JP2007206388A - 走査型共焦点レーザ顕微鏡、及びその制御方法、並びにプログラム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】CPU12は、試料1の顕微鏡画像の明るさについての指示を取得し、レーザ光源9から試料1へと照射するレーザ光の強度を当該明るさについての指示に基づいて調整すると共に、当該レーザ光を照射した試料1からの反射光を検出する光検出器7の検出感度を当該明るさについての指示に基づいて調整する。
【選択図】 図1
Description
レーザ光源より発せられるレーザ光は、ミラーで光路を曲げられた後に対物レンズを通って試料を照射する。試料で反射したレーザ光は対物レンズを通過した後にハーフミラーを介して集光される。この集光位置にはピンホールが配されており、ピンホールの通過したレーザ光の強度を光検出器が検出する。ここで、試料に設定される測定領域をレーザ光により二次元走査し、このときに光検出器で検出される走査位置毎の反射光の強度を画素毎の輝度に対応付けることにより、当該測定領域の二次元画像を得ることができる。ここで、試料における対物レンズの焦点位置以外からの反射光はピンホールの位置で集光しないため、試料における焦点位置のみの画像(共焦点画像)を得ることができる。
特許文献1に開示されている走査型共焦点レーザ顕微鏡には、試料標本へ照射するレーザ光の光路に調光フィルタが設けられており、更に、その調光フィルタを切り換える手段が備えられている。このフィルタの切り換えを行うと、画像の明るさを切り換えることができる。
同図に示したグラフにおいて、横軸は、光検出器として使用される光電子増倍管への印加電圧(以下、「増倍管印加電圧」と称することとする)を示しており、この数値が大きいほど光電子増倍管の増幅度が高くなって光検出器の感度が高くなる。一方、縦軸は、最大出力を100%としたときのレーザ光源の出力を示しており、これはすなわち、試料標本へ照射するレーザ光の強度(以下、「レーザ光照射強度」と称することとする)を表している。また、同図のグラフにおいて、曲線毎に付されている「15」から「80」までの各数値は、試料標本の発光率、すなわち、同一強度のレーザ光が照射された試料標本の発光量を表している。つまり、この各曲線は、試料標本の発光率を一定にした条件の下で、光電子増倍管から一定の出力信号が得られるようになるレーザ光照射強度と増倍管印加電圧との関係を表している。
まず図1について説明する。同図は、本発明を実施する走査型共焦点レーザ顕微鏡(以下、「本装置」と称することとする)の構成を示している。
レーザ光源制御部10はレーザ光源9を制御してレーザ光の強度を変化させることができる。また、ミラー8を二次元に振ることでレーザ光源9から発せられるレーザ光を試料1上で二次元走査させる。
Z位置検出器4は、Z軸方向(光軸方向)における試料1に対する対物レンズ2の相対的な位置を検出する。Z位置制御部5は、当該位置の検出結果を取得すると共に、対物レンズ2をZ軸方向(光軸方向)に上下動させて当該位置の制御を行う。
この画面には明るさ調整スライドバー28が表されている。本装置の使用者がマウス装置等の操作部(図1には不図示)を操作すると、その操作に応じて明るさ調整スライドバー28に表されている指針が左右に移動して顕微鏡画像の明るさの設定が行われる。なお、この指針を左端に位置させたときには、明るさの設定値として「0.0」の値が設定され、指針を右端に位置させたときには、明るさの設定値として「100.0」の値が設定される。また、明るさ調整スライドバー28による設定値と実際の明るさとは、図3に示すように直線的な関係となるようにする。
続くS102では、予め定められているレーザ強度及び検出感度についての設定値の最大値を各々レーザ強度最大値メモリ19及びゲイン最大値メモリ20に記憶させておく処理が行われる。なお、図4の例においては、レーザ強度についての設定値の最大値は「50.0」と定められ、検出感度についての設定値の最大値は「100.0」と定められる。
ここで、S104において、前ステップで取得した入力値がレーザ強度最大値メモリ19に記憶されている値以下であるか否かを判定する処理が行われる。ここで、入力値がレーザ強度の最大値以下と判定されたとき(判定結果がYesのとき)にはS105に、また、入力値がレーザ強度の最大値よりも大きいと判定されたとき(判定結果がNoのとき)にはS107に、それぞれ処理を進める。
S108では、入力値から検出感度の設定値への変換処理が行われる。すなわち、設定値−検出感度テーブル24を参照し、S103の処理によって取得した入力値に対応付けられている検出感度設定値を設定値−検出感度テーブル24から取得する処理が行われる。
図6にフローチャートを示した第一の例は、顕微鏡画像の明るさを最適なものとするために、本装置の使用者が顕微鏡画像を観察し、その観察結果に応じて使用者が明るさの設定の入力を行うという作業を繰り返していた。これに対し、この第二の例では、顕微鏡画像の明るさの目標値とその目標値に対する許容範囲とを一度設定すると、顕微鏡画像がその目標の明るさになるようにレーザ強度及び検出感度の調整が自動的に行われるというものである。
S205では、前ステップの処理によって算出された平均輝度が、S201の処理によって取得されている目標値に対する許容範囲内に収まっているか否かを判定する処理が行われる。ここで、当該範囲内に収まっていると判定されたとき(判定結果がYesのとき)には、適切な明るさの顕微鏡画像が取得できたとし、この制御処理を終了する。一方、当該範囲内に収まっていないと判定されたとき(判定結果がNoのとき)には、S206に処理を進める。
S207では、前ステップの処理によって算出された顕微鏡画像の明るさの設定値からレーザ強度の設定値への変換処理が行われる。すなわち、設定値−レーザ強度テーブル25を参照し、S206の処理によって算出された設定値に対応付けられているレーザ強度設定値を設定値−レーザ強度テーブル25から取得する処理が行われる。
S210では、図8に例示するような検出感度調整確認画面を表示する処理が行われる。そして、続くS211において、使用者が操作部におけるマウス装置の操作による、当該画面における「はい」のボタンのクリック操作を取得することにより、検出感度の調整を許す旨の確認指示が行われたか否かを判定する処理が行われる。ここで、検出感度の調整許可の確認指示が行われたと判定されたとき(判定結果がYesのとき)には、S212に処理を進める。一方、顕微鏡画像のノイズ低減を優先させる等の理由により、使用者が当該画面における「いいえ」のボタンをクリックすることにより、検出感度を調整しない旨の指示が行われたと判定されたとき(判定結果がNoのとき)には、顕微鏡画像を目標の明るさにすることなく、このままこの制御処理を終了する。
図9に示されている処理は、図7におけるS204及びS205の処理が、それぞれS301及びS302の処理として置き換えられている点において異なっている。そこで、ここでは、このS301及びS302の処理について説明する。
続くS302では、前ステップの処理によって取得された輝度の最大値が、S201の処理によって取得されている目標値に対する許容範囲内に収まっているか否かを判定する処理が行われる。ここで、当該範囲内に収まっていると判定されたとき(判定結果がYesのとき)には、適切な明るさの顕微鏡画像が取得できたとし、この制御処理を終了する。一方、当該範囲内に収まっていないと判定されたとき(判定結果がNoのとき)には、S206に処理を進める。なお、図9の制御処理では、S201の初期値の設定処理において、顕微鏡画像の明るさの目標値及び当該目標値に対する許容範囲は、顕微鏡画像における最大輝度についてのものとして入力される。
今までに説明した各制御処理による顕微鏡画像の明るさの設定では、まず、レーザ強度を最大まで高めても明るさが不足する場合には、検出感度を高めるようにしている。しかしながら、このような強度の強いレーザ光の照射を行うと試料1を破損してしまうことがあり得る。そこで、レーザ強度が所定の上限値に制限されるようにする。
図11に示す画面には、図2に示した明るさ調整画面におけるものと同様の明るさ調整スライドバー29に加えて、登録ボタン30及びレーザ強度最大値設定表示部31を有している。本装置の使用者が操作部(不図示)におけるキーボード装置を操作すると、その操作に対応する数値がレーザ強度最大値設定表示部31に表示される。ここで、使用者が操作部におけるマウス装置を操作して登録ボタン30をクリックすると、レーザ強度最大値設定表示部31に表示されている数値がレーザ強度の上限値として登録される。
まず、S401では、図6に示した制御処理が実行されて、明るさ調整スライドバー29による設定入力に基づいた顕微鏡画像の明るさの調整が行われる。
対物レンズ2を対物レンズ切り替え器3に複数取り付けておき、これらを切り替えて観察を行う場合には、対物レンズ2毎のNA(開口数)等の違いにより、選択される対物レンズ2により得られる顕微鏡画像の明るさが変わってしまう。そこで、図1に示すように、対物レンズ2毎に明るさを補正するための補正値を記憶する補正値記億メモリ22を備えておき、図13に示した処理をCPU12が実行することにより、その補正値に基づいてレーザ強度を決定するようにする。こうすることにより、対物レンズ2を切り替えて観察を行っても、明るさの違いが補正されて、S/Nが良好で適切な明るさの顕微鏡画像を取得することができる。
まず、S501では、各対物レンズ2に対応する明るさ補正値を補正値記億メモリ22から取得する処理が行われる。
S503では、下記の式の計算を実行する。
(切替前補正値)/(切替後補正値)
上記の式において、「切替前レーザ強度」はレーザ光源制御部10に現在設定されているレーザ強度であり、「切替前補正値」は切り替え前において本装置の光路に挿入されていた対物レンズ2についての明るさ補正値であり、「切替後補正値」は切り替え後において本装置の光路に挿入されている対物レンズ2についての明るさ補正値である。
以上の処理がCPU12によって行われることにより、顕微鏡画像の取得に用いられる対物レンズ2の違いに応じて、レーザ光の強度が補正される。従って、対物レンズ2を切り替えて観察を行っても、明るさの違いの補正がされた、S/Nが良好で適切な明るさの顕微鏡画像が取得できるようになる。
本実施形態におけるエクステンド画像の撮影手順について、図14を用いて簡単に説明すると、対物レンズ2をZ軸方向(光軸方向)に所定間隔ずつ移動させ、ステップ1、ステップ2、…、ステップC1、…、ステップC2、…、ステップNの各位置において試料1についての合焦位置のみの共焦点画像の取得を行う。そして、このようにして得られた複数枚の共焦点画像を1枚の画像に合成することにより、試料1についてのエクステンド画像が得られる。但し、図14の例では、対物レンズ2がステップC1及びステップC2の位置へと移動してきたときには、明るさ調整を行った上で共焦点画像の取得を行うようにし、エクステンド画像における明るさのムラを低減する。
S703では、対物レンズ2のZ軸方向の現在位置が、切り替え位置情報で示されている位置にあるか否かを判定する処理が行われる。ここで、当該現在位置が切り替え位置情報で示されている位置にあると判定されたとき(判定結果がYesのとき)には、S704において、明るさを設定する処理が行われる。この処理は、具体的には、図6に示した制御処理を実行して当該位置における明るさ情報に基づいたレーザ強度及び検出感度を取得し、得られたレーザ強度及び検出感度をレーザ光源制御部10とゲイン調整部16に各々設定する処理である。一方、S703において、当該現在位置が切り替え位置情報で示されている位置に未だ達していないと判定されたとき(判定結果がNoのとき)には、S704の処理を実行することなく、S705に処理を進める。
S706では、対物レンズ2のZ軸方向の現在位置においての試料1の共焦点画像を取得する処理が行われる。
2 対物レンズ
3 対物レンズ切り替え器
4 Z位置検出器
5 Z位置制御部
6 ハーフミラー
7 光検出器
8 ミラー
9 レーザ光源
10 レーザ光源制御部
11 顕微鏡制御部
12 CPU
13 自動調整繰り返し数メモリ
14 レーザ強度メモリ
15 レーザ強度入力部
16 ゲイン調整部
17 ゲインメモリ
18 検出感度入力部
19 レーザ強度最大値メモリ
20 ゲイン最大値メモリ
21 画像メモリ
22 補正値記億メモリ
23 明るさ設定値テーブル
24 設定値−検出感度テーブル
25 設定値−レーザ強度テーブル
26 取り込み情報メモリ
27 表示装置
28 明るさ調整スライドバー
29 明るさ調整スライドバー
30 登録ボタン
31 レーザ強度最大値設定表示部
Claims (10)
- 試料の顕微鏡画像の明るさについての指示を取得する明るさ指示取得手段と、
前記試料へ照射するレーザ光の強度を前記明るさ指示取得手段からの指示に基づいて調整するレーザ光強度調整手段と、
前記レーザ光を照射した前記試料からの反射光を検出する光検出器の検出感度を前記明るさ指示取得手段からの指示に基づいて調整する検出感度調整手段と、
を有することを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。 - 前記検出感度調整手段は、前記レーザ光強度調整手段により前記レーザ光の強度が最大に調整されても前記顕微鏡画像の明るさが前記明るさ指示取得手段で取得された明るさについての指示に係るものに満たない場合に、前記光検出器の検出感度を高める調整を行うことを特徴とする請求項1に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。
- 前記レーザ光の強度が最大に調整されても前記顕微鏡画像の明るさが前記明るさ指示取得手段で取得された明るさについての指示に係るものに満たない場合に、前記光検出器の検出感度の調整を行うか否かの確認指示を取得する確認指示取得手段を更に有し、
前記検出感度調整手段は、前記光検出器の検出感度の調整を行う旨の確認指示を取得した場合に、当該光検出器の検出感度を調整する、
ことを特徴とする請求項2に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。 - 前記顕微鏡画像の平均輝度を算出する平均輝度算出手段を更に有し、
前記レーザ光強度調整手段及び前記検出感度調整手段は、前記平均輝度算出手段で算出される平均輝度が前記明るさについての指示に適合するように前記レーザ光の強度調整及び前記光検出器の検出感度調整を各々行う、
ことを特徴とする請求項1に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。 - 前記顕微鏡画像の最大輝度を取得する最大輝度取得手段を更に有し、
前記レーザ光強度調整手段及び前記検出感度調整手段は、前記最大輝度が前記明るさについての指示に適合するように前記レーザ光の強度調整及び前記光検出器の検出感度調整を各々行う、
ことを特徴とする請求項1に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。 - 前記レーザ光強度の上限の設定を取得する上限設定取得手段を更に有し、
前記レーザ光強度調整手段は、前記上限設定取得手段が取得する上限の範囲内で前記強度を調整する、
ことを特徴とする請求項1に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。 - 前記顕微鏡画像の取得に用いられる対物レンズの違いに応じて、前記レーザ光の強度を補正する補正手段を更に有することを特徴とする請求項1に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。
- 前記顕微鏡画像の取得に用いられる対物レンズと前記試料との相対位置を変化させる変動手段と、
前記顕微鏡画像の明るさの指示を、前記相対位置に対応付けて複数記憶しておく記憶手段と、
を更に有し、
前記レーザ光強度調整手段及び前記検出感度調整手段は、前記変動手段によって前記相対位置が変化したときには、当該変化後の相対位置に対応付けられて前記記憶手段に記憶されている前記明るさの指示に基づいて、前記レーザ光の強度調整及び前記光検出器の検出感度調整を各々行う、
ことを特徴する請求項1に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡。 - 試料の顕微鏡画像の明るさについての指示を取得し、
前記試料へ照射するレーザ光の強度を前記明るさについての指示に基づいて調整し、
前記レーザ光を照射した前記試料からの反射光を検出する光検出器の検出感度を前記明るさについての指示に基づいて調整する、
ことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡の制御方法。 - 走査型共焦点レーザ顕微鏡の制御を情報処理装置に行わせるためのプログラムであって、
試料の顕微鏡画像の明るさについての指示を取得する処理と、
前記試料へ照射するレーザ光の強度を前記明るさについての指示に基づいて調整する処理と、
前記レーザ光を照射した前記試料からの反射光を検出する光検出器の検出感度を前記明るさについての指示に基づいて調整する処理と、
を情報処理装置に行わせるためのプログラム。
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