JP4564266B2 - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、医学、生物学などの分野において生物組織などの状態を観察するために利用される走査型レーザ顕微鏡で利用される技術に関し、特に、走査時のスキャン速度に拘わらず一定な輝度の維持されている画像を得る技術に関する。

図８について説明する。同図は、従来の走査型レーザ顕微鏡における光電信号処理回路の構成例を示しており、特許文献１に開示されているものである。
この光電信号処理回路は、光電子増倍管１０１、高速前置増幅器１０２、パルス整形回路１０３、入力セレクタ１０４、アナログ積算器１０５、電圧比較器（Ａ）１０６、電圧比較器（Ｂ）１０７、オーバー警告発生器（Ａ）１０８、オーバー警告発生器（Ｂ）１０９、演算制御回路１１０、操作ユニット１１１、ゲイン設定部１１２、高圧電圧発生器１１３を備えて構成されており、光電子増倍管１０１から出力される光電信号の処理を行う。

光電子増倍管１０１からの出力電流は高速前置増幅器１０２によって電流電圧変換されて所定の電圧レベルとされる。高速前置増幅器１０２の出力は、その一部が直接に、また一部がパルス整形回路１０３を経由して、それぞれ入力セレクタ１０４へ入力される。
入力セレクタ１０４は、高速前置増幅器１０２からの出力信号波形の形状に基づいて出力を切り替える。より具体的には、光電子増倍管１０１への入射光量が極めて小さいためにその出力信号波形が独立パルス状の波形、すなわちパルス列の集合の様なランダムな波形の場合にはパルス整形回路１０３を経由した信号を出力し、一方、光電子増倍菅１０１への入射光量が大きいのでその出力信号波形が連続的で滑らかな波形の場合にはパルス整形回路１０３を経由しない信号を出力する。

入力セレクタ１０４から出力された信号は、アナログ積算器１０５へ入力され、演算制御回路１１０によってゲイン設定部１１２に対して予め設定された積分ゲインに従って積算された信号が光電信号として出力される。
この光電信号は、その後Ａ／Ｄ変換されてからビデオフレームメモリに記憶される。このデータを所定のビデオレートでビデオフレームメモリから読み出してＤ／Ａ変換し、ビデオ信号としてモニタ上に入力することによって、標本の画像がモニタ上に表示される。

一方、高速前置増幅器１０２の出力信号、すなわち光電子増倍管１０１からの出力電流が電流電圧変換されて所定の電圧レベルとされた信号は、ＬＰＦ（ローパスフィルタ）を入力段に有する電圧比較器（Ａ）１０６と、そのようなＬＰＦを有していない電圧比較器（Ｂ）１０７へも入力される。

電圧比較器（Ａ）１０６の入力段のＬＰＦは、高速前置増幅器１０２から出力信号の定常成分を抽出する。この定常成分は電圧比較器（Ａ）１０６によって電圧Ｖrefａと比較され、定常成分がＶrefａを超えるとオーバー警告発生器（Ａ）１０８にオーバー警告Ａを発生させる。電圧比較器（Ａ）１０６の比較結果を監視している演算制御回路１１０は、光電子増倍管１０１を機能させるための電圧を発生させている高圧電圧発生器１１３の出力電圧をこのとき直ちに低下させて光電子増倍管１０１を保護する。

電圧比較器（Ｂ）１０７は、高速前置増幅器１０２の出力信号における独立したパルス波形のクリッピングを検出するためのものであり、そのため入力段にはＬＰＦが設けられていない。電圧比較器（Ｂ）１０７は、前述した電圧Ｖrefａよりも高い電圧Ｖrefｂと比較することで高速前置増幅器１０２からの出力信号に含まれる過渡成分を検出する。ここで、高速前置増幅器１０２の出力信号が電圧Ｖrefｂを超えるとオーバー警告発生器（Ｂ）１０９にオーバー警告Ｂを発生させる。電圧比較器（Ｂ）１０７の比較結果を監視している演算制御回路１１０は、このとき直ちに高圧電圧発生器１１３の出力電圧を制限し、光電子増倍管１０１からの出力電流に対応する高速前置増幅器１０２からの出力電圧の上限をクリップさせて電圧Ｖrefｂ以下となるようにする。これにより、高速前置増幅器１０２の出力信号におけるパルスレベルがクリップするような高い電圧の光電子増倍管１０１への印加が防止される。

なお、操作ユニット１１１の操作パネルには、高圧電圧発生器１１３が光電子増倍管１０１へ印加する電圧を調整するために操作される“ＨＶ”ツマミや、ゲイン設定部１１２がアナログ積算器１０５へ設定するゲイン（利得）を調整するために操作される“ＧＡＩＮ”ツマミが設けられている。これらのツマミに対する回転操作は不図示のロータリーエンコーダに伝えられ、このときロータリーエンコーダから出力されるパルスが演算制御回路１１０へ入力されて処理される。これらのツマミを操作して行う調整では、まず、“ＨＶ”ツマミを操作してパルスレベルが上記のようにクリップする直前のクランプレベルまで光電子増倍管１０１に印加する電圧を上昇させ、このときに“ＧＡＩＮ”ツマミを操作してアナログ積算器１０５のゲインを上昇させて、その積算出力である光電信号がホワイトレベルに達するようにする。

このように、図８に示した光電信号処理回路では、高速前置増幅器１０２から出力される光電子増倍管１０１による光電信号出力の定常成分を検出する電圧比較器（Ａ）１０６に加え、その光電信号出力のパルス電圧を検出する電圧比較器（Ｂ）１０７を設けるようにし、このパルスの高さがクリップレベルに近づいたことをこの電圧比較器（Ｂ）１０７が検知するとユーザへ注意を与えるための警告を発生させると共に、光電子増倍管１０１への印加電圧を変化させる操作ツマミを昇圧の方向に回す操作を行っても、その印加電圧を所定値でクリップさせてそれ以上は上がらないようにしている。

このようにしたことにより、フォトンパルスのクリップが防止されて非直線性歪みの発生が回避できると共に、パルス高さのレベルをクリップレベル近くで制限できるので、その結果、光電子増倍管１０１からの光電信号をパルス的に処理する場合における光電子増倍管１０１への印加電圧の調整が適正にかつ容易に行えるようになり、フォトンパルス処理がより正確に実行できるようになると共に調整時の操作性が向上する。
特開平５−１４２４７６号公報

ところで、ここでレーザ光を走査して次の位置での光電子増倍管１０１からのデータ収集を行う場合には、レーザ光を走査するために光学系の軸の角度を変更する駆動部が必要である。従って、標本を二次元の面として観察する場合には駆動部による移動時間が必要となるため、完全なリアルタイムでの光電子増倍管１０１からのデータ収集は行うことができず、有限の時間間隔でデータ収集（サンプリング）がされることとなる。このサンプリングの時間間隔をサンプリングクロックとすると、アナログ積算器１０５での積算動作もサンプリングクロック毎にリセットしながら積算する動作を繰り返すようにする。つまり、この場合における光電子増倍管１０１からのデータ収集のためには、光電信号処理回路の構成としてサンプリングクロックに同期して各部が動作する構成を採ることが一般的である。

このような、サンプリングクロックに同期させる回路構成を採用した場合には、ある位置で収集された１つのデータが標本画像における１ピクセルのデータに相当するようになり、レーザ光の走査と連動させてデータ収集のサンプリングを行うこととなる。従って、この場合、サンプリングクロックの周波数はレーザ光を走査させるときのスキャン（走査）速度から一義的に決定される。そのため、標本を走査するスキャン速度を変更するためには、アナログ積算器１０５に予め設定されている積分ゲインも変更する必要があり、この変更を行わないと光電信号が変化してしまうためにモニタ上に表示される画像の輝度が変化してしまう。

この現象を防止するために、スキャン速度を変更する度に、操作ユニット１１１の“ＧＡＩＮ”ツマミをユーザが調整してから標本の走査を行うようにすることも考えられるが、標本を走査する範囲の変更のためにスキャン速度を変更する作業は頻繁に行われるため、このような標本観察条件を変える度に調整を行う方式では、観察の手間が煩雑になってしまう。また、スキャン速度が一定ではない走査を行って画像を取得することが必要となる場合もあるが、上述した方式ではこのような場合に得られる画像は輝度の不均一なものとなってしまうため、正しい観察ができなくなってしまう。

このように、従来の走査型レーザ顕微鏡に備えられていた、光電子増倍管からの光電信号を処理する光電信号処理回路では、走査時のスキャン速度を変更した場合に適正な画像を得ることが困難であるという問題を抱えていた。
本発明は上述した問題に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、走査時のスキャン速度に拘わらず一定の輝度の保たれた標本画像を得ることである。

本発明に係る走査型レーザ顕微鏡は、標本へ照射するレーザ光を当該標本上で走査させる走査手段と、当該レーザ光の照射に応じて当該標本から到来する光であって当該標本における当該レーザ光の照射面に対して共役な位置に配置されている共焦点ピンホールを通過した当該光の光電変換を行うフォトマルチプライヤと、当該フォトマルチプライヤの出力から生成される生成信号のサンプリングを当該レーザ光の走査の速度に応じた周期で行って当該生成信号の大きさを表すデジタルデータに変換して出力するＡ／Ｄ変換回路と、当該デジタルデータで表されている当該生成信号の大きさに基づいて画素の輝度が決定されてなる当該標本の画像を生成する画像生成手段と、当該レーザ光の走査の速度の変更に応じ、当該生成信号の制御を行う制御手段と、を有し、当該レーザ光の走査の速度を速くする変更をしたときには、当該Ａ／Ｄ変換回路は、当該周期を短くして当該生成信号のサンプリングを行い、当該制御手段は、当該レーザ光の走査の速度の変更に応じて当該生成信号の大きさを制御して、当該Ａ／Ｄ変換回路が出力するデジタルデータが、当該レーザ光の走査の速度の変更の前後で変化しないようにすることを特徴とするものである。

この構成によれば、レーザ光の走査の速度の変更がなされると、光電変換手段の出力から生成される生成信号であって、その大きさが標本画像における各画素の輝度の決定の基礎となる当該生成信号を制御手段が制御する。従って、レーザ光の走査の速度を速くする変更がされた場合には制御手段が生成信号を大きくする制御を行い、レーザ光の走査の速度を遅くする変更がされた場合には制御手段が生成信号を小さくする制御を行うことにより、レーザ光の走査の速度の変更前後における標本画像の輝度の均一化が図られる。この結果、走査時のスキャン速度に拘わらず一定の輝度の保たれた標本画像が得られるようになる。

なお、上述した本発明に係る走査型レーザ顕微鏡において、上述した制御手段は、当該フォトマルチプライヤへ印加される電圧を上述の走査の速度に基づいて変化させて上述の生成信号の大きさの制御を行うようにしてもよい。

ここで、この制御手段は、上述のフォトマルチプライヤについて予め得られている、当該フォトマルチプライヤへ印加する電圧と当該フォトマルチプライヤの電子増倍率との関係に基づいて上述の制御を行うようにしてもよい。
また、前述した本発明に係る走査型レーザ顕微鏡において、前述した生成信号は、前述のフォトマルチプライヤの出力の積算結果に所定の係数が乗じられて生成され、前述した制御手段は、当該所定の係数を前述の走査の速度に基づいて変化させて当該生成信号の大きさの制御を行うようにしてもよい。

また、前述した本発明に係る走査型レーザ顕微鏡において、前述した制御手段は、前述のレーザ光の強度を前述の走査の速度に基づいて変化させて前述の生成信号の大きさの制御を行うようにしてもよい。
また、前述した本発明に係る走査型レーザ顕微鏡において、前述した制御手段は、前述の共焦点ピンホールの開口径を前述の走査の速度に基づいて変化させて前述の生成信号の大きさの制御を行うようにしてもよい。

以上のように、本発明によれば、走査時のスキャン速度に拘わらず一定の輝度の保たれた標本画像を得ることができるようになるという効果を奏する。

以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
まず図１について説明する。同図は本発明を実施する走査型レーザ顕微鏡の第一の例の構成を示している。
レーザ光源１で発生させたレーザビーム（照明光）は、ビームエキスパンダ２を通過した後に、ビームスプリッタやダイクロイックミラー等の光路分割素子３で反射し、ガルバノミラー等などを用いて構成されているＸ方向スキャナ４及びＹ方向スキャナ５に順次入射して二次元走査するように偏向させられる。Ｙ方向スキャナ５を出射したレーザビームは瞳投影レンズ６及び結像レンズ７を経て対物レンズ８に入射し、標本９の上で二次元走査される。

このレーザビームの照射に対する標本９からの蛍光（または反射光）は、レーザビームと同じ光路を辿って光路分割素子３まで戻るが、光路分割素子３は透過し、更に、標本９における当該レーザビームの照射面に対して共役な位置に配置されており、開口径の変更が開口径制御器１２で可能な共焦点ピンホール１１を有する共焦点光学系１０を透過した後、ダイクロイックミラーや干渉フィルタ等の波長選択素子１３を経てフォトマルチプライヤ（光電子増倍管）１４で受光される。なお、ここでは、簡単のため、フォトマルチプライヤ１４が１つだけ設けられている場合を示しているが、波長選択素子１３とフォトマルチプライヤ１４と複数設けて異なる蛍光波長の測定を可能としてもよい。

フォトマルチプライヤ１４は光電変換部であり、波長選択素子１３を介して受光した標本９からの蛍光（または反射光）を光電変換して標本９におけるそのときのレーザ光の照射位置の輝度情報を示す電流値とするものである。この電流値である輝度情報は電流電圧変換回路１５により電圧値へと変換された後にアナログ積算器１６を経てＡ／Ｄ変換回路１７に入力されてデジタルデータに変換され、その後は標本９についての検出信号としてデータ処理装置２０に入力される。

ここで、アナログ積算器１６は、入力信号に対して任意の積分時定数で積分した信号を出力するものであり、ここでは入力された輝度情報を積分して積分輝度情報として出力する。
データ処理装置２０は、Ａ／Ｄ変換回路１７から送られてきたデジタルデータを処理し、上述した積分輝度情報に基づいて画素の輝度が決定されてなる画像、すなわち標本９の画像を生成してＣＲＴ（Cathode Ray Tube）モニタ２１に表示させる他、この走査型レーザ顕微鏡の各部に指示を与えて全体の動作を制御する。このデータ処理装置２０は、例えば、ＣＰＵ（中央演算装置）を用い、予め用意しておいた制御プログラムをこのＣＰＵに実行させるようにして構成することができる。

走査駆動回路２３はＸ方向スキャナ４を駆動させるものであり、走査駆動回路２４はＹ方向スキャナ５を駆動させるものである。つまり、Ｘ方向スキャナ４及びＹ方向スキャナ５と走査駆動回路２３及び２４とで走査部を構成する。
高圧電圧発生器１８は、Ａ／Ｄ変換回路１７によってデジタルデータにされた積分輝度情報と、観察前に予め行われる調整で得られる固有値パラメータとに基づいてフォトマルチプライヤ１４へ印加する電圧値を演算により求め、求められた電圧値を発生させてフォトマルチプライヤ１４へ印加する。メモリ１９には、観察前の調整によって得られる固有値パラメータが調整直後に格納され、この固有値パラメータが上述した電圧値の演算を行う際に読み出される。

走査制御装置２２は、Ａ／Ｄ変換回路１７によってデジタルデータにされた積分輝度情報と、必要に応じてはデータ処理装置２０が収集した情報とに基づいて、Ｘ方向スキャナ４及びＹ方向スキャナ５の移動位置や移動速度等を制御するための制御信号を走査駆動回路２３及び２４へ出力する。

なお、ビームエキスパンダ２、光路分割素子３、Ｘ方向スキャナ４、Ｙ方向スキャナ５、瞳投影レンズ６、結像レンズ７、対物レンズ８、走査制御装置２２、走査駆動回路２３、及び走査駆動回路２４で照射部を構成する。また、共焦点光学系１０は、開口径を変更可能な共焦点ピンホール１１、共焦点ピンホール１１の開口径を制御する開口径制御器１２、及び結像レンズ等からなる。また、アナログ積算器１６は積算部を構成し、Ａ／Ｄ変換回路１７、データ処理装置２０、及びＣＲＴモニタ２１で、表示部を構成する。

なお、共焦点ピンホール１１としては例えば単一のピンホールの径が拡大または縮小するものや、回転円板上に配設された径の異なる複数のピンホールが選択的に光路に挿入されるもの等を用いて構成することができる。ここで、開口径制御器１２による制御の手法はこの共焦点ピンホール１１の構成に応じて選択される。

次に図２について説明する。同図は図１に示した走査型レーザ顕微鏡の各部の動作タイミングの関係を示すタイミングチャートである。
図２に示されている各信号波形を説明する。
「サンプリングクロックタイミング」はサンプリングクロックを示しており、その途中でクロック周期、すなわちスキャン速度が変更されていることを示している。より具体的には、スキャン速度ｆａが「タイミング」ｔｃにおいてｆａよりも速いスキャン速度ｆｂへ切り替わることが示されている。

「フォトマルチプライヤ１４出力」は、検出された蛍光の輝度に対応する電流値を示しており、ここでは簡単のため、高圧電圧発生器１８の出力が一定の場合には一定量の輝度を検出しているものとして示している。
「アナログ積算器１６リセット」は、アナログ積算器１６の積算動作においてリセットの掛けられるタイミングを示しており、サンプリングクロックの立ち上がりのエッジのタイミングで信号レベルが“Ｌ”レベルから“Ｈ”レベルとなってアナログ積算器１６にリセットが掛けられていることを示している。

「アナログ積算器１６出力」は、「アナログ積算器１６リセット」が“Ｈ”レベルの場合には０Ｖを出力し、「アナログ積算器１６リセット」が“Ｌ”レベルの場合には「アナログ積算器１６リセット」が“Ｈ”レベルとなってから後の「フォトマルチプライヤ１４出力」の積算結果を出力している。

「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」は、「アナログ積算器１６リセット」が“Ｈ”レベルになる直前に「アナログ積算器１６出力」のＡ／Ｄ変換を実行することを示している。
「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」は、「アナログ積算器１６出力」をＡ／Ｄ変換して１０ｂｉｔ（１０２４値）のデジタルデータとして出力し、その値が「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」のパルスに従って更新されることを示している。

「高圧電圧発生器１８出力」は、スキャン速度をｆａからｆｂへ変更したときに高圧電圧発生器１８の出力を変化させていることを示している。
ここで「タイミング」に注目すると、ｔａ及びｔｂにおいては遅いスキャン速度ｆａでの動作時における各信号状態を示しており、ｔｃ及びｔｄではスキャン速度ｆａから速いスキャン速度ｆｂに変更した場合の各信号状態を示しており、ｔｅ、ｔｆ、及びｔｇではスキャン速度ｆａから速いスキャン速度ｆｂに変更したが本発明を適用しなかった場合の各信号状態を示している。

次に、図１に示した走査型レーザ顕微鏡の動作を、図２を用いて説明する。
図２において「タイミング」ｔｂ、ｔｃ、及びｔｄに着目する。
データ処理装置２０が遅いスキャン速度ｆａから速いスキャン速度ｆｂへのスキャン速度の変更をする場合、データ処理装置２０はこのスキャン速度の変更を走査制御装置２２へ通知すると共に、高圧電圧発生器１８を制御して発生させる電圧をそのスキャン速度ｆｂに応じて変化させる。このようにして、高圧電圧発生器１８で発生させる電圧値を高くすることにより、フォトマルチプライヤ１４では光電変換の電子増倍率が上昇するので、フォトマルチプライヤ１４の電流出力は増加する。

フォトマルチプライヤ１４の電子増倍率μと印加する電圧ＨＶとの関係は一般に、

である。なお、［数１］式において、α及びβはフォトマルチプライヤ１４固有の定数である。
標本画像の観察前に予め行われる調整時には、一定の光量を標本９へ照射しながらフォトマルチプライヤ１４へ印加する電圧を変化させたときに得られるＡ／Ｄ変換回路１７のデジタル出力から、フォトマルチプライヤ１４に固有であるこの定数α及びβをデータ処理装置２０が算出してメモリ１９に記憶させるようにする。

この状態で、スキャン速度をｆａからｆｂへ変更すると、データ処理装置２０は、取得する標本画像で一定の輝度を保つために必要とされるフォトマルチプライヤ１４の電流出力と、定数α及びβとに基づいて印加電圧ＨＶを算出し、算出された電圧を高圧電圧発生器１８に出力させる。

ここで、スキャン速度を速くしたことによって「アナログ積算器１６リセット」の周期が短くなってしまうが、この周期短縮による影響は、印加電圧を上昇させたことによるフォトマルチプライヤ１４の電流出力の増大分で相殺される結果、「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」のパルスが発生する時点における「アナログ積算器１６出力」の大きさはスキャン速度の変更前後で変化しない。従って、「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」もスキャン速度の変更前後で変化しない。

このデジタルデータの輝度情報である「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」がデータ処理装置２０で処理されることにより、スキャン速度の変更前後で明るさが不変の標本画像がＣＲＴモニタ２１に表示される。
なお、ここで、スキャン速度をｆａからｆｂへと速くしたにも拘わらずフォトマルチプライヤ１４への印加電圧を高くしなかったとすれば、「タイミング」ｔｆの部分で示されているように、「高圧電圧発生器１８出力」が「タイミング」ｔｂ時と同じレベルであるために、フォトマルチプライヤ１４の電流出力もタイミングｔｂ時と同じレベルに留まってしまうこととなり、「アナログ積算器１６出力」における積算動作の傾きは変化しない。ところが、その一方で、「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」はその周期が短くなってしまうため、「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」の値は小さくなってしまう。すると、結果として、スキャン速度を上げた後には暗い画像がＣＲＴモニタ２１へ表示されることとなってしまう。

以上のように、スキャン速度に応じてフォトマルチプライヤ１４へ印加する電圧値を変化させることにより、明るさが一定に保たれている画像の観察を継続することができるようになる。また、調整時にフォトマルチプライヤ１４の電子増倍率特性の固有パラメータα及びβの値をメモリ１９へ格納しておき、観察動作時にはメモリ１９から読み出した値に基づいてフォトマルチプライヤ１４へ印加する電圧値を算出するようにすることにより、フォトマルチプライヤ１４個々の電子増倍率特性のバラツキに影響されない輝度情報の検出が可能となる。

次に図３について説明する。同図は本発明を実施する走査型レーザ顕微鏡の第二の例の構成を示している。
図３に示す第二の例は、図１に示した第一の例におけるアナログ積算器１６に代えて、積分ゲインをデータ処理装置２０で適宜変更可能であるアナログ積算器２５とした点においてのみ第一の例と相違しており、その他は同様の構成であって既に説明を行っているので、ここでは詳細な説明を省略する。

次に図４について説明する。同図は図３に示した走査型レーザ顕微鏡の各部の動作タイミングの関係を示すタイミングチャートである。
図４において、「サンプリングクロックタイミング」、「フォトマルチプライヤ１４出力」、「アナログ績算器２５リセット」、「アナログ積算器２５出力」、「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」、「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」の各信号波形は、アナログ積算器１６がアナログ積算器２５とされている点を除けば図２に示したものと同様のものであって既に説明を行っているので、ここでは詳細な説明を省略する。

「高圧電圧発生器１８出力」は、スキャン速度をｆａからｆｂへ変更しても高圧電圧発生器１８の出力を変化させていないことを示している。
図３に示した走査型レーザ顕微鏡の動作を、図４を用いて説明する。
図４における「タイミング」ｔｂ、ｔｃ、及びｔｄに着目する。

データ処理装置２０が遅いスキャン速度ｆａから速いスキャン速度ｆｂへのスキャナ速度の変更をする場合、データ処理装置２０はスキャン速度の変更を走査制御装置２２へ通知すると共に、アナログ積算器２５での積算動作における積分ゲイン（積算結果に乗じられる係数）を、その変更前後のスキャン速度に応じ、変更前の積分ゲインに対してｆｂ／ｆａ倍にする。このように積分ゲインを大きくすることにより、フォトマルチプライヤ１４の電流出力を前述した第一の例のようにして増加させなくても、「アナログ積算器２５出力」の傾きが急峻となり、その値が短時間で大きくなる。

ここで、スキャン速度を速くしたことによって「アナログ積算器２５リセット」の周期が短くなってしまうが、この周期短縮による影響が「アナログ積算器２５出力」の傾きを急峻にしたことによって相殺される結果、「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」のパルスが発生する時点における「アナログ積算器２５出力」の大きさはスキャン速度の変更前後で変化しない。従って、「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」もスキャン速度の変更前後で変化しない。

このデジタルデータの輝度情報である「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」がデータ処理装置２０で処理されることにより、スキャン速度の変更前後で明るさが不変の標本画像がＣＲＴモニタ２１に表示される。
なお、ここで、スキャン速度をｆａからｆｂへと速くしたにも拘わらずアナログ積算器２５での積算動作における積分ゲインを大きくしなかったとすれば、「タイミング」ｔｆの部分で示されているように、「アナログ積算値１６出力」はその傾きが当然変化しない。ところが、その一方で、「Ａ／Ｄ変換回路１７のサンプリングタイミング」はその周期が短くなってしまうため、「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」の値が小さくなってしまう。すると、結果として、スキャン速度を上げた後には暗い画像がＣＲＴモニタ２１へ表示されることとなってしまう。

以上のように、スキャン速度に応じてアナログ積算器２５の積分ゲインを変更することにより、明るさが一定に保たれている画像の観察を継続することができるようになる。
次に図５について説明する。同図は本発明を実施する走査型レーザ顕微鏡の第三の例の構成を示している。

図５に示す第三の例は、レーザ光源１の出力パワー（レーザ光源１で発生させるレーザ光の強度）をデータ処理装置２０で制御可能とするレーザパワー制御器２６を追加した点を除けば、図１に示した第一の例と同様の構成であって既に説明を行っているので、ここでは詳細な説明を省略する。

次に図６について説明する。同図は図５に示した走査型レーザ顕微鏡の各部の動作タイミングの関係を示すタイミングチャートである。
図６において、「サンプリングクロックタイミング」、「フォトマルチプライヤ１４出力」、「アナログ績算器１６リセット」、「アナログ積算器１６出力」、「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」、「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」の各信号波形は図２に示したものと同様のものであって既に説明を行っているので、ここでは詳細な説明を省略する。

「高圧電圧発生器１８出力」は、スキャン速度をｆａからｆｂへ変更しても高圧電圧発生器１８の出力を変化させていないことを示している。
「レーザ光源１出力」は、スキャン速度をｆａからｆｂへ変更してその速度を速めた場合にはレーザ出力を高めることを示している。

図５に示した走査型レーザ顕微鏡の動作を、図６を用いて説明する。
図６における「タイミング」ｔｂ、ｔｃ、及びｔｄに着目する。
データ処理装置２０が遅いスキャン速度ｆａから速いスキャン速度ｆｂへのスキャナ速度の変更をする場合、データ処理装置２０はスキャン速度の変更を走査制御装置２２へ通知すると共に、レーザパワー制御器２６に指示を与え、レーザ光源１のレーザ出力パワーを、その変更前後のスキャン速度に応じ、変更前のレーザ出力パワーに対してｆｂ／ｆａとする。このようにレーザ出力パワーを高くすることにより、前述した第一の例にようにすることなくフォトマルチプライヤ１４の電流出力が増加する。

ここで、スキャン速度を速くしたことによって「アナログ積算器１６リセット」の周期が短くなってしまうが、この周期短縮による影響は、レーザ出力パワーを高くしたことによるフォトマルチプライヤ１４の電流出力の増大分で相殺される結果、「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」のパルスが発生する時点における「アナログ積算器１６出力」の大きさはスキャン速度の変更前後で変化しない。従って、「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」もスキャン速度の変更前後で変化しない。

このデジタルデータの輝度情報である「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」がデータ処理装置２０で処理されることにより、スキャン速度の変更前後で明るさが不変の標本画像がＣＲＴモニタ２１に表示される。
なお、ここで、スキャン速度をｆａからｆｂへと速くしたにも拘わらずレーザ光源１のレーザ出力パワーを高くしなかったとすれば、「タイミング」ｔｆの部分で示されているように、「高圧電圧発生器１８出力」が「タイミング」ｔｂ時と同じレベルであるために、フォトマルチプライヤ１４の電流出力もタイミングｔｂ時と同じレベルに留まってしまうこととなり、「アナログ積算器１６出力」における積算動作の傾きは変化しない。ところが、その一方で、「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」はその周期が短くなってしまうため、「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」の値は小さくなってしまう。すると、結果として、スキャン速度を上げた後には暗い画像がＣＲＴモニタ２１へ表示されることとなってしまう。

以上のように、スキャン速度に応じたレーザ光源１のレーザ出力パワーの変更をレーザパワー制御器２６に行わせることにより、明るさが一定に保たれている画像の観察を継続することができるようになる。
次に、本発明を実施する走査型レーザ顕微鏡の第四の例について説明する。

この第四の例における走査型レーザ顕微鏡の構成は、図１に示した第一の例の構成と同様のものであるので、その説明を省略する。
この第四の例は、スキャン速度の変更に応じて開口径制御器１２が共焦点ピンホール１１の開口径を制御するというものである。

ここで図７について説明する。同図は本発明を実施する走査型レーザ顕微鏡の第四の例における走査型レーザ顕微鏡の各部の動作タイミングの関係を示すタイミングチャートである。
図７において、「サンプリングクロックタイミング」、「フォトマルチプライヤ１４出力」、「アナログ績算器１６リセット」、「アナログ積算器１６出力」、「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」、「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」の各信号波形は図２に示したものと同様のものであって既に説明を行っているので、ここでは詳細な説明を省略する。

「高圧電圧発生器１８出力」は、スキャン速度をｆａからｆｂへ変更しても高圧電圧発生器１８の出力を変化させていないことを示している。
「共焦点ピンホール１１開口径」は、スキャン速度をｆａからｆｂへ変更してその速度を速めた場合には共焦点ピンホール１１の開口径を大きくすることを示している。

第四の例における図１に示した走査型レーザ顕微鏡の動作を、図７を用いて説明する。
図７における「タイミング」ｔｂ、ｔｃ、及びｔｄに着目する。
データ処理装置２０が遅いスキャン速度ｆａから速いスキャン速度ｆｂへのスキャナ速度の変更をする場合、データ処理装置２０はスキャン速度の変更を走査制御装置２２へ通知すると共に、開口径制御器１２に指示を与え、共焦点ピンホール１１の開口径を変更後のスキャン速度の速さに応じて大きくする。共焦点ピンホール１１の開口径を大きくするとフォトマルチプライヤ１４での受光光量が大きくなるので、前述した第一の例のようにすることなくフォトマルチプライヤ１４の電流出力が増加する。

ここで、スキャン速度を速くしたことによって「アナログ積算器１６リセット」の周期が短くなってしまうが、この周期短縮による影響は、共焦点ピンホール１１の開口径を大きくしたことによるフォトマルチプライヤ１４の電流出力の増大分で相殺される結果、「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」のパルスが発生する時点における「アナログ積算器１６出力」の大きさはスキャン速度の変更前後で変化しない。従って、「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」もスキャン速度の変更前後で変化しない。

このデジタルデータの輝度情報である「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」がデータ処理装置２０で処理されることにより、スキャン速度の変更前後で明るさが不変の標本画像がＣＲＴモニタ２１に表示される。
なお、ここで、スキャン速度をｆａからｆｂへと速くしたにも拘わらず共焦点ピンホール１１の開口径を大きくしなかったとすれば、「タイミング」ｔｆの部分で示されているように、「高圧電圧発生器１８出力」が「タイミング」ｔｂ時と同じレベルであるために、フォトマルチプライヤ１４の電流出力もタイミングｔｂ時と同じレベルに留まってしまうこととなり、「アナログ積算器１６出力」における積算動作の傾きは変化しない。ところが、その一方で、「Ａ／Ｄ変換回路１７サンプリングタイミング」はその周期が短くなってしまうため、「Ａ／Ｄ変換回路１７出力」の値は小さくなってしまう。すると、結果として、スキャン速度を上げた後には暗い画像がＣＲＴモニタ２１へ表示されることとなってしまう。

以上のように、スキャン速度に応じた共焦点ピンホール１１の開口径の変更を開口径制御器１２に行わせることにより、明るさが一定に保たれている画像の観察を継続することができるようになる。
その他、本発明は、上述した実施形態に限定されることなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良・変更が可能である。

例えば、上述した第一の例から第四の例にかけての手法を組み合わせて明るさに寄与する要因を組合せながら制御することにより、検出のダイナミックレンジ拡大と高分解能とを両立させることも可能である。
以上のように、本発明によれば、フォトマルチプライヤヘの印加電圧、フォトマルチプライヤからの出力信号を積算する際における積分ゲイン、標本へ照射するレーザ光の強度、若しくは今日焦点ピンホールの開口径といった、画像の輝度に影響を及ぼすパラメータを、レーザ光を走査するスキャン速度に応じて制御することにより、表示画像の輝度がスキャン速度に対する依存性を低下させることができるようになり、標本画像の観察における違和感が和らぐ。

また、レーザ光の走査中でもスキャン速度を変更することができるので、標本の観察領域として長方形領域だけでなく様々な形状の領域を設定しても走査することが可能となり、この結果、走査時間の短縮や不要な領域へのレーザ照射が低減される。

本発明を実施する走査型レーザ顕微鏡の第一の例の構成を示す図である。 図１に示した走査型レーザ顕微鏡の各部の動作タイミングの関係を示すタイミングチャートである。 本発明を実施する走査型レーザ顕微鏡の第二の例の構成を示す図である。 図３に示した走査型レーザ顕微鏡の各部の動作タイミングの関係を示すタイミングチャートである。 本発明を実施する走査型レーザ顕微鏡の第三の例の構成を示す図である。 図５に示した走査型レーザ顕微鏡の各部の動作タイミングの関係を示すタイミングチャートである。 本発明を実施する走査型レーザ顕微鏡の第四の例における、走査型レーザ顕微鏡の各部の動作タイミングの関係を示すタイミングチャートである。 従来の走査型レーザ顕微鏡における光電処理回路の構成例を示す図である。

符号の説明

１ レーザ光源
２ ビームエキスパンダ
３ 光路分割素子
４ Ｘ方向スキャナ
５ Ｙ方向スキャナ
６ 瞳投影レンズ
７ 結像レンズ
８ 対物レンズ
９ 標本
１０ 共焦点光学系
１１ 共焦点ピンホール
１２ 開口径制御器
１３ 波長選択素子
１４ フォトマルチプライヤ
１５ 電流変換回路
１６、２５ アナログ積算器
１７ Ａ／Ｄ変換回路
１８ 高圧電圧発生器
１９ メモリ
２０ データ処理装置
２１ ＣＲＴモニタ
２２ 走査制御装置
２３、２４ 走査駆動回路
２６ レーザパワー制御器
１０１ 光電子増幅管
１０２ 高速前置増幅器
１０３ パルス整形回路
１０４ 入力セレクタ
１０５ アナログ積算器
１０６ 電圧比較器（Ａ）
１０７ 電圧比較器（Ｂ）
１０８ オーバー警告発生器（Ａ）
１０９ オーバー警告発生器（Ｂ）
１１０ 演算制御回路
１１１ 操作ユニット
１１２ ゲイン設定部
１１３ 高圧電圧発生器

Claims (6)

1. 標本へ照射するレーザ光を当該標本上で走査させる走査手段と、
   前記レーザ光の照射に応じて前記標本から到来する光であって当該標本における当該レーザ光の照射面に対して共役な位置に配置されている共焦点ピンホールを通過した当該光の光電変換を行うフォトマルチプライヤと、
   前記フォトマルチプライヤの出力から生成される生成信号のサンプリングを前記レーザ光の走査の速度に応じた周期で行って当該生成信号の大きさを表すデジタルデータに変換して出力するＡ／Ｄ変換回路と、
   前記デジタルデータで表されている前記生成信号の大きさに基づいて画素の輝度が決定されてなる前記標本の画像を生成する画像生成手段と、
   前記レーザ光の走査の速度の変更に応じ、前記生成信号の制御を行う制御手段と、を有し、
   前記レーザ光の走査の速度を速くする変更をしたときには、前記Ａ／Ｄ変換回路は、前記周期を短くして前記生成信号のサンプリングを行い、
   前記制御手段は、前記レーザ光の走査の速度の変更に応じて前記生成信号の大きさを制御して、前記Ａ／Ｄ変換回路が出力するデジタルデータが、前記レーザ光の走査の速度の変更の前後で変化しないようにする
   ことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
2. 前記制御手段は、前記フォトマルチプライヤへ印加される電圧を前記走査の速度に基づいて変化させて前記生成信号の大きさの制御を行う、
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. 前記制御手段は、前記フォトマルチプライヤについて予め得られている、当該フォトマルチプライヤへ印加する電圧と当該フォトマルチプライヤの電子増倍率との関係に基づいて前記電圧を変化させる制御を行うことを特徴とする請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡。
4. 前記生成信号は、前記フォトマルチプライヤの出力の積算結果に所定の係数が乗じられて生成され、
   前記制御手段は、前記所定の係数を前記走査の速度に基づいて変化させて前記生成信号の大きさの制御を行う、
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
5. 前記制御手段は、前記レーザ光の強度を前記走査の速度に基づいて変化させて前記生成信号の大きさの制御を行うことを特徴とする請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
6. 前記制御手段は、前記共焦点ピンホールの開口径を前記走査の速度に基づいて変化させて前記生成信号の大きさの制御を行うことを特徴とする請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。

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