JP4493453B2

JP4493453B2 - 光検出回路および該光検出回路を備えた走査型共焦点顕微鏡

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Publication number: JP4493453B2
Application number: JP2004272353A
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Inventors: 秀夫渡部; 章広北原
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Publication date: 2010-06-30
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Description

本発明は、光検出回路およびそれを備えた走査型共焦点顕微鏡に関し、特に、試料の観察条件の変化に自動的に対応して、その観察条件に応じた適切な画像データを取得することが可能な光検出回路およびそれを備えた走査型共焦点顕微鏡に関する。

従来、走査型共焦点顕微鏡は、試料に点状照明し、試料からの透過光または反射光、蛍光を共焦点絞り上に集光させた後、この共焦点絞りを通過する光の強度を光検出器で検出することによって試料の表面情報を取得している。また、走査型共焦点顕微鏡は、点状照明を種々の方法によって試料面上を走査することにより、試料の広い範囲の表面情報を取得することができる。

図１０は、従来の走査型共焦点顕微鏡の概略的な構成を示す図である。
図１０に示す走査型共焦点顕微鏡では、光源１０１から出射した光が、ビームスプリッター１０２を透過した後、２次元走査機構１０３に入射する。２次元走査機構１０３は、第１の光スキャナ１０３ａと第２の光スキャナ１０３ｂとからなり、光束を２次元に走査し、対物レンズ１０７へと導く。対物レンズ１０７へ入射した光束は、集束光となって試料１０８の表面上を走査する。

試料１０８の表面で反射した光は、再び対物レンズ１０７から２次元走査機構１０３を介してビームスプリッター１０２に導入された後、ビームスプリッター１０２によって反射され結像レンズ１０９によってピンホール１１０上に集光する。ピンホール１１０により試料１０８の集光点以外からの反射光をカットし、ピンホール１１０を通過する光だけを光検出器１１１によって検出する。

試料１０８は、試料台１１３上に保持されており、ステージ１１４および光検出器１１１は、コンピュータ１１２によって制御されている。
ここで、対物レンズ１０７による集光位置は、ピンホール１１０と光学的に共役な位置にあり、試料１０８が対物レンズ１０７による集光位置にある場合は、試料１０８からの反射光がピンホール１１０上で集光してピンホール１１０を通過する。試料１０８が対物レンズ１０７による集光位置からずれた位置にある場合は、試料１０８からの反射光はピンホール１１０上に集光せず、ピンホール１１０を通過しない。

図１１は、対物レンズ１０７と試料１０８の相対位置（Ｚ）と光検出器１１１の出力（Ｉ）の関係を示す図である。
以下この関係をＩ−Ｚカーブと呼ぶ。

図１１に示すように、試料１０８が対物レンズ１０７の集光位置Ｚ０にある場合、光検出器１１１の出力は最大となり、この位置から対物レンズ１０７と試料１０８の相対位置が離れるに従い光検出器１１１の出力は急激に低下する。

この特性により、２次元走査機構１０３によって集光点を２次元走査し、光検出器１１１の出力を２次元走査機構１０３に同期して画像化すれば、試料１０８のある特定の高さの部分のみが画像化され、試料１０８を光学的にスライスした画像（共焦点画像）が得られる。さらに、ステージ１１４で試料１０８を光軸方向に離散的に移動させ、各位置で２次元走査機構１０３を走査して共焦点画像を取得し、試料１０８上の各点で光検出器１１１の出力が最大になるステージ１１４の位置を検出することにより試料１０８の高さ情報が得られる。また、試料各点における光検出器１１１の出力の最大値を重ねて表示することにより、全ての面にピントの合った画像（以降、エクステンド画像）を得ることが出来る。

このような走査型共焦点顕微鏡において、表示される画像内の輝度差が大きいような場合、すなわち明るい部分と暗い部分との差が大きい試料を観察している場合には、画面上で飽和しないように検出感度を調整する必要がある。その際の調整は、明るい部分を基準に行うしかなく、そうすると、暗い部分のデータはノイズが多く含まれてしまうため、一般的には、対数アンプ（γ特性）を用いて明るい部分を圧縮しかつ暗い部分を明るくして光検出ダイナミックレンジの拡大を行い、全体のコントラストを下げる調整を行っている。また、暗い部分の見易さを向上させるために、ＬＵＴ（ルックアップテーブル）を用いる技術も開示されている。
特開平７−２１２１５８号公報特開平６−１２４１９２号公報

しかしながら、従来の走査型共焦点顕微鏡においては、表示される画面の輝度差が大きいような試料を観察する場合、対数アンプを用いると暗部のゲインが大きくなっているため、明るくはなっていても回路のノイズが大きく付加されてしまい、もとよりＳ／Ｎが悪化してしまう。また、ＬＵＴを用いるのは単に見た目の明るさを調節したにすぎず、Ａ／Ｄ変換時に決まってしまったＳ／Ｎを改善する作用はなく、結果として雑音の少ない良質の画像が得られない。このようなことから、その場合には、光検出ダイナミックレンジの拡大は試料暗部の光検出信号のＳ／Ｎを劣化させずに行うことが重要であると言える。

一方、輝度差が比較的に小さい試料の観察、或いは試料の輝度差が比較的に小さい部分に注目した観察の場合には、光検出ダイナミックレンジを拡大するために明るい部分を圧縮しかつ暗い部分を明るくするようなことは望ましくない。これは、明るくして観察すると、明るい部分は圧縮されるために、明るさの違いが認識し難くなってしまうからである。

上述したようなことから、光検出ダイナミックレンジの拡大は試料に応じて行えるようにするのが望ましいと言える。その拡大を行うか否かにより観察される試料の明るさに変化が生じる。このため、光検出ダイナミックレンジの拡大を試料に応じて行えるようにする他に、その拡大の有無による試料の明るさに生じる変化を自動的に抑えるようにすることも重要であると考えられる。

光検出ダイナミックレンジの拡大の有無により、試料の見え方は変化する。このことから、その拡大の有無は、試料を観察するうえでの条件の一つと言える。試料の明るさの変化は、光検出ダイナミックレンジの拡大の有無以外の観察条件の変化、例えば対物レンズの切り換えによっても生じる。このため、そのような観察条件の変化にも自動的に対応することが重要であると考えられる。

本発明は、試料の観察条件の変化に自動的に対応して、その観察条件に応じた適切な画像データを取得することが可能な光検出回路および該光検出回路を備えた走査型共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明は、上記課題を解決するため、下記のような構成を採用した。
すなわち、本発明の光検出回路は、試料からの光信号を増幅して検出する光検出手段と、光検出手段からの出力信号を所定の増幅率で増幅する第１の増幅手段と、第１の増幅手段の増幅率より小さい増幅率で光検出手段からの出力信号を増幅して出力する１つ以上の第２の増幅手段と、第２の増幅手段からの出力信号にオフセットを与えるオフセット手段と、オフセット手段によりオフセットが与えられる第２の増幅手段からの出力信号を整流する整流手段と、オフセット・整流された第２の増幅手段からの出力信号と第１の増幅手段からの出力信号を用いた加算、及び減算の一方を行う加減算手段と、第１の増幅手段からの出力信号、並びに加減算手段が加算、及び減算の一方を行って得られる出力信号の何れか一方を選択して出力するための切換手段と、切換手段による出力信号の切り換えに応じて光検出手段の増幅率を変更する増幅率変更手段と、を備えている。

上記増幅率変更手段は、切換手段による出力信号の切り換えの前後における出力信号の信号レベルの予想される変化量、及び光検出手段のゲイン特性を基に、該光検出手段の増幅率を変更する、ことが望ましい。また、上記切換手段によって出力される出力信号の、顕微鏡で行われる対物レンズの切り換えの前後における信号レベルの予想される変化量、及び光検出手段のゲイン特性を基に、該光検出手段の増幅率を変更できる、ことが望ましい。

また、本発明の一態様によれば、本発明の走査型共焦点顕微鏡は、上述の光検出回路を備えたことを特徴とする。

本発明によれば、試料の観察条件の変化に自動的に対応して、その観察条件に応じた適切な画像データを取得することができる。

以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について述べる。
図１乃至図３を用いて本発明の第１の実施の形態を説明する。
図1は、本発明を適用した走査型共焦点顕微鏡の構成を示すブロック図である。

まず、顕微鏡本体１は次のように構成される。
レーザー光源６は、試料１１の表面を走査するスポット光としてのレーザー光を発生させるためのものであり、ミラー７は、このレーザー光源６からのレーザー光を２次元走査機構５に導くための反射鏡である。２次元走査機構５は、ミラー７を介して得たレーザー光源６からのレーザー光を２次元走査するための機構である。これは、２次元走査制御回路４の制御のもとにスポット光をＸＹ走査し、例えば、Ｘ軸方向走査用の共振スキャナとY軸方向走査用のガルバノスキャナとを有していて、これら共振スキャナ、ガルバノスキャナをそれぞれＸ軸方向、Ｙ軸方向に振ることで対物レンズ１０に対するスポット光の光路をＸＹ方向に振らせることができる。

レボルバ９は、倍率の異なる複数の対物レンズ１０を保持したものである。このレボルバ９は、Ｚ軸移動制御回路１７により光軸方向（上下方向）に移動させることができると共に、切り替えにより複数の対物レンズ１０のうちで所望の倍率を持つ対物レンズ１０を顕微鏡の観察光路中に設定することができるものである。そして、この設定された対物レンズ１０を介して２次元走査機構５からのスポット光をステージ１２上の試料１１に２次元走査しながら照射する。ステージ１２は、試料１１を保持するものである。

一方、試料１１からの反射光は、対物レンズ１０を通って２次元走査機構５に戻り、２次元走査機構５からハーフミラー８へと戻される構成である。ハーフミラー８は、２次元走査機構５に対するレーザー光源６の出射光路上に設けられ、２次元走査機構５を介して得られる試料１１からの反射光を検出系に導くための鏡であって、半透明鏡である。レンズ１３は、このハーフミラー８を介して得た２次元走査機構５からの反射光を集光するレンズであり、ピンホール板１４は所要の径のピンホールを開けたもので、光検出器１５の受光面の前面におけるレンズ１３の焦点位置にそのピンホールが配置される。光検出器１５は、ピンホールを介して得られる光をその光量対応の電気信号に変換する光検出素子である。光検出器１５から得られた電気信号は増幅器１６で所要のレベルまで増幅される。

そして、コンピュータ２の内部には顕微鏡制御回路１８と画像入力回路１９がある。顕微鏡制御回路１８は、顕微鏡本体１内の２次元走査制御回路４、Ｚ軸移動制御回路１７などに接続され、コンピュータ２に図示しない入力手段によりオペレータからの命令、例えば2次元走査制御回路４への走査の開始・停止やレボルバ９の移動などの処理を、顕微鏡本体１が適切に実行するように制御するものである。画像入力回路１９は、光検出器１５で光電変換され増幅器１６で増幅された信号と２次元走査制御回路４からのタイミング信号とを受け取り、コンピュータ２がこれを画像化し、モニタ３に表示することで試料１１の表面情報を得ることができるようにするものである。

図２は、本発明を適用した光検出回路の構成を示す図である。
本発明を適用した光検出回路は、光検出器１５および増幅器１６とにより構成される。
光検出器１５は、試料１１からの光を検出して光電変換する。その光検出器１５からの出力信号は、第１のリニア増幅器２０及び第２のリニア増幅器２１に入力され、第１のリニア増幅器２０において所定の増幅率（ゲインＧ１）で増幅し、第２のリニア増幅器２１においてゲインＧ１より小さい増幅率（ゲインＧ２）（Ｇ１＞Ｇ２）で増幅する。そして、第２のリニア増幅器２１にはオフセット電圧が加えられている。

第２のリニア増幅器２１を通過した信号は、半波整流回路２２によって正負のうち片側の信号のみが通過するように加工される。最後に加減算回路２３によって第１のリニア増幅器２０の出力と半波整流回路２２の出力とが演算され、増幅器１６の出力信号として得られる構成である。

図３は、暗部のＳ／Ｎの低下を招かずに入力ダイナミックレンジを拡大させる過程を説明するための図である。
図１乃至図３を用いて説明した増幅器は、暗部のＳ／Ｎの低下を招かずに入力ダイナミックレンジを拡大させる。図３を用いてその過程を説明する。図３の横軸は入力電圧であり、縦軸は出力電圧を示す。試料１１には様々なものが存在するが、特に高コントラスト（明部と暗部の輝度差が大きい）のある試料の観察をする場合を例に挙げる。図３中のＡは第１のリニア増幅器２０の出力信号を示している。同様に、Ｂは第２のリニア増幅器２１、Ｃは加減算回路２３の出力信号をそれぞれ示している。これは以降でも同様である。

一般的に、高コントラストのある試料を観察すると入力電圧が０〜Ｖ１の領域に収まりきらずに、明部がＶ１〜Ｖ２の領域にかかってしまうことがある。このとき画像入力回路１９の入力ダイナミックレンジがＶ０に等しいとすると、明部は表示の限界を超えてしまい白く飽和してしまう。

これを回避するために試料１１への照明強度を下げる、例えばレーザー光源６の出力を抑えると、明部がＶ０以下に収まってはくるが今度は暗部のレベルが下がってしまう。すると、暗部のデータは輝度的にも判別し難くなるのに加え、回路雑音などに影響されＳ／Ｎが悪くなり、データの質が下がってしまう。これを回避するために第２のリニア増幅器２１の経路を設けている。

第１のリニア増幅器２０は、０〜Ｖ１及びＶ１超過の入力信号をそのままＧ１倍して出力する（図３中のＡ参照）。一方、第２のリニア増幅器２１にはオフセット用の基準電圧が入力されており、光検出器１５からの入力信号がオフセット電圧を超えるとこの電位を境にして正負の出力を生ずるようになっている。つまり、「入力電圧＜オフセット電圧」の範囲では入力信号がＧ２倍された負の出力であり、「入力電圧＞オフセット電圧」の範囲では入力信号がＧ２倍された正の出力が得られる（図３中のＢ参照）。

続いて、この第２のリニア増幅器２１の出力が半波整流回路２２に入力されるので、負の領域、即ち「入力電圧＜オフセット電圧」の範囲では０が出力され、正の領域、即ち「入力電圧＞オフセット電圧」の範囲での入力信号がＧ２倍された出力が得られることになる。

よって、加減算回路２３（ここでは減算とする）に対しては、入力電圧がＧ１倍された第１のリニア増幅器２０からの信号と、入力電圧が「０〜オフセット電圧」の範囲では０、オフセット電圧以上でＧ２倍された信号が与えられることになる。

その結果、加減算回路２３からの出力電圧は、入力電圧が「０〜オフセット電圧」の範囲では第１のリニア増幅器２０からのＧ１倍された信号そのものとなり、オフセット電圧以上の領域ではトータルゲインとして（Ｇ１−Ｇ２）倍された信号になる（図３中のＣ参照）。

すなわち、図３に示すように第１のリニア増幅器２０単体では入力電圧Ｖ１までしか実質扱えなかったものが、第２のリニア増幅器２１の径路によってオフセット電圧以上の領域ではゲインを下げる働きが起こり、入力電圧Ｖ１ではまだ飽和レベルに達しなくなる。よって、入力電圧がＶ２のレベルまで取り扱うことができるようになり、全体としてＶ１〜Ｖ２の範囲分ダイナミックレンジが拡大されることになる。

通常使用される従来の対数アンプは、ダイナミックレンジを広げる効果をもたらすが、回路的には暗部のゲインを大きくし明部のゲインを下げる働きをしていることになり、暗部は輝度的には明るくなるが雑音に対しても増幅率が高くなり、Ｓ／Ｎの劣化を起こしてしまうが、本発明のように構成することにより、暗部のゲインは変えずに明部のゲインを下げることによってダイナミックレンジ拡大の効果を持たせるのと同時に、Ｓ／Ｎの劣化を起こさないことを両立させている。

なお、加減算回路２３の他の例として、減算ではなく第２のリニア増幅器２１の経路を反転増幅し、負の半波整流の後で加算しても良い。つまり、実際の回路構成の規模等を考慮して、最終的に明部のゲインが下がるように組み合わせれば良い。

また、異なるゲインの系（リニア増幅器、オフセット電圧、半波整流器）をさらに並列に追加しても良い。このように複数段にすることで折れ点が複数設定でき、対数アンプの伝達特性にも近似できる。

折れ線特性を利用すると、図３に示すように、リニア特性と比較して、入力信号が大きい部分ではその増加分に対する出力信号の増加分は小さくなり、明るい部分は圧縮されてしまう形となる。このため、明るい部分に着目して試料１１の観察を行うような場合、リニア特性を利用するほうが望ましいと言える。このようなことから、本実施の形態では、第１のリニア増幅器２０からの出力信号を加減算回路２３に出力させるリニア特性の利用と、第１のリニア増幅器２０からの出力信号に対し第２のリニア増幅器２１からの出力信号を減算させる折れ線特性の利用と、の切り換えを行えるようにしている。

その特性の切り換えは、第２のリニア増幅器２１からの出力信号に対する半波整流回路２２からの出力信号の演算を行うか否かを選択できる機能を加減算回路２３に搭載させることで実現させることができる。或いは、第２のリニア増幅器２１へのオフセット電圧を変更することでも実現させることができる。これは、加減算回路２３が出力する信号は、第２のリニア増幅器２１に入力される光検出器１５からの入力信号がオフセット電圧を超えるまで第１のリニア増幅器２０の出力信号と一致することから、そのオフセット電圧として電圧値Ｖ１以上のもの（入力信号が電圧値Ｖ１となると第１のリニア増幅器２０の出力信号は電圧値がＶ０となって飽和する）を設定すれば実質的にリニア特性を利用することになるためである。ここでは、加減算回路２３への信号により、特性の切り換えが行えるとの前提で説明を行うことにする。その前提では、特性の切り換えは、例えば不図示の入力手段を介したオペレータからの指示に応じて顕微鏡制御回路１８が、増幅器１６の加減算回路２３に出力する信号（以降「切換信号」という）を変化させることで実現される。

折れ線特性では明るい部分は圧縮された形となることから、図４に示すように、リニア特性（Ａ）から折れ線特性（Ｃ）に切り換える観察条件の変更を行う場合、出力信号におけるダイナミックレンジはその切り換えによって狭くなってしまい、全体的に輝度が下がったように見えることになる。それにより、オペレータ（利用者）にとっては輝度を上げるための調整を行う必要性が生じてしまい、迅速な観測が行えなくなる。一方、折れ線特性からリニア特性に切り換える観察条件の変更を行う場合には、その切り換えによって出力信号におけるダイナミックレンジは広くなることから、明るい部分が表示可能な限界を超えてしまう飽和が生じ易くなる。このため、オペレータにとっては輝度を下げるための調整を行う必要性が生じてしまい、やはり迅速な観測が行えなくなる。このようなことから、本実施の形態では、以下のように特性の切り換えに自動的に対応して、増幅器１６から常に適切な出力信号を出力させるようにすることにより、輝度調整を行うことによる作業効率の低下を回避できるようにさせている。

本実施の形態では、光検出器１５として、光電子増倍管（ＰｈｏｔｏＭｕｌｔｉｐｌｉｅｒＴｕｂｅ：以下、「ＰＭＴ」という）のような電気信号を電子レベルで増幅する機能を有したものを採用している。そのようなものを光検出器１５として採用したのは、電気回路の増幅ではできない高Ｓ／Ｎの増幅が行えるからである。そのような増幅が行えるものであれば、光検出器１５としてＰＭＴ以外のもの、例えばＡＰＤ（アバランシェ・フォト・ダイオード）を採用しても良い。その光検出器１５の増幅率の変更は顕微鏡制御回路１８からの指示によって行われる。

不図示の入力手段を介してオペレータから特性の切り換えが指示されると、顕微鏡制御回路１８は加減算回路２３に入力させる切換信号を変化させる。また、その切り換え内容に応じて、光検出器１５の増幅率を合わせて変更する。その切り換えがリニア特性から折れ線特性への切り換えであれば、より大きな増幅率を光検出器１５に設定し、反対にその切り換えが折れ線特性からリニア特性への切り換えであれば、より小さな増幅率を光検出器１５に設定する。そのようにして、光検出器１５から増幅器１６に入力される入力信号のレベルを調整する。

そのような調整を行うことにより、リニア特性から折れ線特性への切り換えであれば、より大きな増幅率で光検出器１５に入力信号を増幅させるため、図４に示すように、その増幅をより大きく行わせることによって加減算回路２３の出力信号は実線で示すＣから破線で示すＤに変化させることができる。この結果、例えばリニア特性では試料１１からの検出信号０〜Ｖ１の範囲によって０〜Ｖ０の出力電圧範囲が得られていたのであれば、折れ線特性に切り換えても、試料１１からの検出信号０〜Ｖ１の範囲によって０〜Ｖ０の出力電圧範囲を得られるようにすることができる。折れ線特性になることで暗部におけるＳ／Ｎは向上する。そのようにして、出力ダイナミックレンジを等しく維持させることにより、特性の切り換えによって全体的に輝度が変化したような印象を見る人に与えるようなことは確実に回避される。これは、切り換え前に適切な画像が得られるように輝度が調整されていた場合には、切り換え後も適切な画像が得られることを意味する。従って、オペレータは特性の切り換え後も適切な画像で観察を続けることができることになる。輝度調整は最適、且つ自動的に行われる形となることから、オペレータがそのような調整等を行う必要性は回避されて、操作性や利便性は向上することとなる。これらは、折れ線からリニア特性への切り換えの際も同様である。

以降は、特性の切り換えに伴う光検出器１５に設定する増幅率の変更について具体的に説明する。その増幅率については以降「増倍率」と呼ぶことにする。
図５は、光検出器１５として採用されたＰＭＴのゲイン特性を説明する図である。ＰＭＴへの印加高電圧（ＨＶ）値に対するゲイン（増倍率）の関係を示している。

ＰＭＴのゲイン特性は次式で表される。
Ｇ＝ｋ×（ＨＶ）^a ・・・（１）
ただし、Ｇ：ＰＭＴのゲイン（増倍率）、ｋ、ａ：ＰＭＴ固有の定数、である。

（１）式中のｋ、ａはＰＭＴ固有の値であり、個別にばらつきが存在する。このことから、適切な増倍率をＰＭＴに確実に設定するには定数ｋ、ａの実際の値を正確に特定する必要がある。それら定数ｋ、ａの値は、例えば以下のようにして特定する。

まず、例えば鏡面などの比較的に均一なものを試料１１として観察し、第１のリニア増幅器２０のみを用いる形で複数点の輝度（出力信号）ＩとＨＶ値（増倍率）の組み合わせを得る。例えば３点で、具体的には出力ダイナミックレンジの３０％、６０％、９０％で輝度ＩとＨＶ値の組み合わせ（Ｉ₃₀，ＨＶ₃₀）、（Ｉ₆₀，ＨＶ₆₀）、（Ｉ₉₀，ＨＶ₉₀）が得られたとする。これらの点で得られたＨＶ値、増倍率を（１）式に代入し、定数ｋ、ａの値を求める。それにより、試料１１の反射率等に係わらず、出力ダイナミックレンジを合わせた特性の切り換えを行えるようにしている。

そのようにして特定される定数ｋ、ａの値は、例えば顕微鏡本体１別に、コンピュータ２に保存すべき制御用データとして予め用意される。そのコンピュータ２にインストールされるプログラムは、そのような制御用データを用いて、特性の切り換えに応じたＰＭＴの増倍率の変更を行う顕微鏡制御回路１８を実現させる。

図６は、顕微鏡制御回路１８によって行われるリニア→折れ線への特性切換処理のフローチャートである。次に図６を参照して、その特性切換処理について詳細に説明する。その切換処理は、不図示の入力手段を介してオペレータにより、リニア特性から折れ線特性への特性の切り換えが指示された場合に実行される。

先ず、ステップＳ１では、現在、増幅器１６から出力される出力信号の最高レベル（図中、「最高輝度値」と表記）を取得する。続くステップＳ２では、現在、光検出器（ＰＭＴ）１５に設定させている印加高電圧（ＨＶ）値を取得する。その次に移行するステップＳ３では、ステップＳ２で取得したＨＶ値から（１）式により現在の増倍率（ゲイン）を算出し、ステップＳ１で取得した出力信号の最高レベルが得られる入力信号の最高レベルを算出する。

ステップＳ３に続くステップＳ４では、折れ線特性の理論式から、その特性、及びステップＳ３で最高レベルを算出した入力信号で得られる出力信号の最高レベルを算出する。その算出後はステップＳ５に移行して、ステップＳ１で算出した出力信号の最高レベルを折れ線特性で得るために必要な入力信号の最高レベルを算出する。ステップＳ６にはその後に移行する。

図３に示すように、入力信号がＶ１となると第１のリニア増幅器２０の出力信号はＶ０となって飽和するのであれば、上記ステップＳ３では入力信号の最高レベルとしてＶ１が算出されることになる。折れ線特性は、図３に示すように、オフセット電圧の点を通り、その点からは（Ｇ１−Ｇ２）の傾きを持つものである。そのＶ０を出力信号の最高レベルとしてステップＳ１で取得していたのであれば、その折れ線特性から出力信号がＶ０となる入力信号のレベル（図３ではＶ２）を特定することができる。ステップＳ５で算出する入力信号の最高レベルとは例えばそのレベルのことである。ステップＳ４で算出する出力信号の最高レベルは、例えば入力信号がＶ１のときのものである。ここでは、そのときの出力信号のレベルをＶｆと表記することにする。

ステップＳ６では、ステップＳ３、Ｓ５で算出した入力信号の最高レベルの比から光検出器（ＰＭＴ）１５に新たに設定すべき増倍率（ゲイン）を算出する。次のステップＳ７では、その増倍率を得るためのＨＶ値を算出する。以降は、増幅器１６の加減算回路２３への切換信号を変化させてリニア特性から折れ線特性に切り換えてから（ステップＳ８）、そのＨＶ値を光検出器（ＰＭＴ）１５に設定し（ステップＳ９）、その後に一連の処理を終了する。

入力信号がＶ１のときに出力信号がＶ０となるリニア特性を折れ線特性に単に切り換えると、その入力信号のときに出力信号はＶｆとなることにより、全体的に輝度が低下することになる。このため、それを回避するためには、出力信号をＶｆからＶ０へ上げる必要がある。それは、リニア特性ではＶ１となる入力信号を折れ線特性ではＶ２とさせることで実現させることができる。

ステップＳ３で求めた増倍率は、そのリニア特性で光検出器１５に設定されているものである。その増倍率をＧ_V1、折れ線特性で設定すべき増倍率をＧ_V2とそれぞれ表記すると、Ｇ_V2＝Ｇ_V1×Ｖ２／Ｖ１という大小関係とさせることにより、リニア特性ではＶ１となる入力信号は折れ線特性ではＶ２となる。ステップＳ６で求める増倍率は、そのようにして得られるＧ_V2であり、ステップＳ７で求まるＨＶ値は、そのＧ_V2を（１）式に代入して算出されるＨＶ値である。

そのようにして得られるＨＶ値を光検出器（ＰＭＴ）１５に新たに設定することにより、リニア特性から折れ線特性に切り換えても、入力信号に対する出力ダイナミックレンジは等しく維持される（図４中のＤ）。このため、特性の切り換えに伴い、全体的に輝度が変化するという印象を人に与えるようなことは確実に回避される。

図７は、顕微鏡制御回路１８によって行われる折れ線→リニアへの特性切換処理のフローチャートである。次に図７を参照して、その特性切換処理について詳細に説明する。その切換処理は、不図示の入力手段を介してオペレータにより、折れ線特性からリニア特性への特性の切り換えが指示された場合に実行される。図６に示す切換処理と内容が同じ処理ステップには同一の符号を付して説明を省略する。

図７に示す特性切換処理では、ステップＳ２で現在の印加高電圧（ＨＶ）値を取得すると、次にステップＳ１０に移行して、そのＨＶ値から（１）式により現在の増倍率（ゲイン：Ｇ_V2）を算出し、ステップＳ１で取得した出力信号の最高レベルが得られる入力信号の最高レベルを算出する。ステップＳ１１にはその後に移行する。

ステップＳ１１では、リニア特性（第１のリニア増幅器２０）の伝達関数から、ステップＳ１０で最高レベルを算出した入力信号で得られる出力信号の最高レベルを算出する。その算出後はステップＳ１２に移行して、算出した最高レベルが飽和しているか否か判定する。その最高レベルがＶ０を越えていない場合、判定はＮＯとなり、ステップＳ１で算出した出力信号の最高レベルをリニア特性で得るために必要な入力信号の最高レベルをステップＳ１３で算出してからステップＳ１５に移行する。そうでない場合には、即ち算出した最高レベルがＶ０を越えている場合には、判定はＹＥＳとなり、リニア特性で出力信号の最高レベルが得られる入力信号の最高レベルをステップＳ１４で算出してからそのステップＳ１５に移行する。

ステップＳ１５では、ステップＳ１０で算出した入力信号の最高レベル、及びステップＳ１３、或いはＳ１４で算出した入力信号の最高レベルの比から光検出器（ＰＭＴ）１５に新たに設定すべき増倍率（ゲイン）を算出する。次のステップＳ１６では、その増倍率を得るためのＨＶ値を算出する。以降は、そのＨＶ値を光検出器（ＰＭＴ）１５に設定し（ステップＳ１７）、増幅器１６の加減算回路２３への切換信号を変化させて折れ線特性からリニア特性に切り換えてから（ステップＳ１８）、一連の処理を終了する。

入力信号がＶ２のときに出力信号がＶ０となる折れ線特性をリニア特性に単に切り換えると、その入力信号のときに出力信号は著しく飽和してしまうことになる。このため、それを回避するためには、折れ線特性ではＶ２となる入力信号をリニア特性ではＶ１とさせれば良い。

ステップＳ１０で求めたＧ_V2は、折れ線特性で光検出器１５に設定されているものである。リニア特性で新たに設定すべきＧ_V1は、そのＧ_V2を用いてＧ_V1＝Ｇ_V2×Ｖ１／Ｖ２で表される。ステップＳ１５で求める増倍率は、そのようにして得られるＧ_V1であり、ステップＳ１６で求まるＨＶ値は、そのＧ_V1を（１）式に代入して算出されるＨＶ値である。

そのようにして得られるＨＶ値を光検出器（ＰＭＴ）１５に新たに設定することにより、折れ線特性からリニア特性に切り換えても、入力信号に対する出力ダイナミックレンジは等しく維持される。このため、特性の切り換えに伴い、全体的に輝度が変化するという印象を人に与えるようなことは確実に回避される。

次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。
上記第１の実施の形態では、特性の切り換えによる観察条件の変更に自動的に対応するようにしている。これに対し、第２の実施の形態は、対物レンズの切り換えによる観察条件の変更に対し更に自動的に対応するようにしたものである。

第２の実施の形態を適用した走査型共焦点レーザー顕微鏡の構成は、基本的に第１の実施の形態におけるそれと同じである。動作も大部分は同じか、或いは基本的に同じである。このことから、第１の実施の形態で付した符号をそのまま用いて、第１の実施の形態から異なる部分についてのみ説明する。

対物レンズ１０に入る光の量は、その倍率によって変化する。その光量、つまり画像の輝度は、試料１１が同じであれば、図８に示すように、倍率が低くなるほど大きくなる。このため、対物レンズ１０を切り換えると、その切り換えに伴って画像の明るさが全体的に変化する。第２の実施の形態では、光検出器（ＰＭＴ）１５の増倍率を調整して、その変化に自動的に対応することにより、対物レンズ１０を切り換えた後も適切な画像が継続して得られるようにしている。

図８に示す、倍率が異なる対物レンズ１０間の相対的な輝度の関係は、５倍の対物レンズ１０の輝度を基準（１００）として、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍の各対物レンズ１０の輝度を表したものである。その関係は、予め制御用データとして用意しても良いが、個別に設定しても良い。個別の設定は、例えば以下のようにして行うようにすれば良い。

先ず、試料１１として鏡面などのサンプルを５倍の対物レンズ１０で観察し、輝度をダイナミックレンジ一杯（１００％）に合わせる。次に例えば１０倍の対物レンズ１０に交換し、ピントがずれていない状態で画像輝度を張設することなく最大の輝度レベルを取得させる。他の倍率の対物レンズ１０でも同様に最大の輝度レベルを取得させる。そのようにして、図８に示すような倍率が異なる対物レンズ１０間の相対的な輝度の関係を正確に示すデータを取得させることができる。

図９は、顕微鏡制御回路１８によって行われる対物切り換え処理のフローチャートである。次に図９を参照して、その切り換え処理について詳細に説明する。その切り換え処理は、不図示の入力手段を介してオペレータにより、対物レンズ１０の切り換えが指示された場合に実行される。

対物レンズ１０の切り換えは、上述したように、所望の倍率を指定することで行われる。所望の倍率をオペレータが指定して対物レンズ１０の切り換えを指示すると、顕微鏡制御回路１８は、その倍率の対物レンズ１０への切り換えをＺ軸移動制御回路１７に対して指示する。それにより、レボルバ９に搭載された対物レンズ１０のなかで指定の倍率を持つ対物レンズ１０が観察光路中に移動する形で切り換えが行われる。

先ず、ステップＳ２１では、現在、光検出器（ＰＭＴ）１５に設定させている印加高電圧（ＨＶ）値を取得する。次のステップＳ２２は、そのＨＶ値を用いて（１）式により現在の増倍率（ゲイン）を算出する。その次に移行するステップＳ２３では、切り換え前後の対物レンズ１０の相対的な輝度関係から、切り換え後に光検出器（ＰＭＴ）１５に新たに設定すべき増倍率を算出する。その後はステップＳ２４に移行する。

ステップＳ２４では、算出した増倍率を（１）式に代入して、その増倍率を得るためのＨＶ値を算出する。続くステップＳ２５では、倍率の変化方向によって飽和を防ぐために手順を変えるための判定を行う。それにより、低倍→高倍であれば、ステップＳ２６で対物レンズ１０の切り換えをＺ軸移動制御回路１７に指示し、次にステップＳ２７において、算出したＨＶ値を光検出器（ＰＭＴ）１５に新たに設定してから、一連の処理を終了する。高倍→低倍であれば、ステップＳ２７において、算出したＨＶ値を光検出器（ＰＭＴ）１５に新たに設定し、次のステップＳ２６で対物レンズ１０の切り換えをＺ軸移動制御回路１７に指示してから、一連の処理を終了する。

図８に示すように、例えば５倍の対物レンズ１０から２０倍の対物レンズ１０に切り換えると、輝度レベルは６０％に低下する。このため、見た目の輝度を同じにするには、２０倍の対物レンズ１０のときの増倍率Ｇ₂₀を５倍の対物レンズ１０のときの増倍率Ｇ₅に対して１／０．６倍にすれば良いことになる。従って、
Ｇ₂₀＝Ｇ₅×（１／０．６）＝ｋ×（ＨＶ₂₀）^a
から対物レンズ１０の切り換えによって設定すべきＨＶ値（ＨＶ₂₀）を求めることができる。この例では、Ｇ₅はステップＳ２２、Ｇ₂₀はステップＳ２３、ＨＶ₂₀はステップＳ２４でそれぞれ算出される。

一方、例えば１００倍の対物レンズ１０から１０倍の対物レンズ１０に切り換える場合には、図８に示すように、輝度レベルは０．８／０．２倍となって明るくなる。それによる飽和を回避するために、１０倍の対物レンズ１０のときの増倍率Ｇ₁₀を１００倍の対物レンズ１０のときの増倍率Ｇ₁₀₀に対して０．２／０．８倍にすれば良いことになる。よって、この場合の対物レンズ１０の切り換えによって設定すべきＨＶ値（ＨＶ₁₀）は、
Ｇ₁₀＝Ｇ₁₀₀×（０．２／０．８）＝ｋ×（ＨＶ₁₀）^a
から求められる。

このように、任意の対物レンズ１０間の切り換えに自動的に対応して、それらの間の相対的な輝度差を考慮して切り換え後の光検出器（ＰＭＴ）１５に新たに設定すべき増倍率を決定し、その増倍率が得られるＨＶ値を求めて光検出器（ＰＭＴ）１５に設定する。このため、対物レンズ１０間の切り換えに合わせて最適な輝度調整を自動的に行った形となって、その切り換えに伴う画像の見た目の変動は回避される。対物レンズ１０の切り換えを行っても画像の見た目の明るさはほぼ一定に維持される。それにより、オペレータにとっては、対物レンズ１０を切り換えさせた後も最適な状態で観察を続けて行えるため、操作性や利便性が著しく向上することになる。対物レンズ１０間の同焦補正も併せて行うようにした場合には、対物レンズ１０の切り換えに応じた輝度調整の他に、焦点位置の再調整を行う必要性も回避できるようになることから、更に操作性や利便性を向上させることができる。

以上、本発明を適用した各実施の形態を説明してきたが、本発明が適用される光検出回路および該光検出回路を備えた走査型共焦点顕微鏡は、その機能が実行されるのであれば、上述の実施の形態に限定されることはなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の構成または動作を採用することができる。

本発明を適用した走査型共焦点顕微鏡の構成を示すブロック図である。本発明を適用した光検出回路の構成を示す図である。暗部のＳ／Ｎの低下を招かずに入力ダイナミックレンジを拡大させる過程を説明するための図である。特性の切り換えに伴う出力信号レベルの変化、及びその変化への対応方法を説明する図である。光検出器１５として採用されたＰＭＴのゲイン特性を説明する図である。顕微鏡制御回路１８によって行われるリニア→折れ線への特性切換処理のフローチャートである。顕微鏡制御回路１８によって行われる折れ線→リニアへの特性切換処理のフローチャートである。倍率が異なる対物レンズ１０間の相対的な輝度の関係を示す図である。顕微鏡制御回路１８によって行われる対物切り換え処理のフローチャートである。従来の走査型共焦点顕微鏡の概略的な構成を示す図である。対物レンズ１０７と試料１０８の相対位置（Ｚ）と光検出器１１１の出力（Ｉ）の関係を示す図である。

符号の説明

１顕微鏡本体
２コンピュータ
３モニタ
６レーザー光源
７ミラー
８ハーフミラー
９レボルバ
１０対物レンズ
１１試料
１２ステージ
１３レンズ
１４ピンホール板
１５光検出器
１６増幅器
１７Ｚ軸移動制御回路
１８顕微鏡制御回路
１９画像入力回路
２０第１のリニア増幅器
２１第２のリニア増幅器
２２半波整流回路
２３加減算回路

Claims

試料からの光信号を増幅して検出する光検出手段と、
前記光検出手段からの出力信号を所定の増幅率で増幅する第１の増幅手段と、
前記第１の増幅手段の増幅率より小さい増幅率で前記光検出手段からの出力信号を増幅して出力する１つ以上の第２の増幅手段と、
前記第２の増幅手段からの出力信号にオフセットを与えるオフセット手段と、
前記オフセット手段によりオフセットが与えられる前記第２の増幅手段からの出力信号を整流する整流手段と、
前記オフセット・整流された第２の増幅手段からの出力信号と前記第１の増幅手段からの出力信号を用いた加算、及び減算の一方を行う加減算手段と、
前記第１の増幅手段からの出力信号、並びに前記加減算手段が前記加算、及び減算の一方を行って得られる出力信号の何れか一方を選択して出力するための切換手段と、
前記切換手段による出力信号の切り換えに応じて前記光検出手段の増幅率を変更する増幅率変更手段と、
を備えたことを特徴とする光検出回路。
前記増幅率変更手段は、前記切換手段による出力信号の切り換えの前後における出力信号の信号レベルの予想される変化量、及び前記光検出手段のゲイン特性を基に、該光検出手段の増幅率を変更する、ことを特徴とする請求項１に記載の光検出回路。
前記増幅率変更手段は、前記切換手段によって出力される出力信号の、顕微鏡で行われる対物レンズの切り換えの前後における信号レベルの予想される変化量、及び前記光検出手段のゲイン特性を基に、該光検出手段の増幅率を変更できる、ことを特徴とする請求項１または２に記載の光検出回路。
請求項１乃至３の何れか１項に記載の光検出回路を備えたことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。