JP2007206388A - 走査型共焦点レーザ顕微鏡、及びその制御方法、並びにプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】所望の明るさである良質な顕微鏡画像が容易な操作で得られるようにする。
【解決手段】ＣＰＵ１２は、試料１の顕微鏡画像の明るさについての指示を取得し、レーザ光源９から試料１へと照射するレーザ光の強度を当該明るさについての指示に基づいて調整すると共に、当該レーザ光を照射した試料１からの反射光を検出する光検出器７の検出感度を当該明るさについての指示に基づいて調整する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、走査型共焦点レーザ顕微鏡の技術に関し、特に、当該顕微鏡で得られる画像の画質を向上させる技術に関する。

走査型共焦点レーザ顕微鏡による顕微鏡画像取得の基本的な動作を説明する。
レーザ光源より発せられるレーザ光は、ミラーで光路を曲げられた後に対物レンズを通って試料を照射する。試料で反射したレーザ光は対物レンズを通過した後にハーフミラーを介して集光される。この集光位置にはピンホールが配されており、ピンホールの通過したレーザ光の強度を光検出器が検出する。ここで、試料に設定される測定領域をレーザ光により二次元走査し、このときに光検出器で検出される走査位置毎の反射光の強度を画素毎の輝度に対応付けることにより、当該測定領域の二次元画像を得ることができる。ここで、試料における対物レンズの焦点位置以外からの反射光はピンホールの位置で集光しないため、試料における焦点位置のみの画像（共焦点画像）を得ることができる。

ここで、焦点位置をＺ軸方向（光軸方向）に移動させながら共焦点画像を順次取得し、取得した複数の画像の最大輝度を合成すると、測定領域の全域にわたって合焦している画像（「エクステンド画像」などとも称されている）を得ることができる。

このようにして得られる顕微鏡画像の明るさを調整する技術として、例えば特許文献１及び特許文献２に開示されている技術が知られている。
特許文献１に開示されている走査型共焦点レーザ顕微鏡には、試料標本へ照射するレーザ光の光路に調光フィルタが設けられており、更に、その調光フィルタを切り換える手段が備えられている。このフィルタの切り換えを行うと、画像の明るさを切り換えることができる。

ここで図１７について説明する。同図は、上記の従来技術における調光フィルタの選択の様子を示している。
同図に示したグラフにおいて、横軸は、光検出器として使用される光電子増倍管への印加電圧（以下、「増倍管印加電圧」と称することとする）を示しており、この数値が大きいほど光電子増倍管の増幅度が高くなって光検出器の感度が高くなる。一方、縦軸は、最大出力を１００％としたときのレーザ光源の出力を示しており、これはすなわち、試料標本へ照射するレーザ光の強度（以下、「レーザ光照射強度」と称することとする）を表している。また、同図のグラフにおいて、曲線毎に付されている「１５」から「８０」までの各数値は、試料標本の発光率、すなわち、同一強度のレーザ光が照射された試料標本の発光量を表している。つまり、この各曲線は、試料標本の発光率を一定にした条件の下で、光電子増倍管から一定の出力信号が得られるようになるレーザ光照射強度と増倍管印加電圧との関係を表している。

ここで、調光フィルタの切り換えを行うと、レーザ光照射強度は、同図に階段状の直線で示されているように、不連続に切り替わる。そのため、得られる顕微鏡画像の明るさも調光フィルタの切り換えによって不連続に変化してしまう。上記の文献には、この不連続な変化を解消するための方策として、増倍管印加電圧を制御してその増幅度を変化させることや、ピンホールの径を変化させて光電子増倍管での受光量を調整することが開示されている。

また、上記の文献では、顕微鏡画像の明るさ調整のための調整動作モードとして、試料標本に対する損傷を少なくすることを重視するサンプル損傷防止優先モードと、顕微鏡画像に含まれるノイズの低減を重視するノイズ防止優先モードとを設けることが開示されている。

図１８は、サンプル損傷防止優先モードにおける調光フィルタの選択と増倍管印加電圧の制御による明るさの調整の様子を示している。なお、同図における縦軸及び横軸並びに同図のグラフに表されている各曲線は、いずれも図１７におけるものと同様である。

このモードでは、レーザ光照射強度を極力弱くするために、増倍管印加電圧を高くして光電子増倍管の増幅度を上げることによって顕微鏡画像の明るさを確保するようにする。同図の例では、レーザ光照射強度を弱くする代わりに、まず、増倍管印加電圧を０ボルトから９００ボルトまで高める。その後、顕微鏡画像を更に明るくすることを望むのであれば、調光フィルタを切り換えてレーザ光照射強度を徐々に高めつつ、増倍管印加電圧を７００ボルトから９００ボルト程度の範囲で制御して顕微鏡画像の明るさの変化が連続的なものとなるようにする。このようにして顕微鏡画像の明るさを調整する。

次に図１９について説明する。同図は、ノイズ防止優先モードにおける調光フィルタの選択と増倍管印加電圧の制御による明るさの調整の様子を示している。なお、同図における縦軸及び横軸並びに同図のグラフに表されている各曲線は、いずれも図１７におけるものと同様である。

このモードでは、増倍管印加電圧を低くして光電子増倍管の増幅度を下げることによって光電子増倍管で発生する顕微鏡画像上のノイズを少なくするために、レーザ光照射強度を高めることによって顕微鏡画像の明るさを確保するようにする。同図の例では、光電子増倍管の増幅度を下げるために、まず、増倍管印加電圧を０ボルトから５０ボルト程度まで高めたところで調光フィルタを切り換えてレーザ光照射強度を高める。その後、顕微鏡画像を更に明るくすることを望むのであれば、増倍管印加電圧を３０ボルトから８０ボルト程度まで高めるようにして顕微鏡画像の明るさの変化が連続的なものとなるようにし、その後は、調光フィルタを更に切り換えてレーザ光照射強度を更に高める。このようにして顕微鏡画像の明るさを調整する。

この他、上記の文献には、調光フィルタの選択制御と光電子増倍管の増幅度（すなわち増倍管印加電圧）の制御との組み合わせによる顕微鏡画像の明るさ調整を自動で行うこと、更には、この両者の制御では、適正な明るさを得ることができない場合には、ピンホールの径を自動若しくは手動により変更して明るさの調整を行うこと、などが開示されている。

一方、特許文献２には、走査型共焦点レーザ顕微鏡で前述したエクステンド画像を得る際において、レーザ光を照射する試料の反射率が、測定領域内の各部で異なる場合に、得られるエクステンド画像に、明るすぎる領域や暗すぎる領域が生じてしまうことを防止する技術が開示されている。この技術は、焦点位置をＺ軸方向に移動させている際に、焦点位置がＺ軸方向のある位置に到達したとき光検出器の感度を変更するようにして、各部の明るさが均一なエクステンド画像を得るようにするというものである。

ところで、試料を詳細に観察するために、倍率の異なる対物レンズを複数備えておくと共に、これらを切り替える切り替え器を備えておき、対物レンズを切り替えることで、異なる倍率で試料を観察できるように構成されている走査型共焦点レーザ顕微鏡は従来から広く知られている。このような顕微鏡において、対物レンズを切り替えると、開口数等が対物レンズ毎に異なっているため、得られる顕微鏡画像の明るさも変化してしまう。このような、対物レンズの違いに起因する画像の明るさの違いを軽減するために、従来は、対物レンズの切り替えに応じて光検出器の感度を変更して画像の明るさを調整していた。
特開平９−１３８３５３号公報 特開平８−２９２１９８号公報

上掲した特許文献１に開示されている技術では、調光フィルタの選択制御と光電子増倍管の増幅度の制御との組み合わせにより顕微鏡画像の明るさ調整を行うため、制御の手法によっては不必要に増幅度を上げてしまうことがある。また、光検出器で検出される検出信号にはノイズ成分も含まれているため、光電子増倍管の増幅度を変更するとノイズ成分も増幅してしまうこととなり、検出信号のＳ／Ｎ（信号対ノイズ比）が劣化してしまう。更に、ピンホール径の変更を行うと、合焦位置から離れた部分からの光も集光してしまうために、得られる顕微鏡画像の品質が劣化してしまう。

また、上掲した特許文献２に開示されている技術では、Ｚ方向に異なる反射率を有する試料のエクステンド画像を取得する際に、異なる反射率に応じて光検出器の感度の変更を行うＺ軸方向の位置と、変更する光検出器の感度を予め設定し、エクステンド画像を取得するとき、予め設定した感度のみを変更し画像を取得するようにしている。そのため、反射率の低い部分では、光検出器の感度が大きく上げられ、その結果、ノイズ成分も大きく増幅されてしまい、検出信号のＳ／Ｎを劣化させてしまうことがある。

本発明は上述した問題に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、所望の明るさである良質な顕微鏡画像が容易な操作で得られるようにすることである。

本発明の態様のひとつである走査型共焦点レーザ顕微鏡は、試料の顕微鏡画像の明るさについての指示を取得する明るさ指示取得手段と、前記試料へ照射するレーザ光の強度を前記明るさ指示取得手段からの指示に基づいて調整するレーザ光強度調整手段と、前記レーザ光を照射した前記試料からの反射光を検出する光検出器の検出感度を前記明るさ指示取得手段からの指示に基づいて調整する検出感度調整手段と、を有することを特徴とするものであり、この特徴によって前述した課題を解決する。

なお、上述した本発明に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記検出感度調整手段は、前記レーザ光強度調整手段により前記レーザ光の強度が最大に調整されても前記顕微鏡画像の明るさが前記明るさ指示取得手段で取得された明るさについての指示に係るものに満たない場合に、前記光検出器の検出感度を高める調整を行うように構成してもよい。

なお、このとき、前記レーザ光の強度が最大に調整されても前記顕微鏡画像の明るさが前記明るさ指示取得手段で取得された明るさについての指示に係るものに満たない場合に、前記光検出器の検出感度の調整を行うか否かの確認指示を取得する確認指示取得手段を更に有し、前記検出感度調整手段は、前記光検出器の検出感度の調整を行う旨の確認指示を取得した場合に、当該光検出器の検出感度を調整する、ように構成してもよい。

また、前述した本発明に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記顕微鏡画像の平均輝度を算出する平均輝度算出手段を更に有し、前記レーザ光強度調整手段及び前記検出感度調整手段は、前記平均輝度算出手段で算出される平均輝度が前記明るさについての指示に適合するように前記レーザ光の強度調整及び前記光検出器の検出感度調整を各々行う、ように構成してもよい。

また、前述した本発明に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記顕微鏡画像の最大輝度を取得する最大輝度取得手段を更に有し、前記レーザ光強度調整手段及び前記検出感度調整手段は、前記最大輝度が前記明るさについての指示に適合するように前記レーザ光の強度調整及び前記光検出器の検出感度の調整を各々行う、ように構成してもよい。

また、前述した本発明に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記レーザ光強度の上限の設定を取得する上限設定取得手段を更に有し、前記レーザ光強度調整手段は、前記上限設定取得手段が取得する上限の範囲内で前記強度を調整する、ように構成してもよい。

また、前述した本発明に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記顕微鏡画像の取得に用いられる対物レンズの違いに応じて、前記レーザ光の強度を補正する補正手段を更に有するように構成してもよい。

また、前述した本発明に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記顕微鏡画像の取得に用いられる対物レンズと前記試料との相対位置を変化させる変動手段と、前記顕微鏡画像の明るさの指示を、前記相対位置に対応付けて複数記憶しておく記憶手段と、を更に有し、前記レーザ光強度調整手段及び前記検出感度調整手段は、前記変動手段によって前記相対位置が変化したときには、当該変化後の相対位置に対応付けられて前記記憶手段に記憶されている前記明るさの指示に基づいて、前記レーザ光の強度調整及び前記光検出器の検出感度調整を各々行う、ように構成してもよい。

また、本発明の別の態様のひとつである走査型共焦点レーザ顕微鏡の制御方法は、試料の顕微鏡画像の明るさについての指示を取得し、前記試料へ照射するレーザ光の強度を前記明るさについての指示に基づいて調整し、前記レーザ光を照射した前記試料からの反射光を検出する光検出器の検出感度を前記明るさについての指示に基づいて調整する、ことを特徴とするものであり、この特徴によって前述した課題を解決する。

また、走査型共焦点レーザ顕微鏡の制御を情報処理装置に行わせるためのプログラムであって、試料の顕微鏡画像の明るさについての指示を取得する処理と、前記試料へ照射するレーザ光の強度を前記明るさについての指示に基づいて調整する処理と、前記レーザ光を照射した前記試料からの反射光を検出する光検出器の検出感度を前記明るさについての指示に基づいて調整する処理と、を情報処理装置に行わせるためのプログラムも本発明に係るものであり、情報処理装置で当該プログラムを実行させることにより、前述した課題が解決される。

以上のようにすることにより、本発明によれば、所望の明るさである良質な顕微鏡画像を容易な操作で得ることができるという効果を奏する。

以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
まず図１について説明する。同図は、本発明を実施する走査型共焦点レーザ顕微鏡（以下、「本装置」と称することとする）の構成を示している。

レーザ光源９より発せられるレーザ光はミラー８で反射した後、対物レンズ２を介して試料１へ照射される。このレーザ光源９にはレーザ光源制御部１０が接続されている。
レーザ光源制御部１０はレーザ光源９を制御してレーザ光の強度を変化させることができる。また、ミラー８を二次元に振ることでレーザ光源９から発せられるレーザ光を試料１上で二次元走査させる。

試料１で反射したレーザ光はハーフミラー６で反射した後に光検出器７で集光される。この集光位置にはピンホール（不図示）が配されており、このピンホールの通過したレーザ光の強度を光検出器７が検出する。なお、光検出器７の感度はゲイン調整部１６で調整することができる。

対物レンズ切り替え器３には対物レンズ２が複数種類取り付けられており、レーザ光の光路に挿入される対物レンズ２を切り替えることができる。
Ｚ位置検出器４は、Ｚ軸方向（光軸方向）における試料１に対する対物レンズ２の相対的な位置を検出する。Ｚ位置制御部５は、当該位置の検出結果を取得すると共に、対物レンズ２をＺ軸方向（光軸方向）に上下動させて当該位置の制御を行う。

顕微鏡制御部１１は、光検出器７から出力される信号を変換して、試料１の二次元画像（顕微鏡画像）を表す映像信号を生成する。更に、顕微鏡制御部１１は、レーザ光源制御部１０、光検出器７、Ｚ位置制御部５等の動作を制御して各種の情報の授受を行う。顕微鏡制御部１１から出力される映像信号はゲイン調整部１６を経て画像メモリ２１へと送られて記憶される。

ＣＰＵ（中央演算装置）１２は、所定の制御プログラムを実行することによって本装置全体の動作を管理し制御する情報処理装置である。なお、ＣＰＵ１２は、当該制御プログラムの実行により明るさ調整部としても機能する。明るさ調整部は、レーザ光源制御部１０とゲイン調整部１６とを制御して、レーザ光源９で発生させるレーザ光の強度（以下、「レーザ強度」と称することとする）と光検出器７の感度（以下、「検出感度」と称することとする）とを、本装置の使用者による明るさの調整指示の内容に基づいて調整する。当該調整後のレーザ強度の設定値はレーザ強度メモリ１４に記憶され、当該調整後の検出感度の設定値はゲインメモリ１７に記憶される。

ここで図２について説明する。同図は明るさ調整画面の例を示している。この画面はＣＰＵ１２が表示装置２７に表示させる画面である。
この画面には明るさ調整スライドバー２８が表されている。本装置の使用者がマウス装置等の操作部（図１には不図示）を操作すると、その操作に応じて明るさ調整スライドバー２８に表されている指針が左右に移動して顕微鏡画像の明るさの設定が行われる。なお、この指針を左端に位置させたときには、明るさの設定値として「０．０」の値が設定され、指針を右端に位置させたときには、明るさの設定値として「１００．０」の値が設定される。また、明るさ調整スライドバー２８による設定値と実際の明るさとは、図３に示すように直線的な関係となるようにする。

本実施形態では、この明るさ調整スライドバー２８によって設定された明るさの設定入力値が、「０．０」から「５０．０」までの値（この範囲の設定値を「前半の設定値」と称することとする）である場合には、この設定入力値をレーザ強度についての設定の入力として扱い、「５０．０」から「１００．０」までの値（この範囲の設定値を「後半の設定値」と称することとする）である場合には、この設定入力値を検出感度についての設定の入力として扱うようにする。つまり、図４に示すように、明るさ調整スライドバー２８における「５０．０」の設定入力値の位置で二分し、この位置よりも前半の値が設定入力された場合には検出感度の設定は所定の初期値のまま（最小感度のまま）でレーザ強度の設定を行い、この位置よりも後半の値が設定入力された場合にはレーザ強度を最大にした状態で検出感度の設定を行う。

なお、図１においては、本装置の使用者により設定されるレーザ強度の設定値を取得するレーザ強度入力部１５と、本装置の使用者により設定される検出感度の設定値を取得する検出感度入力部１８とが、明るさ調整スライドバー２８を用いて設定された値を取得し、その取得値を、レーザ強度メモリ１４及びゲインメモリ１７に記憶させておく。

明るさ調整スライドバー２８による設定値からレーザ強度若しくは検出感度の真の設定値への対応付けは、図５Ａ及び図５Ｂにそれぞれ例示するような対応関係を有する変換テーブルの参照によって行うようにする。図１においては、これらの変換テーブルが、設定値−レーザ強度テーブル２５及び設定値−検出感度テーブル２４として予め用意されている。なお、この変換テーブルの数値は、明るさ調整スライドバー２８による設定入力値と実際の明るさとが、図３に示すような、直線的な関係となるように配慮して定めておく。

ここで図６について説明する。同図は、上述した明るさ調整部によって行われる制御処理の詳細の第一の例をフローチャートで示したものである。なお、この処理は、例えば、使用者が本装置を操作して、明るさ調整スライドバー２８により顕微鏡画像の明るさの設定の入力を行ったことが検出されると開始される。

まず、Ｓ１０１において、予め定められているレーザ強度及び検出感度の初期値をレーザ光源制御部１０とゲイン調整部１６に設定しておく処理が行われる。
続くＳ１０２では、予め定められているレーザ強度及び検出感度についての設定値の最大値を各々レーザ強度最大値メモリ１９及びゲイン最大値メモリ２０に記憶させておく処理が行われる。なお、図４の例においては、レーザ強度についての設定値の最大値は「５０．０」と定められ、検出感度についての設定値の最大値は「１００．０」と定められる。

Ｓ１０３では、使用者が明るさ調整スライドバー２８を利用して入力した顕微鏡画像の明るさについての指示を取得する処理が行われる。
ここで、Ｓ１０４において、前ステップで取得した入力値がレーザ強度最大値メモリ１９に記憶されている値以下であるか否かを判定する処理が行われる。ここで、入力値がレーザ強度の最大値以下と判定されたとき（判定結果がＹｅｓのとき）にはＳ１０５に、また、入力値がレーザ強度の最大値よりも大きいと判定されたとき（判定結果がＮｏのとき）にはＳ１０７に、それぞれ処理を進める。

Ｓ１０５では、入力値からレーザ強度の設定値への変換処理が行われる。すなわち、設定値−レーザ強度テーブル２５を参照し、Ｓ１０３の処理によって取得した入力値に対応付けられているレーザ強度設定値を設定値−レーザ強度テーブル２５から取得する処理が行われる。

Ｓ１０６では、Ｓ１０５の処理によって得られたレーザ強度設定値をレーザ光源制御部１０へ送付し、レーザ光源９より発せられるレーザ光の強度をこの設定値とする処理が行われ、その後はこの制御処理を終了する。

一方、Ｓ１０７では、レーザ光源９より発せられるレーザ光の強度を最大とする値をレーザ光源制御部１０へ送付し、当該レーザ光の強度を最大とする処理が行われる。
Ｓ１０８では、入力値から検出感度の設定値への変換処理が行われる。すなわち、設定値−検出感度テーブル２４を参照し、Ｓ１０３の処理によって取得した入力値に対応付けられている検出感度設定値を設定値−検出感度テーブル２４から取得する処理が行われる。

Ｓ１０９では、Ｓ１０８の処理によって得られた検出感度設定値をゲイン調整部１６へ送付し、光検出器７の検出感度をこの設定値とする処理が行われ、その後はこの制御処理を終了する。

以上の制御処理がＣＰＵ１２で行われることにより、試料１の顕微鏡画像の明るさについての指示が取得され、試料１へ照射するレーザ光の強度が当該明るさについての指示に基づいて調整されると共に、レーザ光を照射した試料１からの反射光を検出する光検出器７の検出感度が当該明るさについての指示に基づいて調整される。従って、本装置の使用者は、顕微鏡画像の明るさのみについての指示を行うという容易な操作だけで、レーザ光の強度と光検出器７の検出感度との両方の調整がなされて、当該指示に応じた顕微鏡画像の明るさの調整が行われ、所望の明るさである良質な顕微鏡画像を得ることができる。

なお、使用者は、このようにして明るさの調整がなされた後の顕微鏡画像を観察したときに、その明るさが不適切であれば、当該使用者が明るさ調整スライドバー２８を利用して顕微鏡画像の明るさの設定の入力を再度行うことにより、上記の制御処理が実行されて当該明るさの調整が再度行われる。この繰り返しにより、顕微鏡画像の明るさを最適なものとすることができる。

また、検出器７の検出感度を高める調整は、レーザ光の強度が最大に調整されても顕微鏡画像の明るさが使用者からの指示に係るものに満たない場合に初めて行われるので、それまでは検出器７の検出信号のＳ／Ｎが良好な状態が維持される。従って、得られる顕微鏡画像のＳ／Ｎも良好なものとなる。

次に図７について説明する。同図は、上述した明るさ調整部によって行われる制御処理の詳細の第二の例をフローチャートで示したものである。
図６にフローチャートを示した第一の例は、顕微鏡画像の明るさを最適なものとするために、本装置の使用者が顕微鏡画像を観察し、その観察結果に応じて使用者が明るさの設定の入力を行うという作業を繰り返していた。これに対し、この第二の例では、顕微鏡画像の明るさの目標値とその目標値に対する許容範囲とを一度設定すると、顕微鏡画像がその目標の明るさになるようにレーザ強度及び検出感度の調整が自動的に行われるというものである。

ＣＰＵ１２が、この制御処理の実行開始の指示を本装置の使用者から取得すると、まずＳ２０１において、初期値の設定処理が行われる。この処理では、まず、予め定められているレーザ強度及び検出感度の最小値を各々レーザ光源制御部１０とゲイン調整部１６とに設定すると共に、予め定められているレーザ強度及び検出感度についての設定値の最大値を各々レーザ強度最大値メモリ１９及びゲイン最大値メモリ２０に記憶させる。更に、使用者により入力される顕微鏡画像の明るさについての指示である、顕微鏡画像の明るさの目標値と、その目標値に対する許容範囲とを取得する。なお、図７の制御処理においては、顕微鏡画像の明るさの目標値及び当該目標値に対する許容範囲は、顕微鏡画像の１画面当たりの平均輝度についてのものとして入力される。

なお、Ｓ２０１の初期値の設定処理により、レーザ光源制御部１０とゲイン調整部１６とには、レーザ強度及び検出感度の最小値が各々設定されているので、この時点における顕微鏡画像の明るさの設定値としては、最低値（「０．０」）が設定されている。

Ｓ２０２では、最大繰り返し数を自動調整繰り返し数メモリ１３に設定する処理が行われる。最大繰り返し数は、以下のＳ２０３からＳ２１３にかけての処理の繰り返しの最大回数であり、当該処理をこの最大回数繰り返しても顕微鏡画像が所望の明るさとならないときには、処理の繰り返しを打ち切って図７の処理を終了する。

Ｓ２０３では、レーザ光源制御部１０及びゲイン調整部１６に各々設定されている現在のレーザ強度及び検出感度の下で顕微鏡画像の取得を行い、当該顕微鏡画像を構成している各画素の輝度データを取得する処理が行われる。

Ｓ２０４では、前ステップの処理によって取得された輝度データの加算平均を求めて１画面当たりの平均輝度を算出する処理が行われる。
Ｓ２０５では、前ステップの処理によって算出された平均輝度が、Ｓ２０１の処理によって取得されている目標値に対する許容範囲内に収まっているか否かを判定する処理が行われる。ここで、当該範囲内に収まっていると判定されたとき（判定結果がＹｅｓのとき）には、適切な明るさの顕微鏡画像が取得できたとし、この制御処理を終了する。一方、当該範囲内に収まっていないと判定されたとき（判定結果がＮｏのとき）には、Ｓ２０６に処理を進める。

Ｓ２０６では、顕微鏡画像の明るさの現在の設定値に、予め定められている定数値αを加算して次の設定値を算出する処理が行われる。
Ｓ２０７では、前ステップの処理によって算出された顕微鏡画像の明るさの設定値からレーザ強度の設定値への変換処理が行われる。すなわち、設定値−レーザ強度テーブル２５を参照し、Ｓ２０６の処理によって算出された設定値に対応付けられているレーザ強度設定値を設定値−レーザ強度テーブル２５から取得する処理が行われる。

Ｓ２０８では、前ステップの処理によって得られたレーザ強度が、レーザ強度最大値メモリ１９に格納されているレーザ強度の最大値に一致したか否かを判定する処理が行われる。ここで、得られたレーザ強度が当該最大値に達していないと判定されたとき（判定結果がＮｏのとき）にはＳ２０９に処理を進め、得られたレーザ強度が当該最大値に一致したと判定されたとき（判定結果がＹｅｓのとき）にはＳ２１０に処理を進める。

Ｓ２０９では、Ｓ２０７の処理によって得られたレーザ強度をレーザ光源制御部１０に設定する処理が行われ、その後はＳ２１４に処理を進める。
Ｓ２１０では、図８に例示するような検出感度調整確認画面を表示する処理が行われる。そして、続くＳ２１１において、使用者が操作部におけるマウス装置の操作による、当該画面における「はい」のボタンのクリック操作を取得することにより、検出感度の調整を許す旨の確認指示が行われたか否かを判定する処理が行われる。ここで、検出感度の調整許可の確認指示が行われたと判定されたとき（判定結果がＹｅｓのとき）には、Ｓ２１２に処理を進める。一方、顕微鏡画像のノイズ低減を優先させる等の理由により、使用者が当該画面における「いいえ」のボタンをクリックすることにより、検出感度を調整しない旨の指示が行われたと判定されたとき（判定結果がＮｏのとき）には、顕微鏡画像を目標の明るさにすることなく、このままこの制御処理を終了する。

Ｓ２１２では、Ｓ２０６の処理によって算出された顕微鏡画像の明るさの設定値から検出感度の設定値への変換処理が行われる。すなわち、設定値−検出感度テーブル２４を参照し、Ｓ２０６の処理によって算出された設定値に対応付けられている検出感度設定値を設定値−検出感度テーブル２４から取得する処理が行われる。

Ｓ２１３では、レーザ強度最大値メモリ１９に格納されているレーザ強度の最大値をレーザ光源制御部１０に設定すると共に、Ｓ２１２の処理によって得られた検出感度をゲイン調整部１６に設定する処理が行われる。

Ｓ２１４では、Ｓ２０３からＳ２１３にかけての処理の繰り返し回数（調整回数）が、自動調整繰り返し数メモリ１３に格納されている最大繰り返し数を下回っているか否かを判定する処理が行われる。ここで、調整回数が最大繰り返し数を下回っていると判定されたとき（判定結果がＹｅｓのとき）には、Ｓ２０３へと処理を戻して上述した処理が繰り返される。一方、調整回数が最大繰り返し数に達したと判定されたとき（判定結果がＮｏのとき）には、顕微鏡画像を目標の明るさにすることなく、このままこの制御処理を終了する。

以上の処理をＣＰＵ１２が行うことにより、顕微鏡画像の平均輝度の算出が行われて、当該平均輝度が使用者による顕微鏡画像の明るさについての指示に適合するようにレーザ光の強度の調整及び光検出器７の検出感度の調整が自動で行われる。従って、使用者は、顕微鏡画像の明るさの平均輝度についての目標値とその目標値に対する許容範囲とを一度設定するという容易な操作だけで、顕微鏡画像がその目標の明るさとなり、所望の明るさである良質な顕微鏡画像を得ることができる。

なお、図７に示した制御処理の第二の例では、顕微鏡画像の１画面当たりの平均輝度に基づいてレーザ強度及び検出感度の調整を行うようにしていたが、その代わりに、顕微鏡画像を構成する各画素の輝度の最大値に基づいてレーザ強度及び検出感度の調整を行うようにしても、顕微鏡画像を目標の明るさにすることができる。このためには、図９にフローチャートでその詳細を示している制御処理の第三の例を、ＣＰＵ１２における明るさ調整部に行わせればよい。

図９に示した処理において、図７に示した制御処理の第二の例と同一の処理ステップには同一の符号を付している。
図９に示されている処理は、図７におけるＳ２０４及びＳ２０５の処理が、それぞれＳ３０１及びＳ３０２の処理として置き換えられている点において異なっている。そこで、ここでは、このＳ３０１及びＳ３０２の処理について説明する。

Ｓ２０３に続くＳ３０１では、Ｓ２０３の処理によって取得された輝度データのうちの最大値を取得する処理が行われる。
続くＳ３０２では、前ステップの処理によって取得された輝度の最大値が、Ｓ２０１の処理によって取得されている目標値に対する許容範囲内に収まっているか否かを判定する処理が行われる。ここで、当該範囲内に収まっていると判定されたとき（判定結果がＹｅｓのとき）には、適切な明るさの顕微鏡画像が取得できたとし、この制御処理を終了する。一方、当該範囲内に収まっていないと判定されたとき（判定結果がＮｏのとき）には、Ｓ２０６に処理を進める。なお、図９の制御処理では、Ｓ２０１の初期値の設定処理において、顕微鏡画像の明るさの目標値及び当該目標値に対する許容範囲は、顕微鏡画像における最大輝度についてのものとして入力される。

以上の処理をＣＰＵ１２が行うことにより、顕微鏡画像の最大輝度の取得が行われて、当該最大輝度が使用者による顕微鏡画像の明るさについての指示に適合するようにレーザ光の強度の調整及び光検出器７の検出感度の調整が行われる。従って、使用者は、顕微鏡画像の明るさの最大輝度についての目標値とその目標値に対する許容範囲とを一度設定するだけで、顕微鏡画像をその目標の明るさにすることができる。

次に図１０について説明する。同図は、設定値−レーザ強度テーブル２５の変更処理の処理内容をフローチャートで示したものである。
今までに説明した各制御処理による顕微鏡画像の明るさの設定では、まず、レーザ強度を最大まで高めても明るさが不足する場合には、検出感度を高めるようにしている。しかしながら、このような強度の強いレーザ光の照射を行うと試料１を破損してしまうことがあり得る。そこで、レーザ強度が所定の上限値に制限されるようにする。

レーザ強度の上限値の設定は、図１１に示したレーザ強度最大値設定画面を利用して行う。この画面はＣＰＵ１２が表示装置２７に表示させる画面である。
図１１に示す画面には、図２に示した明るさ調整画面におけるものと同様の明るさ調整スライドバー２９に加えて、登録ボタン３０及びレーザ強度最大値設定表示部３１を有している。本装置の使用者が操作部（不図示）におけるキーボード装置を操作すると、その操作に対応する数値がレーザ強度最大値設定表示部３１に表示される。ここで、使用者が操作部におけるマウス装置を操作して登録ボタン３０をクリックすると、レーザ強度最大値設定表示部３１に表示されている数値がレーザ強度の上限値として登録される。

図１０に示した処理は、例えば、使用者が本装置を操作して、明るさ調整スライドバー２９により顕微鏡画像の明るさの設定の入力を行ったことが検出されると開始される。
まず、Ｓ４０１では、図６に示した制御処理が実行されて、明るさ調整スライドバー２９による設定入力に基づいた顕微鏡画像の明るさの調整が行われる。

Ｓ４０２では、登録ボタン３０に対するクリック操作の検出が行われ、続くＳ４０３において、このときにレーザ強度最大値設定表示部３１に表示されている数値を読み出して取得する処理が行われる。

Ｓ４０４では、レーザ強度最大値メモリ１９に設定されているレーザ強度の最大値に対し、Ｓ４０３の処理によって取得された数値を百分率として乗算し、得られた値を改めてレーザ強度最大値メモリ１９へ格納する処理が行われる。

Ｓ４０５では、設定値−レーザ強度テーブル２５に格納されている設定値毎のレーザ強度値に対し、Ｓ４０３の処理によって取得された数値を百分率として乗算し、得られた値を改めて設定値−レーザ強度テーブル２５へ格納する処理が行われる。

Ｓ４０５の処理により変更された設定値−レーザ強度テーブル２５の例を図１２に示す。同図の例は、レーザ強度の最大値を「８０」％に制限する指示が使用者からなされたことにより、図５Ａに例示した変更前の設定値−レーザ強度テーブル２５がＳ４０５の処理によって変更されて得られたものであり、レーザ強度の最大値が「１００．０」から「８０．０」へと制限されている。

以上の図１０の処理を行うことにより、レーザ強度最大値メモリ１９及び設定値−レーザ強度テーブル２５に格納されている各レーザ強度値が書き換えられる。この後に、前述した各制御処理による顕微鏡画像の明るさの設定を行えば、レーザ強度が所定の上限値の範囲内で調整されるので、過度に強いレーザ光の照射による試料１の破損が防止される。

次に図１３について説明する。同図は、対物レンズ２の切り替えに応じて行われる顕微鏡画像の明るさ補正処理の処理内容をフローチャートで示したものである。
対物レンズ２を対物レンズ切り替え器３に複数取り付けておき、これらを切り替えて観察を行う場合には、対物レンズ２毎のＮＡ（開口数）等の違いにより、選択される対物レンズ２により得られる顕微鏡画像の明るさが変わってしまう。そこで、図１に示すように、対物レンズ２毎に明るさを補正するための補正値を記憶する補正値記億メモリ２２を備えておき、図１３に示した処理をＣＰＵ１２が実行することにより、その補正値に基づいてレーザ強度を決定するようにする。こうすることにより、対物レンズ２を切り替えて観察を行っても、明るさの違いが補正されて、Ｓ／Ｎが良好で適切な明るさの顕微鏡画像を取得することができる。

なお、対物レンズ２毎に明るさを補正するための補正値は、ミラー等の標準試料に対する測定により、画像の明るさが各対物レンズ２で同じとなる値を求めておき、補正値記億メモリ２２に予め格納しておくようにする。

図１３に示した処理は、顕微鏡画像の取得に用いられる対物レンズ２が対物レンズ切り替え器３により切り替えられると開始される。
まず、Ｓ５０１では、各対物レンズ２に対応する明るさ補正値を補正値記億メモリ２２から取得する処理が行われる。

続くＳ５０２では、切り替えの前後において本装置の光路に挿入されている対物レンズ２を識別する情報（型番など）を取得する処理が行われる。
Ｓ５０３では、下記の式の計算を実行する。

（切替後レーザ強度）＝（切替前レーザ強度）×
（切替前補正値）／（切替後補正値）
上記の式において、「切替前レーザ強度」はレーザ光源制御部１０に現在設定されているレーザ強度であり、「切替前補正値」は切り替え前において本装置の光路に挿入されていた対物レンズ２についての明るさ補正値であり、「切替後補正値」は切り替え後において本装置の光路に挿入されている対物レンズ２についての明るさ補正値である。

Ｓ５０４では、上記の式の計算によって算出された「切替後レーザ強度」をレーザ光源制御部１０へ設定する処理が行われる。
以上の処理がＣＰＵ１２によって行われることにより、顕微鏡画像の取得に用いられる対物レンズ２の違いに応じて、レーザ光の強度が補正される。従って、対物レンズ２を切り替えて観察を行っても、明るさの違いの補正がされた、Ｓ／Ｎが良好で適切な明るさの顕微鏡画像が取得できるようになる。

次に、前述したエクステンド画像を取得する際における明るさ調整の手法について説明する。
本実施形態におけるエクステンド画像の撮影手順について、図１４を用いて簡単に説明すると、対物レンズ２をＺ軸方向（光軸方向）に所定間隔ずつ移動させ、ステップ１、ステップ２、…、ステップＣ１、…、ステップＣ２、…、ステップＮの各位置において試料１についての合焦位置のみの共焦点画像の取得を行う。そして、このようにして得られた複数枚の共焦点画像を１枚の画像に合成することにより、試料１についてのエクステンド画像が得られる。但し、図１４の例では、対物レンズ２がステップＣ１及びステップＣ２の位置へと移動してきたときには、明るさ調整を行った上で共焦点画像の取得を行うようにし、エクステンド画像における明るさのムラを低減する。

図１５について説明する。同図は、エクステンド画像の撮影時にＣＰＵ１２によって行われる、共焦点画像の明るさ調整のための処理内容をフローチャートで示したものである。この処理は、明るさ調整を行うときの対物レンズ２のＺ軸方向位置と、そのときの明るさ調整量とを取得する処理である。

まず、Ｓ６０１では、使用者によって設定される、対物レンズ２のＺ軸方向の移動における開始位置、終了位置、及びＺ送り量についての情報を取得して取り込み情報メモリ２６に格納する処理が行われる。なお、このとき、対物レンズ２は、当該開始位置に位置させておく。

Ｓ６０２では、Ｚ位置制御部５に指示を与え、Ｓ６０１の処理によって取得された移動量だけ対物レンズ２を移動させる処理が行われ、このときに、試料１の共焦点画像が取得される。

Ｓ６０３では、現在取得されている試料１の共焦点画像を参照している使用者が明るさ調整スライドバー２８を利用して入力した、当該共焦点画像の明るさ設定の入力値を取得する処理が行われる。このときに入力された明るさ設定値は、対物レンズ２の現在のＺ軸方向位置に対応付けられて明るさ設定値テーブル２３に格納される。また、ここで、明るさ設定値が変更された場合には、図６に示した制御処理による明るさ調整が行われて、レーザ光源制御部１０とゲイン調整部１６に各々設定されているレーザ強度及び検出感度が変更される。

Ｓ６０４では、対物レンズ２のＺ軸方向の現在位置が、Ｓ６０１の処理によって取得された終了位置に達し、共焦点画像取得のための明るさ調整が終了したか否かを判定する処理が行われる。ここで、明るさ調整を終えたと判定されたとき（判定結果がＹｅｓのとき）には、この図１５の処理を終了する。一方、明るさ調整を未だ終えていないと判定されたとき（判定結果がＮｏのとき）には、Ｓ６０３とへ処理を戻して上述した処理が繰り返される。

次に図１６について説明する。同図は、ＣＰＵ１２によって行われる、エクステンド画像生成用の共焦点画像の取得処理の処理内容をフローチャートで示したものである。この処理は、図１５に示した制御処理によって取得された各種情報に基づき、明るさの揃った共焦点画像を取得する処理である。

まず、Ｓ７０１では、取り込み情報メモリ２６に格納されている、対物レンズ２のＺ軸方向の移動における開始位置、終了位置、及びＺ送り量についての情報と、明るさ設定値テーブル２３に格納されている、明るさ設定の切り替えを行う対物レンズ２のＺ軸方向位置を示す情報（切り替え位置情報）とを読み出す処理が行われる。

Ｓ７０２では、切り替え位置情報で示されているＺ軸方向位置における明るさの設定値を示す情報（明るさ情報）を明るさ設定値テーブル２３から読み出す処理が行われる。
Ｓ７０３では、対物レンズ２のＺ軸方向の現在位置が、切り替え位置情報で示されている位置にあるか否かを判定する処理が行われる。ここで、当該現在位置が切り替え位置情報で示されている位置にあると判定されたとき（判定結果がＹｅｓのとき）には、Ｓ７０４において、明るさを設定する処理が行われる。この処理は、具体的には、図６に示した制御処理を実行して当該位置における明るさ情報に基づいたレーザ強度及び検出感度を取得し、得られたレーザ強度及び検出感度をレーザ光源制御部１０とゲイン調整部１６に各々設定する処理である。一方、Ｓ７０３において、当該現在位置が切り替え位置情報で示されている位置に未だ達していないと判定されたとき（判定結果がＮｏのとき）には、Ｓ７０４の処理を実行することなく、Ｓ７０５に処理を進める。

Ｓ７０５では、Ｚ位置制御部５に指示を与え、Ｓ７０１の処理によって取得されたＺ送り量だけ対物レンズ２を移動させる処理が行われる。
Ｓ７０６では、対物レンズ２のＺ軸方向の現在位置においての試料１の共焦点画像を取得する処理が行われる。

Ｓ７０７では、対物レンズ２のＺ軸方向の現在位置が、Ｓ７０１の処理によって取得された終了位置に達し、共焦点画像の取得が終了したか否かを判定する処理が行われる。ここで、共焦点画像の取得を終えたと判定されたとき（判定結果がＹｅｓのとき）には、この図１６の処理を終了する。一方、共焦点画像の取得を未だ終えていないと判定されたとき（判定結果がＮｏのとき）には、Ｓ７０３とへ処理を戻して上述した処理が繰り返される。

以上の図１５及び図１６の処理がＣＰＵ１２によって行われることにより、Ｚ位置制御部５が顕微鏡画像の取得に用いられる対物レンズ２と試料１との相対位置を変化させる一方で、顕微鏡画像の明るさの指示が、当該相対位置に対応付けられて明るさ設定値テーブル２３に複数記憶される。そして、上記の相対位置が変化したときには、当該変化後の相対位置に対応付けられて明るさ設定値テーブル２３に記憶されている当該明るさの指示に基づいて、レーザ光の強度の調整及び検出器７の検出感度の調整が各々行われる。この結果、試料１についての、焦点位置の違いに拘らず明るさの揃った共焦点画像が取得できるので、明るさのムラが少なく、Ｓ／Ｎが良好なエクステンド画像を当該共焦点画像から得ることができる。

その他、本発明は、上述した実施形態に限定されることなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良・変更が可能である。

本発明を実施する走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成を示す図である。 明るさ調整画面の例を示す図である。 明るさ調整スライドバーによる設定入力値と実際の明るさとの関係を示す図である。 明るさ調整スライドバーによる設定入力値と真の設定値との関係を示す図である。 設定値−レーザ強度テーブルの数値例をグラフにより示した図である。 設定値−検出感度テーブルの数値例をグラフにより示した図である。 制御処理の詳細の第一の例をフローチャートで示した図である。 制御処理の詳細の第二の例をフローチャートで示した図である。 検出感度調整確認画面の画面例を示す図である。 制御処理の詳細の第三の例をフローチャートで示した図である。 設定値−レーザ強度テーブルの変更処理の処理内容をフローチャートで示した図である。 レーザ強度最大値設定画面の画面例を示す図である。 図１０の処理により変更された設定値−レーザ強度テーブルの例を示す図である。 顕微鏡画像の明るさ補正処理の処理内容をフローチャートで示した図である。 エクステンド画像の撮影手順を説明する図である。 エクステンド画像の撮影時に行われる、共焦点画像の明るさ調整のための制御処理の処理内容をフローチャートで示した図である。 エクステンド画像生成用の共焦点画像の取得処理の処理内容をフローチャートで示した図である。 従来技術における調光フィルタの選択の様子を示す図である。 サンプル損傷防止優先モードにおける調光フィルタの選択と増倍管印加電圧の制御による明るさの調整の様子を示す図である。 ノイズ防止優先モードにおける調光フィルタの選択と増倍管印加電圧の制御による明るさの調整の様子を示す図である。

符号の説明

１ 試料
２ 対物レンズ
３ 対物レンズ切り替え器
４ Ｚ位置検出器
５ Ｚ位置制御部
６ ハーフミラー
７ 光検出器
８ ミラー
９ レーザ光源
１０ レーザ光源制御部
１１ 顕微鏡制御部
１２ ＣＰＵ
１３ 自動調整繰り返し数メモリ
１４ レーザ強度メモリ
１５ レーザ強度入力部
１６ ゲイン調整部
１７ ゲインメモリ
１８ 検出感度入力部
１９ レーザ強度最大値メモリ
２０ ゲイン最大値メモリ
２１ 画像メモリ
２２ 補正値記億メモリ
２３ 明るさ設定値テーブル
２４ 設定値−検出感度テーブル
２５ 設定値−レーザ強度テーブル
２６ 取り込み情報メモリ
２７ 表示装置
２８ 明るさ調整スライドバー
２９ 明るさ調整スライドバー
３０ 登録ボタン
３１ レーザ強度最大値設定表示部

Claims (10)

1. 試料の顕微鏡画像の明るさについての指示を取得する明るさ指示取得手段と、
   前記試料へ照射するレーザ光の強度を前記明るさ指示取得手段からの指示に基づいて調整するレーザ光強度調整手段と、
   前記レーザ光を照射した前記試料からの反射光を検出する光検出器の検出感度を前記明るさ指示取得手段からの指示に基づいて調整する検出感度調整手段と、
   を有することを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。
2. 前記検出感度調整手段は、前記レーザ光強度調整手段により前記レーザ光の強度が最大に調整されても前記顕微鏡画像の明るさが前記明るさ指示取得手段で取得された明るさについての指示に係るものに満たない場合に、前記光検出器の検出感度を高める調整を行うことを特徴とする請求項１に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。
3. 前記レーザ光の強度が最大に調整されても前記顕微鏡画像の明るさが前記明るさ指示取得手段で取得された明るさについての指示に係るものに満たない場合に、前記光検出器の検出感度の調整を行うか否かの確認指示を取得する確認指示取得手段を更に有し、
   前記検出感度調整手段は、前記光検出器の検出感度の調整を行う旨の確認指示を取得した場合に、当該光検出器の検出感度を調整する、
   ことを特徴とする請求項２に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。
4. 前記顕微鏡画像の平均輝度を算出する平均輝度算出手段を更に有し、
   前記レーザ光強度調整手段及び前記検出感度調整手段は、前記平均輝度算出手段で算出される平均輝度が前記明るさについての指示に適合するように前記レーザ光の強度調整及び前記光検出器の検出感度調整を各々行う、
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。
5. 前記顕微鏡画像の最大輝度を取得する最大輝度取得手段を更に有し、
   前記レーザ光強度調整手段及び前記検出感度調整手段は、前記最大輝度が前記明るさについての指示に適合するように前記レーザ光の強度調整及び前記光検出器の検出感度調整を各々行う、
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。
6. 前記レーザ光強度の上限の設定を取得する上限設定取得手段を更に有し、
   前記レーザ光強度調整手段は、前記上限設定取得手段が取得する上限の範囲内で前記強度を調整する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。
7. 前記顕微鏡画像の取得に用いられる対物レンズの違いに応じて、前記レーザ光の強度を補正する補正手段を更に有することを特徴とする請求項１に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。
8. 前記顕微鏡画像の取得に用いられる対物レンズと前記試料との相対位置を変化させる変動手段と、
   前記顕微鏡画像の明るさの指示を、前記相対位置に対応付けて複数記憶しておく記憶手段と、
   を更に有し、
   前記レーザ光強度調整手段及び前記検出感度調整手段は、前記変動手段によって前記相対位置が変化したときには、当該変化後の相対位置に対応付けられて前記記憶手段に記憶されている前記明るさの指示に基づいて、前記レーザ光の強度調整及び前記光検出器の検出感度調整を各々行う、
   ことを特徴する請求項１に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。
9. 試料の顕微鏡画像の明るさについての指示を取得し、
   前記試料へ照射するレーザ光の強度を前記明るさについての指示に基づいて調整し、
   前記レーザ光を照射した前記試料からの反射光を検出する光検出器の検出感度を前記明るさについての指示に基づいて調整する、
   ことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡の制御方法。
10. 走査型共焦点レーザ顕微鏡の制御を情報処理装置に行わせるためのプログラムであって、
    試料の顕微鏡画像の明るさについての指示を取得する処理と、
    前記試料へ照射するレーザ光の強度を前記明るさについての指示に基づいて調整する処理と、
    前記レーザ光を照射した前記試料からの反射光を検出する光検出器の検出感度を前記明るさについての指示に基づいて調整する処理と、
    を情報処理装置に行わせるためのプログラム。