部である。このような標本３９が存在しない非合焦部領
域を走査している間は光電変換回路３１への入射光が０
になるので、図２（ｃ）に示すように光電変換回路３１
の出力には、光電変換回路３１を構成する受光素子やオ
ペアンプに起因する光電変換回路３１のオフセット値Ｖ
_DMINだけが現れることになる。このオフセット値Ｖ_DMIN
が画像の黒レベルとなる。

【００３６】走査位置が標本３９の存在する合焦部にな
ると光電変換回路出力が標本３９の一番高い部分でかつ
合焦部の出力値であるＶ_DMAXになる。また、走査位置が
標本３９の合焦面を通過して再び標本３９が存在しない
非合焦部にくると、光電変換回路３１の入射光が０にな
るので光電変換回路３１の出力には光電変換回路３１の
オフセット値Ｖ_DMINが現れる。

【００３７】ボトム検出回路３３にｘライン走査を開始
した直後にリセット回路３４からリセット信号が入力さ
れるので、図２（ｄ）に示すようにボトム検出回路３３
の出力はリセット信号が入力して出力がリセットされて
いる間だけＶ_PMAXを示し、リセットが解除されるとその
時の光電変換回路３１の出力であるオフセット値Ｖ_DMIN
をボトム検出回路７の出力として保持する。今回の走査
ライン（ｎライン目）の走査が終了するまで、又は次の
ライン（ｎ＋１ライン目）に移行してｎ＋１ライン目の
走査直後に発生するリセット信号が入力するまで、Ｖ
_DMINを保持する。

【００３８】減算回路３５は、光電変換回路３１から図
２（ｃ）に示す輝度信号が入力すると共に、ボトム検出
回路３３から図２（ｄ）に示すボトム検出信号（画像の
黒レベルに相当するオフセット値Ｖ_DMIN）が入力する。
そして、図２（ｃ）に示す輝度信号から図２（ｄ）に示
すボトム検出信号を減じることにより、図２（ｅ）に示
すようにオフセット値Ｖ_DMINの除去された映像信号をＡ
／Ｄ変換回路３６に対して送出する。

【００３９】以上の処理をｘ走査ラインが変化する度に
実行することにより、ライン毎に黒レベルの補正された
輝度信号を取得することができる。なお、減算回路３５
は、Ａ／Ｄ変換回路３６の入力保護のため出力に０Ｖ以
下を出力しないクランプ回路を内蔵しているため、リセ
ット回路３４の出力がＨの間も出力は０Ｖとなってい
る。

【００４０】光電変換回路３１のオフセットが除去され
た輝度信号がＡ／Ｄ変換回路３６で量子化された後にメ
モリ３７に記憶される。このようにしてメモリ３７に記
憶されたオフセットの除去された輝度信号がＣＲＴなど
構成される画像処理部に直接送られて画像表示される。

【００４１】このような実施の形態によれば、光電変換
回路３１に標本からの光が入射しない部分において光電
変換回路３１の出力から画像の黒レベルに相当する光電
変換回路３１のオフセットを検出し、光電変換回路３１
の出力から上記オフセットを減算するので、光電変換回
路３１のオフセットが除去されて黒レベルが０Ｖとなる
輝度信号を得ることができる。したがって、画像の黒レ
ベル補正のためにシャッタ開閉のような機械的動作をす
る必要が無いため、高速走査時に１フレーム毎、特に１
ライン走査毎に画像の黒レベルの補正を実施することが
でき、連続走査中の画像の黒レベルの変動が除去されリ
アルタイムに黒レベルの安定した画像が得られる。

【００４２】また、画像の黒レベル補正のためのシャッ
タ開閉を行わないため、実使用上のシャッタの寿命を延
ばすことができる。以上の説明では、本発明の走査型画
像入力装置を共焦点走査型光学顕微鏡に適用している
が、共焦点走査型光学顕微鏡以外の画像入力装置にも適
用することができる。例えば、標本が蛍光像のようなも
のであれば非共焦型の走査型プローブ顕微鏡に適用する
ことができる。蛍光標本の場合、蛍光部分以外からは入
射光が無いので蛍光部分以外を走査しているときにリセ
ット信号を送出して輝度信号のボトムを検出するように
する。各走査ラインの先頭位置に蛍光標本が存在しない
ようなものであれば、各ラインの先頭位置にてリセット
信号を発生させることができる。

【００４３】１ライン毎にスキャン信号が取り込まれ、
かつ走査中に標本からの光が入射しない部分が存在する
ような光学系を備えたもの又は標本であれば、走査型プ
ローブ顕微鏡以外であっても適用可能である。

【００４４】以上、実施の形態に基づいて説明してきた
が、本発明は以下の発明を含む。 （１） 蛍光標本上を光ビームで２次元走査して得られ
る該蛍光標本からの蛍光を光電変換回路で受光して輝度
信号に変換し、この輝度信号を画像処理して蛍光像の情
報を得る走査型光学顕微鏡において、前記標本から前記
光電変換手段への入射光が０になる蛍光標本が存在しな
い部分を走査しているときリセット信号を発生するリセ
ット手段と、前記リセット信号が入力したとき前記光電
変換手段から出力されている信号値を保持するボトム検
出手段と、前記光電変換手段から出力された輝度信号か
ら前記ボトム検出手段で保持されている信号値を減算す
る減算手段とを備える。

【００４５】蛍光標本の場合、各ラインの走査開始直後
には蛍光像が存在しないので、その部分でリセット信号
を発生することによりライン毎に黒レベル補正が実施で
きることになる。 （２） 上記走査型光学顕微鏡において、蛍光標本が存
在しない走査ライン先頭おいてリセット信号を発生させ
て光電変換手段から出力された輝度信号のボトムとなる
最低値を検出する。

【００４６】

【発明の効果】以上詳記したように本発明によれば、画
像の黒レベル補正のためにシャッタ開閉のような機械的
動作をする必要が無いため、ライン毎に光電変換回路の
オフセット電圧を検出して減算することができ、リアル
タイムに黒レベルの安定した画像を得られる走査型顕微
鏡を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】一実施の形態に係る共焦点走査型顕微鏡に備え
た黒レベル補正処理回路部の構成図である。

【図２】上記実施の形態に係る共焦点走査型顕微鏡にお
けるタイムチャートである。

【図３】上記実施の形態に係る共焦点走査型顕微鏡の光
学系の構成図である。

【図４】従来の黒レベル補正処理回路部の構成図であ
る。

【図５】標本の走査位置と合焦面位置との関係を示す図
である。

【図６】従来の黒レベル補正処理を示す図である。

【符号の説明】

３１…光電変換回路 ３２…ローパスフィルタ ３３…ボトム検出回路 ３４…リセット回路 ３５…減算回路 ３６…Ａ／Ｄ変換回路 ３７…メモリ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標本を光学的に２次元走査して得られた
   該標本からの光を光電変換回路で受光して輝度信号に変
   換し、この輝度信号を画像処理して標本画像の情報を取
   得する走査型画像入力装置において、 走査期間中に前記光電変換回路に標本からの光が入射し
   ない部分を使用して前記光電変換回路の出力に含まれる
   信号から画像の黒レベルの補正量を検出し、この検出し
   た補正量に基づいて前記輝度信号を補正するすることを
   特徴とする走査型画像入力装置。
2. 【請求項２】 標本をプローブ光で２次元走査して得ら
   れた該標本からの光を光電変換回路で受光して輝度信号
   に変換し、この輝度信号を画像処理して標本画像の情報
   を取得する走査型プローブ顕微鏡において、 前記光電変換手段へ標本からの光が入射しない部分を走
   査しているときリセット信号を発生するリセット手段
   と、 前記リセット信号が入力したときに前記光電変換手段か
   ら出力されている信号値を保持するボトム検出手段と、 前記光電変換手段から出力された輝度信号から前記ボト
   ム検出手段で保持されている信号値を減算する減算手段
   とを具備したことを特徴とする走査型プローブ顕微鏡。
3. 【請求項３】 標本上を光ビームで２次元走査して得ら
   れる該標本からの光を光電変換回路で受光して輝度信号
   に変換し、この輝度信号を画像処理して標本画像を得る
   共焦点走査型光学顕微鏡において、 前記標本から前記光電変換手段への入射光が０になる非
   合焦部分を走査しているときリセット信号を発生するリ
   セット手段と、 前記リセット信号が入力したとき前記光電変換手段から
   出力されている信号値を保持するボトム検出手段と、 前記光電変換手段から出力された輝度信号から前記ボト
   ム検出手段で保持されている信号値を減算する減算手段
   とを具備したことを特徴とする共焦点走査型光学顕微
   鏡。