JP2003043369A - レーザ走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】良好な試料画像を表示できるレーザ走査型顕微
鏡を提供すること。 【解決手段】レーザ光を観察対象の試料に集束させて照
射させると共に試料に対して走査させ、試料から得られ
た光を光電変換手段33により検出することにより走査各
位置毎の光検出出力を画素データとして得て試料の画像
を得るようにした顕微鏡において、サンプリング周期変
更可能であって、前記走査の各位置毎に前記光電変換手
段の光検出出力を、設定サンプリング周期対応にサンプ
リングする手段35と、このサンプリングされて得られた
走査位置での光検出出力を平均化してその位置での画素
データとする演算手段36と、所望の平均化数を設定する
とその設定した数対応に前記サンプリング周期を変更す
る変更手段38とを具備する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、レーザ光で試料を
走査し、試料から得られる光から画像データを得て表示
するレーザ走査型顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞や組織を観察し易くするために、染
色用の試薬で試料を染色することが行われている。そし
て、染色用の試薬には種々のものがあり、生体組織はそ
の成分により、染まり易い試薬と、染まり難い試薬とが
ある。これを利用して、目的に応じた所望の試薬により
試料（標本）を染色して、顕微鏡観察に供することが行
われている。そして、現在では更に一歩進めて、複数種
の蛍光試薬で染色した試料にレーザ光を照射し、このレ
ーザ光照射により試薬から励起された蛍光放射を分光し
て、分光されたスペクトルのデータを収集して、分析に
用いることが行われている。

【０００３】そのために用いるのがレーザ走査型顕微鏡
であり、これは、レーザ光を対物レンズを介して集光し
て試料に照射すると共に、試料に対してレーザ光をＸ−
Ｙ走査し、試料のレーザ照射位置から励起あるいは反射
により放射される光を分光器で分光し、所望の波長の光
成分を光電変換素子で受光して光信号化し、これをＡ／
Ｄ変換器によりデジタル変換して画素データとして得て
画像処理を施し、これより染色済みの試料の画像を得る
ようにしたものである。

【０００４】また、共焦点型の場合、試料から放出され
る光の導出経路中にピンホールを有する共焦点ピンホー
ルを配し、この共焦点ピンホールを介して得られた光を
検出し、この検出した光信号を元に画像を得る構成であ
る。共焦点型の場合、試料に対する対物レンズの焦点位
置と共役な焦点位置を持つ共焦点レンズを配置し、この
共焦点レンズの共焦点位置に共焦点ピンホールを配置す
ることで、試料からの光のうち、対物レンズの焦点位置
からの光が共焦点ピンホール上に焦点を結ぶことにな
り、従って、その光のみを、この共焦点ピンホールにて
抽出できることになる。

【０００５】このようなレーザ走査型顕微鏡において、
試料を観察する場合、試料から得られる光、たとえば蛍
光が十分でなく、表示される画像が暗い場合には、明る
い画像を得るためにレーザ光源の出射側に光量調整用と
して設けてある調光フィルタを切り換えて出射レーザ光
の強度を上げることにより光電変換素子（光電子増倍
管）での受光量アップを図るようにしたり、光電変換素
子に印加する電圧や光電変換素子から出力される信号の
増幅率を大きくして、得られる画像の輝度を上げるよう
にしている。

【０００６】また、別の方法として、光電変換素子から
の信号をＡ／Ｄ変換することにより得た試料画像の各画
素データを、各走査位置毎に複数回ずつサンプリングし
てそれを加算処理し、その画素位置での画素データとす
るようにした技術もある。例えば、特開平０９−１３８
３５３号公報においては、光電変換によって得られた信
号レベルを検出、評価することで、予め用意したテーブ
ルに基づいてレーザ光の光強度やピンホール径、光電子
増倍管の増幅率を調整し、画像の輝度を一定の範囲内に
納めようとするものである。

【０００７】以下その構成を、図１１を用いて説明す
る。

【０００８】この従来技術のレーザ走査型顕微鏡は、レ
ーザ照射手段１と、試料９に対してレーザ光をＸ−Ｙ走
査するスキャナ６および制御手段８、試料９からの光を
輝度信号に変換する光電子増倍管１２およびその電源で
ある増倍管用電源１３とからなる光電変換手段１４、当
該光電変換手段１４の光電子増倍管１２が出力する輝度
信号により映像信号を生成する画像処理装置１５、及び
この画像処理装置１５の映像信号出力を元に、レーザ強
度を調整するためにフィルタ切換装置４を制御したり、
ピンホール（共焦点ピンホール）１１のピンホール径を
制御するピンホール径制御装置１０を制御したり、増倍
管用電源１３の電圧を制御して光電子増倍管１２の光電
変換出力の制御をする自動調光装置１７とからなる。

【０００９】レーザ照射手段１は、レーザ光源であるレ
ーザ出射装置２とその出射レーザ光量を調整するための
複数種類用意された調光フィルタ３とこれらの調光フィ
ルタ３を切り換えるフィルタ切換装置４からなる。

【００１０】自動調光装置１７は、コンピュータを用い
て構成されるのものであって、画像処理装置１５から映
像信号をサンプル信号として読み込み、このサンプル信
号から輝度平均値を求めて検出輝度とし、それが一定の
範囲内になるようにレーザ照射手段１のフィルタ切換装
置４及び光電変換手段１４、増倍管電源装置１３、ピン
ホール径制御装置１０を自動制御するものである。

【００１１】上記フィルタ切換装置４は、複数ある調光
フィルタ３のうち、所望のものに切り換えることでレー
ザ出力装置２から出射されるレーザ光の光軸上に選択的
に上記調光フィルタ３を配置し、レーザ光の透過率を決
定する。

【００１２】増倍管用電源１３は出力電圧を可変できる
ものであり、撮像素子である光電子増倍管１２に印加す
る電圧を調整制御して、増幅率を最適にする。また、ピ
ンホール径制御装置１０は光電子増倍管１２に入射する
光が通過するピンホール１１の径を調節する。抽出対象
の光の持つ波長により理想のピンホール径は異なるの
で、調整できるようにしているわけである。

【００１３】さらに自動調光装置１７は、フレームメモ
リを有しており、１画面分の画像信号を記憶して平均値
を求めるなどの演算を行い、光電変換によって得られた
映像信号の輝度平均値を算出する。

【００１４】また自動調光装置１７は、一定の輝度が得
られるような条件設定を、レーザ出力装置２から出射さ
せるレーザ光の強度と、光電子増倍管１２の印加電圧に
ついて各々求めておき、強度と印加電圧との関係を関数
テーブルとして予め登録しておく。

【００１５】すなわち、自動調光装置１７は、得られた
映像信号の輝度平均値を算出し、上記関数テーブルを用
いて、輝度平均値から調整すべきレーザ光の光強度、印
加電圧の設定を割り出し、各制御部に適した制御信号を
送出する。

【００１６】そして、制御信号を受けた各制御部は、調
光フィルタ３を切り換えてレーザ光の光強度を調整し、
ピンホール１１でのピンホール径を調整し、光電子増倍
管１２の印加電圧を変更して増幅率を調整することで、
結果として一定の明るさ（輝度）の画像を得るようにす
るものである。

【００１７】また、特願平１１−２６８７６０号におい
ては、レーザ光を低速走査させながら、Ａ／Ｄ変換のサ
ンプリング速度を従来の数倍から十数倍とし、一度の走
査で得られる複数の画像データをそれぞれ繰り返し加算
して、結果として従来のサンプリング速度と同等の速度
で明るい画像を得る技術が開示されている。以下、その
構成を図１２を用いて説明する。

【００１８】図１２に示す構成において、１９が光電子
増倍管であり、この光電子増倍管１９は、試料からの光
が結像される位置に配置され、光電変換により輝度情報
を電気信号に変換するもので、その出力がアンプ２０に
より所定の増幅率で増幅された後にＡ／Ｄ変換器２１に
てサンプリングされ、デジタル化される。

【００１９】入力が複数ある場合、つまり、同一の試料
に対して波長の異なる複数の励起光を同時に試料に照射
して、同時に複数の画像を得ようとする場合、上記光電
子増倍管１９、アンプ２０、及びＡ／Ｄ変換器２１で構
成される撮像系回路が入力数分、例えば入力数がｍであ
るとすればｍ系統分必要となる。ここで、ｍ系統分の各
撮像系回路をそれぞれ第１チャネル（CH１）〜第ｍチャ
ネル（CHｍ）と呼ぶことにする。

【００２０】各チャネル（CH１，CH２〜CHｍ）の各Ａ／
Ｄ変換器２１で得られるデジタル値の輝度信号が取り込
み制御部２２に入力される。

【００２１】取り込み制御部２２は、クロック発生部２
４からの基準クロックに基づき、各チャネルのＡ／Ｄ変
換器２１を制御して輝度信号をサンプリングすることに
より画像データとしてデジタル化して取り込む。

【００２２】すなわち、取り込み制御部２２は、入力チ
ャネル数を設定するための、図示しないレジスタを備え
ており、各チャネルのＡ／Ｄ変換器２１に対して並列に
サンプリングクロックを供給して同時に輝度信号のデジ
タル化を実行させ、出力タイミングを制御することでチ
ャネル毎に時分割に直列配列した画像データとして取り
込むもので、取り込んだ画像データは演算処理部２３に
送出する。

【００２３】取り込み制御部２２からの画像データを受
ける演算処理部２３は、同じくクロック発生部２４から
の基準クロックに基づいて動作するもので、受け付けた
画像データを各チャネル毎に任意回数分加算し、その加
算結果としての画像データを出力する。

【００２４】この場合、画像データを加算する回数は、
演算処理部２３内に図示しない加算回数レジスタを設け
て設定するようにしているので、任意に変更が可能であ
る。

【００２５】このようにして、演算処理部２３から加算
されて出力される画像データは、表示ドライバ２５の駆
動によりモニタ表示部２６で表示出力され、画像が観察
できる。

【００２６】また、他の手法として、図１３に示すよう
なアナログ回路を用い、光電変換によって得られた輝度
信号を時間で積分して輝度レベルを上げるようにしたも
のがある。同図はそのようなレーザ走査型顕微鏡の撮像
系（検出系）部分の構成を示すものであり、光電子増倍
管３１により光電変換されて得られた輝度信号を積分器
２７に入力し、一定時間積分した結果をＡ／Ｄ変換器２
８でサンプリングするというものである。

【００２７】積分器２７は、スイッチ（ＳＷ）２９が開
き、且つ、スイッチ（ＳＷ）３０が閉じた状態で積分さ
れる。スイッチ２９，３０は、共にパターン信号Ｐ１に
よって制御されるが、スイッチ２９がパターン信号Ｐ１
を直接入力するのに対して、スイッチ３０はパターン信
号Ｐ１をインバータ３２で反転して入力しているため、
その論理出力は各々相反する状態になる。

【００２８】積分器２７で積分された出力はＡ／Ｄ変換
器２８に入力され、サンプリングパターンＰ２によりサ
ンプリングされてデジタル化される。上記Ａ／Ｄ変換器
２８にてデジタル化された直後、パターン信号Ｐ１の制
御によりスイッチ２９を閉じ、スイッチ３０を開くこと
で、積分器２７のコンデンサＣに充電された電荷が放電
されて電圧がリセットされ、その後スイッチ２９を開
き、スイッチ３０を閉じて再び入力信号を積分する。

【００２９】このように以降この動作を繰り返す事で、
積分時間さえ定めておけば、一定期間毎に光電変換され
た信号の和をＡ／Ｄ変換器２８によってサンプリングす
ることができ、信号レベルが全体的に大きくなって、よ
り明るい画像が得られるようになる技術となる。

【００３０】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述し
た従来の各技術には、次のような問題がある。

【００３１】まず、上記図１１に示した技術では、画像
の輝度を上げるためにレーザ光の光強度や光電子増倍管
１２の増幅率を上げている。しかし、レーザ光の光強度
を上げると試料９の褪色を早め、試料によっては変質や
劣化などを引き起こすことになる。

【００３２】また、光電子増倍管１２の増幅率を上げる
ことからランダムノイズ発生の要因となり、さらに平均
輝度信号を算出して求めているために、処理時間を要
し、且つ、処理内容が複雑化する上に、関数テーブルを
用意せねばばならないことから、そのテーブル記憶のた
めの大きな記憶容量を必要とするなど、全体として顕微
鏡の構成が複雑で処理速度の遅いものとなってしまうと
いう不具合があった。

【００３３】次に、上記図１２に示した技術では、輝度
の高い明るい画像を得るためにレーザ光を低速走査させ
ながら、取り込み制御部２２から出力される複数の画像
データを一つの演算処理部２３で時分割処理して、対応
する画像データ毎に加算処理して出力する様にしてい
る。

【００３４】この場合、試料の合焦部分からの反射光、
や蛍光の画像データを加算するだけでなく光電子増倍管
１９や増幅器２０のアナログ系から出てくるランダムノ
イズまでも加算される。そして、これらの演算結果を画
像として表示する場合、表示最大輝度には上限があるの
で（例えば１２ビット）加算を繰り返していくうちに、
やがてある画素はその上限値に達する。そして、そのま
ま加算を続けていくと、既に上限値に達した画素データ
はそのまま上限値に張り付いたまま、他の画素データも
やがて上限値に達してしまう。

【００３５】つまり、データが次々と飽和してしまい、
その結果として加算数が増加するに従って、試料の合焦
部の画像が明るくなるのと同時に本来暗黒でなくてはな
らない非合焦部までもがランダムノイズの蓄積によって
明るくなり、画像全体が明るくなってコントラストの無
い画像になってしまう。つまり、本来画面上には試料の
合焦部の画像のみが明るく鮮明に表示されるべきもの
が、画面全体がランダムノイズの蓄積によって例えば白
くなってしまう問題がある。

【００３６】一方、上記図１３で示した技術では、アナ
ログ的な回路を設けているため、ノイズの影響を受け易
く、更に、温度依存性や部品の個々のばらつきによって
出力信号レベルが大きく変動する。その上，周波数特性
による出力信号の変動も無視できない。また、画像入力
が複数系統ある場合にはその数に相当する数だけ回路を
設ける必要があり、入力数が増えると回路規模が大きく
なるという不具合がある。

【００３７】さらに、積分器２７をリセットするために
放電を行うが、その間はスイッチ３０が開いているため
に入力信号を取り込むことができず、信号の損失を招い
ている。

【００３８】これに対し、過渡応答であるリセット期間
を極力短くしたり、リセット電圧を完全に“０”にする
など、性能向上を図ることも考えられるが、そのために
は図１３で示した回路に様々な付加回路を設ける必要が
生じ、構成が大規模で複雑なものになってしまう。

【００３９】そこで、本発明は上記の事情に鑑みてなさ
れたもので、その目的とするところは、試料に対するダ
メージを少なくしつつも、ランダムノイズの影響を回避
して、良好な画像を表示できるようにしたレーザ走査型
顕微鏡を提供することにある。

【００４０】また、本発明は、複数の入力、例えば、同
一の試料に対して波長の異なる複数の励起光（レーザ
光）を同時に試料に照射して、同時に波長域の異なる複
数種の画像を得ようとする場合にも対応できると共に、
明るく鮮明な画像を得ることが可能なレーザ走査型顕微
鏡を提供することにある。

【００４１】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明は次のように構成する。

【００４２】レーザ光を観察対象の試料に集束させて照
射させると共に前記レーザ光は試料に対して走査させ、
試料から得られた光を光電変換手段により検出すること
により前記走査の各位置毎の光検出出力を画素データと
して得て前記試料の画像を得るようにしたレーザ走査型
顕微鏡において、 ［１］第１には、サンプリング周期変更可能であって、
前記走査の各位置毎に前記光電変換手段の光検出出力
を、設定サンプリング周期対応にサンプリングする手段
と、このサンプリングされて得られた前記走査位置にお
ける光検出出力を平均化してその位置での画素データと
する演算手段と、所望の平均化数を設定するとその設定
した数対応に前記サンプリング周期を変更する変更手段
とを具備する。

【００４３】このような構成とすれば、光電変換手段に
よって得られた各画素のデータを各画素位置毎に所望の
サンプリング回数分サンプリングして平均化すること
で、光電子増倍管や増幅器の増幅率を増大させてもラン
ダムノイズの影響を抑えることができるようになる。従
って、良好な画像を得ることができる。

【００４４】［２］また、第２には、所望の増幅率およ
び平均化数を設定する手段と、前記光電変換手段の光検
出出力を前記設定増幅率対応に増幅して出力する手段
と、この増幅された光検出出力をサンプリングするもの
であって、前記走査の各位置毎に前記光検出出力を前記
設定平均化数に対応するサンプリング周期でサンプリン
グする手段と、このサンプリングされて得られた前記走
査位置における光検出出力を平均化してその位置での画
素データとする演算手段とを具備する。

【００４５】このような構成とすれば、光電変換手段に
よって得られた各画素のデータを各画素位置毎にユーザ
設定の平均化数で定まる所望のサンプリング回数分サン
プリングして平均化することで、光電子増倍管や増幅器
の増幅率を増大させてもランダムノイズの影響を抑える
ことができるようになる。従って、画像を明るくするた
めに増幅率を増大させても、ランダムノイズの影響は抑
圧されるので、明るく良好な画像を得ることができる。

【００４６】［３］また、第３には、レーザ光を観察対
象の試料に集束させて照射させると共に前記レーザ光は
試料に対して走査させ、試料から得られた光を分光手段
により分光させて光電変換手段により受光量に応じた光
検出出力信号に変換させることにより、波長別のデータ
を得るようにしたレーザ走査型顕微鏡において、前記光
電変換手段は複数設けて複数系統構成とすると共に、ま
た、前記各系統別に所望の増幅率および平均化数を設定
する手段と、前記各系統別の光電変換手段の光検出出力
信号を前記設定増幅率対応に増幅して出力する手段と、
この増幅された各系統別の光検出出力信号をそれぞれサ
ンプリングするものであって、前記走査の各位置毎に前
記光検出出力信号を前記設定平均化数に対応したサンプ
リング周期でサンプリングする手段と、このサンプリン
グされて得られた前記走査位置における前記各系統別光
検出出力信号をそれぞれ系統別に平均化してその位置で
の画素データとする演算手段とを具備する。

【００４７】この構成によれば、レーザ光を観察対象の
試料に集束させて照射させると共に前記レーザ光は試料
に対して走査させ、試料から得られた光を分光手段によ
り分光させて光電変換手段により受光量に応じた光検出
出力信号に変換させることにより、波長別のデータを得
るが、検出系を構成する光電変換手段は複数系統あり、
各系統別に入射光の波長域が異なるものとなっている。

【００４８】そして、各系統別の光電変換手段から出力
される検出出力はそれぞれ各画素位置毎にユーザ設定の
平均化数で定まる所望のサンプリング回数分サンプリン
グして平均化することで、光電子増倍管や増幅器の増幅
率を増大させても、ランダムノイズの影響を抑えること
ができるようになる。

【００４９】前記増幅度と前記サンプリング回数は所望
に設定可能であり、また、各系統別の画素データは対象
の波長域が系統毎に異なったものとなっていて、波長域
別の画像を得ることになるが、それぞれの波長域別の生
成画像のうち、明るさが不足する波長域の画像がある場
合には、その波長域の系統の前記増幅度を高く設定する
ことで信号レベルをアップして明るさを確保することが
できる。そして、この場合に、その系統における前記サ
ンプリング回数を高く設定することにより、増幅度アッ
プにより生じるランダムノイズの影響をサンプリング回
数の増大と平均化処理により、抑制することができる。
従って、各波長域それぞれの画像は一定した画質が確保
できるようになる。

【００５０】

【発明の実施の形態】本発明は、光電変換素子から出力
される各画素のデータを所望の回数で平均化すると共
に、その平均化数に応じて光電変換素子から出力される
画素のデータをＡ／Ｄ変換するサンプリング周波数を変
更することで、平均化数によって描画速度が低下するこ
とのないようにすると共に、ランダムノイズが低減され
るようにしたもので、以下、詳細を説明する。

【００５１】（第１の実施の形態）以下、本発明の実施
の形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照
して説明する。

【００５２】図１は、本発明の第１の実施形態に係わる
一例としての共焦点レーザ走査型顕微鏡の構成を示す図
である。図において、１０１は所望の波長のレーザ光を
発振出力するレーザ光源である。１０２はこのレーザ光
源１０１から出射されたレーザ光束（レーザ光）であ
る。

【００５３】１０３はビームエキスパンダであり、レー
ザ光源１０１から出射されたレーザ光束１０２を、対物
レンズ瞳径に略一致するように光束径を拡大させるため
の光学系である。１０４はレーザラインフィルタであっ
て、予め設定した所望の波長の光を選択的に透過させる
フィルタである。また、１０５はダイクロイックミラー
であって、特定波長帯の光を反射し、他は透過させる光
学特性を持つハーフミラーである。

【００５４】また、１０６はＸ−Ｙ走査光学系であっ
て、例えば、Ｘ軸用のガルバノミラー、Ｙ軸用のガルバ
ノミラーにより構成され、それぞれの軸用のガルバノミ
ラーを駆動操作することで、試料面に対してレーザ光を
Ｘ−Ｙ走査することができるようになっている。

【００５５】１０７は瞳投影レンズ、１０８は結像レン
ズ、１０９は対物レンズ、１１０は試料（標本）であ
る。試料１１０は目的に応じた試薬で染色してある。対
物レンズ１０９は試料１１０に近接して進退調整可能で
あって、試料１１０に対する光学系の焦点を合わせるた
めのレンズであり、結像レンズ１０８および瞳投影レン
ズ１０７はその光軸を対物レンズ１０９の光軸に一致さ
せて配されている。

【００５６】また、１１１は共焦点レンズ、１１２は共
焦点絞り、１１３はコリメートレンズ、１３０は検出
系、１４０は処理・制御系である。

【００５７】検出系１３０は試料１１０における現在の
レーザ光走査位置からの光を共焦点レンズ１１１、共焦
点絞り１１２、コリメートレンズ１１３を介して受けて
その光強度対応の輝度信号を得るものであり、撮像部を
構成するものである。

【００５８】ダイクロイックミラー１０５は試料１１０
からの光を検出系１３０側に導く光学経路上であって共
焦点レンズ１１１とＸ−Ｙ走査光学系１０６との間の光
路にその面を斜めにして配置され、レーザラインフィル
タ１０４を介してレーザ光源１０１から導かれたレーザ
光束１０２を、ここで反射させて試料１１０側に導くと
共に、試料１１０側からの光を共焦点レンズ１１１側に
導くよう、レーザ光源１０１の光軸上との交点に配置し
てある。

【００５９】共焦点レンズ１１１は試料１１０に対する
対物レンズ１０９の焦点位置と共役な焦点位置を持つレ
ンズであり、共焦点絞り１１２はこの共焦点レンズ１１
１の共焦点位置に配置された絞りである。共焦点絞り１
１２はピンホールの役割を担うものであり、抽出対象の
光の持つ波長により理想のピンホール径は異なるので、
調整できるよう、絞りとしてある。

【００６０】試料１１０から放出される（蛍光）放射は
試料における観察対象物部分と共役な平面内に位置する
この共焦点絞り１１２上へ焦点を結ぶので、この共焦点
絞り１１２を通った光がコリメートレンズ１１３を介し
て検出系１３０に入射し、検出される仕組みである。

【００６１】Ｘ−Ｙ走査光学系１０６はダイクロイック
ミラー１０５と、瞳投影レンズ１０７との間の光路中に
配され、所定の範囲内で光路を光学的に移動させること
ができるものである。

【００６２】尚、レーザ光はＸ−Ｙ走査光学系１０６に
より試料１１０に対してＸ−Ｙ走査するものであり、あ
る瞬間でのレーザ光により励起された試料からの蛍光の
検出系１３０での検出出力は、レーザ光が照射された位
置での蛍光（或いは反射光）、すなわち、その画素位置
での蛍光（或いは反射光）の持つ光強度対応の検出信号
と言うことになり、その位置における輝度を示す画素信
号ということになる。レーザ光はＸ−Ｙ走査光学系１０
６により試料１１０上をＸ−Ｙ走査されるので、その時
々の走査位置における検出出力を収集していくと、１画
面分の画像データが得られることになる。

【００６３】本実施形態の顕微鏡は、レーザ光照射によ
る試料のダメージを最小限にとどめるために、レーザ光
の強度を必要最小限に抑える。そして、光電子増倍管の
電圧を高めて増幅度を高めると共に、光電子増倍管の出
力を更に増幅する増幅器の増幅度を高めて十分なレベル
の輝度信号を得るようにし、更にこれら増幅により増大
するノイズは信号の平均化処理により抑圧するようにし
て、明るく鮮明な画像を得ることができるようにする。

【００６４】そのために、本実施例では、検出系１３０
および処理・制御系１４０では次のように構成してい
る。

【００６５】図２は本発明のレーザ走査型顕微鏡の検出
系１３０および処理・制御系１４０の構成例を示すブロ
ック図である。図において、１３０は前述の検出系であ
り、この検出系１３０は、光電変換素子である３３の光
電子増倍管、その出力増幅用の３４の増幅器、そして、
増幅済み出力のサンプリングを行うための３５のＡ／Ｄ
変換器とから構成される。

【００６６】また、前記処理・制御系１４０は、３６の
演算部、３７のＩ／Ｆ（インタフェース）部、３８のコ
ンピュータ（パソコン）、３９のクロック制御部、４０
のアドレス発生部、４１の波形メモリ、４２のＤ／Ａ変
換器とより構成される。

【００６７】前記光電子増倍管３３は、試料１１０から
の光が結像される位置、すなわち、コリメートレンズ１
１３の後段側に配置され、入射された光を光電変換する
ことで、輝度情報を電気信号に変換するもので、その出
力が増幅器３４により所望の増幅率で増幅された後にＡ
／Ｄ変換器３５にてサンプリングされ、デジタル化され
る構成である。増幅器３４は利得可変型であり、ユーザ
指定の増幅率で増幅できる構成である。

【００６８】前記Ａ／Ｄ変換器３５は、アナログ信号と
して入力された増幅器３４からの信号を例えば、１２ビ
ット構成のデータに変換して出力するものである。

【００６９】前記処理・制御系１４０における演算部３
６は、検出系１３０におけるこのＡ／Ｄ変換器３５によ
ってデジタル化された輝度情報を、各画素に対して指示
された回数分、サンプリングして平均化処理するもの
で、具体的にはユーザが所望に回数指定することによ
り、各画素各々についてその輝度値を前記指定回数だけ
サンプリングして加算し、加算が終了したところで前記
指定回数の値で割り算してその結果を出力するものであ
る。

【００７０】例えば、ユーザが設定した平均化の指示値
が“４”であった場合は、演算部３６はこの指示値を受
けて、各画素毎にその輝度値を４回サンプリングして足
し合わせ、その後に“４”で割ってその画素の輝度値の
データとして出力する。

【００７１】Ｉ／Ｆ部３７は演算部３６によって平均化
された各画素のデータをコンピュータ３８が扱える形式
及び信号タイミングに変換するものである。

【００７２】コンピュータ３８はＩ／Ｆ部３７にて出力
された各画素のデータをもとにコンピュータ３８のモニ
タ画面上に試料像として表示する。更に、コンピュータ
３８は光電子増倍管３３の印加電圧や増幅器３４の増幅
率を制御し、また、演算部３６やクロック制御部３９に
平均化数を信号Ａとして指示すると言った機能を有す
る。従って、ユーザは光電子増倍管３３の印加電圧や増
幅器３４の増幅率、そして、平均化数をコンピュータ３
８の入力装置の操作により所望に入力指示することがで
きる。

【００７３】クロック制御部３９はＡ／Ｄ変換器３５、
演算部３６、アドレス発生部４０に対して必要な各種制
御クロックを、コンピュータ３８の制御（指示）のもと
に発生するものである。

【００７４】アドレス発生部４０は、カウンタなどから
構成され、クロック制御部３９より出力されたクロック
信号Ｇから波形メモリ４１を動作させるためのアドレス
を発生させるものである。

【００７５】波形メモリ４１は、ガルバノミラー４３を
動作させるためのサイン波（Sin wave）もしくは鋸歯
状波のデータが波形のサンプリング順に、順次、アドレ
ス位置を変えながら書き込まれており、アドレス発生部
４０の出力するアドレス信号を受けて当該アドレス発生
部４０の指し示すアドレスに書きこまれている波形デー
タを読み出し、出力する構成となっている。

【００７６】Ｄ／Ａ変換器４２はデジタル信号をアナロ
グ信号に変換するためのものであり、波形メモリ４１か
ら出力された波形データをアナログ信号に変換して出力
してガルバノミラー４３に与え、これを駆動するための
ものである。

【００７７】ガルバノミラー４３は、Ｘ−Ｙ走査光学系
１０６の構成要素であって、回動可能に保持されたミラ
ーと入力信号対応にこのミラーを回動駆動させる駆動系
とを有して、Ｄ／Ａ変換器３５からの信号対応にミラー
を駆動させることにより、ミラーに入射するレーザ光を
あるそのミラーにより反射させることでレーザ光の走査
を行うものあり、入射レーザ光を回転角度を持ったミラ
ーで振ることによって試料１１０上を走査するものであ
る。

【００７８】なお、図２では、ガルバノミラーは一つと
なっているが、試料上にレーザ光を走査する場合は、Ｘ
軸用，Ｙ軸用の二つのミラーを同時に動作させて２次元
走査させる。動作原理が同じであるため、本実施の形態
の図２では、片方のガルバノミラー駆動系は省略する。

【００７９】次に、本実施の形態に係るレーザ走査型顕
微鏡の具体的な動作について説明する。

【００８０】いま、所望の試薬により染色した試料１１
０を対物レンズ１０９の下に置き、対物レンズ１０９の
焦点を合わせる。

【００８１】その後、レーザ光源１０１からレーザ光を
出射させる。レーザ光源１０１から出射されたレーザ光
束１０２は、ビームエキスパンダ１０３により対物レン
ズ瞳径に略一致するように光束径が拡大される。そし
て、レーザラインフィルタ１０４を介してダイクロイッ
クミラー１０５へと導かれる。

【００８２】レーザラインフィルタ１０４では所要の波
長成分を選択的に透過させる。すなわち、試料１１０は
試薬で標識されており、その試薬を効率よく励起あるい
はその試薬に良く反応して蛍光を発生させることのでき
る波長帯のレーザ光を抽出するのがこのレーザラインフ
ィルタ１０４の役割である。レーザラインフィルタ１０
４を透過したレーザ光はダイクロイックミラー１０５で
反射され、Ｘ−Ｙ走査光学系１０６、瞳投影レンズ１０
７、結像レンズ１０８、対物レンズ１０９を経て試料１
１０に達する。

【００８３】ここで、試料１１０に対するレーザ光集束
点は対物レンズ１０９で定まり、試料１１０上でのレー
ザ光集束位置はレーザ光をＸ−Ｙ走査するためのＸ−Ｙ
走査光学系１０６によるＸ−Ｙ走査位置（すなわち、ガ
ルバノミラー４３による反射方向位置）により定まる。

【００８４】試料１１０は試薬で標識されており、その
試薬を効率よく励起する波長帯のレーザ光が試料１１０
に照射されることにより、その照射点となった試料１１
０からは反射光もしくはレーザ光による励起によって蛍
光が生じる。試料１１０からの反射光および蛍光からな
る光束１２０は、対物レンズ１０９、結像レンズ１０
８、瞳投影レンズ１０７、Ｘ−Ｙ走査光学系１０６、を
経てダイクロイックミラー１０５に戻る。そして、光束
１２０はダイクロイックミラー１０５を透過し、ここ
で、元のレーザ光波長成分の光が除去されて、反射光ま
たは蛍光成分の光のみとなり、これはさらに共焦点レン
ズ１１１を透過し、前記試料１１０の前記照射点となっ
た位置からの光が集束されて共焦点絞り１１２の側に焦
点を結ぶ。そして、その集束点にある共焦点絞り１１２
により、前記試料１１０の前記照射点となった位置から
の光が取り出され、それ以外は共焦点絞り１１２の絞り
開口部（ピンホール）から外れることにより除去され
る。共焦点絞り１１２を通過した光はコリメートレンズ
１１３によりコリメート（平行光線化）され、検出系１
３０へと入る。

【００８５】検出系１３０では、この入射光は、光電子
増倍管３３により光量対応の電気信号に変換され、増幅
器３４で増幅された後、Ａ／Ｄ変換器３５によりデジタ
ル変換されて輝度対応の画素データとなる。そして、演
算部３６で画素別に平均化処理演算され、Ｉ／Ｆ部３７
を介してコンピュータ３８に与える。Ｘ−Ｙ走査光学系
１０６によりレーザ光は試料１１０上を走査されるの
で、１画面分の走査が終わった段階で１画面分の画素デ
ータが揃う。例えば、１画面の画像サイズが１０２４×
１０２４画素構成であれば、Ｘ軸方向に１０２４ステッ
プ、Ｙ軸方向に１０２４ステップ、シフトされた段階で
１画面分の画素が揃う。

【００８６】コンピュータ３８では、各画素のデータを
もとにコンピュータ３８のモニタ上に試料像として画像
表示する。

【００８７】ここで、本システムは、レーザ光照射によ
る試料１１０の受ける褪色などのダメージを抑制しつつ
も、ランダムノイズの影響を回避して、良好な画像を表
示できるようにすることを目指している。

【００８８】そのため、本レーザ走査型顕微鏡は光電変
換素子から出力される各画素のデータを所望の回数で平
均化すると共に、その平均化数に応じて光電変換素子か
ら出力される画素のデータをＡ／Ｄ変換するサンプリン
グ周波数を変更することで、平均化数によって描画速度
が低下することのないようにすると共に、ランダムノイ
ズが低減されるようにしている。

【００８９】従って、この特徴部分の動作の詳細を次に
説明する。

【００９０】試料のダメージを抑制するには、試料に当
てるレーザ光を弱くすれば良い。しかし、弱くすると輝
度が低下するので、画像が見にくくなる。光を検出する
のは光電子増倍管であるから、光電子増倍管３３の増幅
率やその出力を増幅する増幅器３４の増幅率を高めれば
画像を明るくできるが、今度は増幅度を高めたためにラ
ンダムノイズの影響が大きくなる。そこで、本実施形態
では、増幅度を高めることによるランダムノイズの影響
を、平均化によりノイズ抑圧することで、小さくする。

【００９１】光電子増倍管３３によって得られる画素の
データを、同一画素位置での検出回数を複数回にして検
出し、その検出値を平均化することで、光電子増倍管３
３や増幅器３４の増幅率を増大させてもランダムノイズ
の影響を抑えることができ、また、平均化の度合いに応
じて各画素のデータをＡ／Ｄ変換するサンプリング周期
を変更することにより、描画速度を落とすことなく明る
く良好な画像を得ることができるようにする。

【００９２】具体的には、ガルバノミラー４３が、ある
位置にとどまっている間に、その画素位置での輝度信号
を予め設定した指定回数分、サンプリングし、得られた
指定回数分のサンプリングデータを加算してから前記指
定回数で除算することで、その画素位置での画素のデー
タを平均値として得るようにする。

【００９３】すなわち、本顕微鏡においては、まず、は
じめに、ユーザは、コンピュータ３８の入力装置を操作
して光電子増倍管３３の印加電圧及び増幅器３４の増幅
率を設定し、また、平均化数を設定する。すると、コン
ピュータ３８からは前記設定された印加電圧の値対応
に、光電子増倍管３３の印加電圧指示信号として信号Ｅ
が、また、前記設定された増幅率の値対応に増幅器３４
の増幅率指示信号として信号Ｆが、また、前記設定され
た平均化数の値対応に平均化数指示信号として信号Ａが
出力される。

【００９４】そして、コンピュータ３８からの平均化数
指示信号としての信号Ａはクロック制御部３９に与えら
れ、これにより、クロック制御部３９は信号Ａ対応のク
ロックを発生することとなる。このクロック信号はクロ
ック信号Ｂ，Ｃ，Ｄ、およびＧである。

【００９５】これらのうち、Ａ／Ｄ変換器３５にはクロ
ック信号Ｂがサンプリングクロック信号として、また、
演算部３６にはクロック信号Ｃがデータ取り込みクロッ
ク信号として、また、クロック信号Ｄがデータ出力クロ
ック信号として与えられ、そして、アドレス発生部４０
にはクロック信号Ｇがアドレス発生クロック信号として
与えられる。

【００９６】アドレス発生クロック信号Ｇをアドレス発
生クロック信号として受けたアドレス発生部４０では、
図３に示すように波形メモリ４１のデータを読み出すた
めのアドレス信号Ｈを出力する。アドレス発生部４０で
は、アドレス信号Ｈはアドレス発生クロック信号Ｇが１
クロック入力される毎に１アドレスずつインクリメント
してゆくことで、逐次、アドレスを進めていく。

【００９７】波形メモリ４１はアドレス発生部４０から
出力されたアドレス信号Ｈを受けると、図３に示すよう
に指定されたメモリアドレスに格納されている波形デー
タＩを出力する。

【００９８】この波形データＩは予め数値解析ソフトウ
エアなどで波形の形状を検討した後、デジタルデータ化
してこの波形メモリ４１に書き込まれているものであ
る。

【００９９】波形メモリ４１から出力されたデジタル波
形データＩは、Ｄ／Ａ変換器４２にてアナログ信号に変
換されて駆動信号Ｊとなり、Ｘ−Ｙ走査光学系１０６を
構成するガルバノミラー４３を駆動する。

【０１００】Ｄ／Ａ変換器４２にて変換されて得られる
駆動信号Ｊは、例えば図４に示すような鋸歯状に近い波
形となる。このような駆動信号Ｊをガルバノミラー４３
に印加することにより、図示しないが、ガルバノミラー
４３は内部に組み込まれたガルバノモータなどによって
この駆動信号Ｊ対応に規定角度内で左右に振動すること
となる。

【０１０１】このようにして、レーザ光は試料１１０上
を走査されることになる。

【０１０２】次に、クロック制御部３９が、コンピュー
タ３８の制御（指示）のもとに出力するサンプリングク
ロック信号Ｂと、アドレス発生部４０に出力されるアド
レス発生クロック信号Ｇの位相関係について図５を用い
て説明する。

【０１０３】図５の（ａ）に示す状態では、サンプリン
グクロック信号Ｂとアドレス発生クロック信号Ｇが同一
周期となっている。この場合、アドレス発生クロック信
号Ｇの周波数は例えば１２５［ｋHz］に設定されてい
る。従って、サンプリングクロック信号Ｂの周波数も１
２５［ｋHz］である。

【０１０４】このことは、ガルバノミラー４３が１ステ
ップ動く毎にその画素位置における試料１１０からの放
出光の光電子増倍管３３による光電変換出力の、増幅器
３４による増幅後の輝度情報を１回サンプリングするこ
とを意味する。すなわち、画素毎に１回のサンプリング
で輝度情報を得ていくことになる。

【０１０５】この状態は、通常のサンプリング状態であ
り、平均化処理を行っていない状態である。ガルバノミ
ラー４３は、アドレス発生クロック信号Ｇの立ち上がり
エッジで１ステップ駆動され、Ａ／Ｄ変換器３５はサン
プリングクロック信号Ｂの立ち上がりエッジにてサンプ
リングされる。

【０１０６】一方、図５の（ｂ）に示す状態では、アド
レス発生クロック信号Ｇの１周期に対して、サンプリン
グクロックが２倍の周期で出力されている。

【０１０７】つまり、ガルバノミラー４３が、ある位置
にとどまっている間に、その画素位置における輝度信号
を２回サンプリングすることとなる。同様の解釈によ
り、図５の（ｃ）では、４回のサンプリング、図５の
（ｄ）では８回のサンプリングとなる。

【０１０８】続いて、クロック制御部３９がコンピュー
タ３８の制御（指示）のもとに発生するサンプリングク
ロック信号Ｂ、データ取り込みクロック信号Ｃ、データ
出カクロック信号Ｄ、アドレス発生クロック信号Ｇの位
相関係について、図６を用いて説明する。

【０１０９】図６の（ａ）に示す例は、平均化数が
“２”に設定された場合の各信号の位相関係である。

【０１１０】この場合、サンプリングクロック信号Ｂは
アドレス発生クロック信号Ｇの二倍の周期で動作してい
る。演算部３６に送出されるデータ取り込みクロック信
号Ｃはサンプリングクロック信号Ｂと同周期であるが、
わずかに遅れて出力されている。

【０１１１】これは、Ａ／Ｄ変換器３５がサンプリング
クロック信号Ｂによって各画素の輝度データをサンプリ
ングしたあと、デジタルデータとして出力するのに変換
ディレイ（例えば１０［ｎｓ］程度）が発生するからで
ある。データ取り込みクロック信号Ｃは、このディレイ
を考慮されて出力されており、演算部３６が正しくデジ
タルデータを取り込むことができるようになっている。

【０１１２】データ出力クロック信号Ｄは、パルス状の
信号となっており、演算部３６が二回目のデジタルデー
タの取り込みを終了した時点で出力され、この信号によ
って演算部３６はI／Ｆ部３７に平均化されたデータを
出力する。

【０１１３】図６の（ｂ）の例は平均化数が“４”に設
定された場合、図６の（ｃ）の例は平均化数が“８”に
設定された場合を示し、平均化数“２”の場合と同様の
解釈で理解できる。

【０１１４】続いて、演算部３６の内部構成について、
図７を用いて説明する。図に示すように、演算部３６
は、加算器４４、平均化手段４５、データ保持器４６，
４７で構成されている。

【０１１５】これらのうち、加算器４４は例えば２０ビ
ットのビット幅を持ち、Ａ／Ｄ変換器３５が出力するデ
ータ（１２ビット）やコンピュータ３８によって表示で
きる最大輝度値（１２ビット）よりも十分大きいデータ
を処理できるようになっている。

【０１１６】このように、検出系１３０の構成要素であ
るＡ／Ｄ変換器３５の出力するデータ（１２ビット）
や、画像としての表示最大輝度値（１２ビット）よりも
大きなデータを処理できるようにすることで、広いダイ
ナミックレンジを確保できるようにし、以て正確な演算
が行えるようになっている。さらに加算器４４は、扱え
る上限を演算結果が超えた場合、扱える最大値（ＦＦＦ
ＦＦｈ）（但し、ｈは１６進表記であることを示す符
号）を出力できるようになっている。つまり、１６進５
桁のサイズである。

【０１１７】また、平均化手段４５は加算器４４で加算
された結果Ｍを、コンピュータ３８からの平均化数指示
信号Ａで与えられる数（平均化数）に基づき割り算し、
結果をＮとして出力するものである。なお、Ｄはクロッ
ク制御部３９からのクロック信号であり、平均化手段４
５はこのクロック信号Ｄに同期して上記処理を行う。

【０１１８】データ保持器４６，４７はフリップフロッ
プなどで構成されており、クロック制御部３９からのク
ロック信号Ｃがクロック入力端子に入力されるまで、デ
ータ端子Ｄに入力されたデータの状態レベルを保持して
その保持データを肯定側出力端子Ｑから出力するもので
ある。

【０１１９】このうちデータ保持器４６は２０ビットの
データを扱うようになっており、データ保持器４７はＡ
／Ｄ変換器の１２ビットデータを２０ビットに拡張して
信号Ｌとして出力できるようになっている。

【０１２０】この演算部３６の内部動作について図８を
用いて説明する。図８の例は、平均化数が“２”に設定
された場合を示している。まず、全体の初期化が行われ
ると、加算器４４の出力信号Ｍ、データ保持器４６，４
７それぞれの肯定側出力端子Ｑの出力信号Ｋ，Ｌ及び平
均化手段４５の出力信号Ｎは“０”に初期化される。

【０１２１】次に、データ取り込みクロック信号Ｃの立
ち上がりエッジ（図８の信号Ｃで「１」と示されている
部分）でＡ／Ｄ変換器３５からのデジタル化された各画
素の輝度値を示す画素データをデータ保持器４７で取り
込む（信号Ｌは「００ＦＦＦｈ」となる）。それと同時
に加算器４４は信号Ｌと信号Ｋを加算してその加算結果
を信号Ｍとして出力する。

【０１２２】しかし、まだ、信号Ｋの内容は“０”であ
るため、加算結果は信号Ｌの値のみの「００ＦＦＦｈ」
となる。次のデータ取り込みクロック信号Ｃ（図８の信
号Ｃで「２」と示されている部分）により、データ保持器
４６に先の加算器４４の加算結果である信号Ｍの値「０
０ＦＦＦｈ」が取り込まれ、信号Ｋに「００ＦＦＦｈ」が
出力される。

【０１２３】それと同時にデータ保持器４７は、Ａ／Ｄ
変換器３５から次のデータを取り込み、信号Ｌを出力す
る（図８では「００ＦＦＣｈ」）。この結果、加算器４
４には「００ＦＦＦｈ」と「００ＦＦＣｈ」が入力され
て両者を加算演算が行われることになり、加算器４４は
その演算結果である「０１ＦＦＢｈ」を信号Ｍとして出
力する。この直後に、データ出力クロック信号Ｄが平均
化手段４５に入力されると（信号Ｄであって、丸で囲ん
だ数字１の符号で示す位置の信号）、平均化手段４５は
コンピュータ３８から与えられる平均化数指示信号Ａの
値（この場合は“２”）に基づき、信号Ｍのデータ「０
１ＦＦＢｈ」を“２”で割って「００ＦＦＤｈ」を信号
Ｎとして出力する。それと同時に、データ保持器４６，
４７はリセットされ、このリセットにより信号Ｋ，Ｌ，
Ｍは“０”となる。

【０１２４】これを繰り返すことによって各画素それぞ
れのデータの平均化処理が行われる。平均化数が“４”
の場合や“８”の場合なども、全く同様の処理によって
平均化処理が行われる。

【０１２５】演算部３６によって平均化処理されて得ら
れる各画素のデータは、信号ＮとしてＩ／Ｆ部３７に送
られ、コンピュータ３８が扱うことのできるデータ形式
（１２ビット）や信号タイミングに変換処理される。そ
して、その信号はコンピュータ３８に送られ、試料の画
像が当該コンピュータ３８のモニタ画面上に表示され
る。

【０１２６】ユーザは、この画面を見て、表示されてい
る試料の画像がまだ所望の明るさに達していない場合
は、コンピュータ３８を操作してさらに光電子増倍管３
３の印加電圧や、増幅器３４の増幅度を増大するように
設定変更すると同時に、ランダムノイズの影響を抑える
ために平均化数も増やすように設定変更して最適画像が
得られるようにする。

【０１２７】本実施形態は、画像を検出する検出系１３
０の増幅率を所望に大きく設定可能にすると共に、増幅
率を増大することにより増大するノイズを抑制するため
の対策として、検出系１３０により得る画素毎の輝度デ
ータのサンプリング回数を増大させるようにし、その平
均値を求めてその画素の輝度データとすることによっ
て、顕微鏡の合焦部の画像のように常に輝度情報を持っ
ている部分の情報は残り、ランダムノイズのように現れ
たり現れなかったりを繰り返す無秩序な輝度情報は平均
化により消失する方向に収束してゆくことを利用したも
のである。

【０１２８】そして、レーザ走査して得られた試料の画
像が暗い時に、検出系の光電変換手段として用いられて
いる光電子増倍管の印加電圧を増大させたり光電変換手
段の出力を増幅する増幅器の増幅度を増大させて対処す
るが、このようにしても、光電変換手段によって得られ
る各画素のデータについてそのサンプリング周期を上げ
て多数回取得し、それを平均化することで、ランダムノ
イズの影響を抑えることができ、また、平均化の度合い
に応じて各画素のデータをＡ／Ｄ変換するサンプリング
周期を変更することにより、描画速度を落とすことなく
明るく良好な画像を得ることができるようになるもので
ある。さらに、また、画像を明るくするための手法はも
っぱら増幅率を増大させることでにより得る方式である
から、レーザ光の強度上げて試料に照射する必要がな
く、従って、強力なレーザ光照射による試料の腿色や劣
化、変質をもたらす心配も無いと言う効果もある。

【０１２９】また、平均化処理はデジタル演算処理によ
り行う方式であり、アナログ処理系を用いていないた
め、アナログ処理系の抱える回路の温度依存性の影響と
云ったものは回避できるだけでなく、アナログ処理系の
抱える周波数特性も犠牲にすることが無いと言う効果も
ある。

【０１３０】なお、本実施の形態においては、各画素の
輝度データを得るに当たって、指定された平均化数対応
数だけ、サンプリングし、得られたデータ値を加算した
後に前記平均化数で割り算したが、平均値を得ることが
できれば良いわけであるから、割り算した後に加算をす
る計算法であっても良い。

【０１３１】以上はレーザ走査型顕微鏡において、試料
に対する刻々のレーザ走査位置における輝度情報検出
（サンプリング）を複数回実施し、その平均値を得てそ
の位置における輝度信号とすることで、試料に対する照
射レーザ光の強さを緩和し、かつ、輝度情報の検出の際
の得られる輝度信号の増幅度を増大してもランダムノイ
ズの影響を小さく抑制できるようにしたものであった。
ところで、試料を染色する試薬により、放出される光の
波長が異なる。そして、多種類の試薬で染色した試料を
波長域別の画像として表示するような場合、波長域毎に
明るさが異なったものとなることが多い。そのような場
合に、各波長域の画像間でそれぞれ一定した画質が得ら
れるようにする必要がある。

【０１３２】つまり、同一の試料に対して波長の異なる
複数の励起光を、例えば、同時に試料に照射して、同時
に複数の画像を得ようとする場合、各波長域の画像間で
それぞれ同じような一定した画質の画像が得られるよう
にする必要がある。

【０１３３】従って、次に波長域対応光電子増倍管を用
意してそれぞれの出力を調整できるようにすると共に、
それぞれで平均化数を調整できるようにすることで、試
薬対応の放出光による各画像を画像間で一定した画質
で、しかもノイズの影響のない高画質画像として得るこ
とができるようにした例を第２の実施の形態として説明
する。

【０１３４】（第２の実施の形態）以下、本発明の、第
２の実施の形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図
面を参照して説明する。

【０１３５】図９は、本発明の第２の実施の形態に係る
レーザ走査型顕微鏡の全体的な構成例を示す図であり、
また、図１０は第２の実施の形態に係るレーザ走査型顕
微鏡における検出系１３０および処理・制御系１４０の
構成例を示すブロック図である。基本的には図１および
図２で示した第１の実施の形態での構成例と同じである
ので、第１の実施の形態と同じ構成や信号については同
様の番号を付し、その説明は省略する。

【０１３６】本実施形態においては、入力が複数ある場
合、例えば、同一の試料に対して波長の異なる複数の励
起光（レーザ光）を同時に試料に照射して、同時に波長
域の異なる複数の画像を得ようとするような用途の場合
を想定しており、この場合、レーザ光源１０１としては
異なる複数種の光源を用いると共に、第１の実施形態に
おいて１系統としていた検出系１３０は１３０Ａ，１３
０Ｂ，〜１３０Ｆの複数系統とし、試料１１０における
現在のレーザ光走査位置からの光を共焦点レンズ１１
１、共焦点絞り１１２、コリメートレンズ１１３を介し
て分光用のプリズム１１５で受けて分光させ、レンズ１
１３を介して検出系１３０Ａ，１３０Ｂ，〜１３０Ｆに
導く構成としてある。プリズム１１５で分光させること
により、試料からの放出光は波長対応に分けられるの
で、検出系１３０Ａ，１３０Ｂ，〜１３０Ｆはその各分
光された光の光路位置対応にそれぞれ配置することで、
入射光の強度対応の輝度信号を得るものであり、これに
よって、波長域対応の輝度信号を得る撮像部を構成する
ようにしてある。

【０１３７】また、本実施の形態では、で構成された複
数系統用意された検出系（撮像部）１３０Ａ，〜１３０
Ｆは各々光電子増倍管３３、増幅器３４、Ａ／Ｄ変換器
３５を有しているが、それぞれの系統においては図１０
に示すように、Ａの系統では添え字ａを、Ｂの系統では
添え字ｂをと言った具合に、添え字を付しておく。図１
０の構成例は、Ａ〜Ｆまでの６系統（第１チャネル（CH
１）から第６チャネル（CH６））としたものである。

【０１３８】Ａ〜Ｆまでの６系統（CH１，〜CH６）の光
電子増倍管３３ａ，〜３３ｆにはそれぞれを区別して制
御できるようにするため、識別符号（ＩＤ）を付して管
理できるようにしてある。

【０１３９】検出系１３０はＡ〜Ｆまでの６系統分ある
ので、試料１１０からの光は上述したように分光して波
長域別に、対応する光電子増倍管３３ａ，〜３３ｆに入
射させるようにしている。すなわち、図１で説明したよ
うに、試料１１０からの光は、対物レンズ１０９、ダイ
クロイックミラー１０５、共焦点絞り１１２、コリメー
トレンズ１１３を介して検出系１３０に入射し、検出さ
れる仕組みであるが、コリメートレンズ１１３と検出系
１３０との間に、図９に示すように、例えば、プリズム
１１５（もちろん、プリズムに限るものではなく回折格
子などのような所望の分光手段で可）を設けて回折させ
ることで波長域別に分光させ、その各波長域別分光方向
に対応させて配置した各光電子増倍管３３ａ，〜３３ｆ
で、それぞれの波長域の光を検出する構成としてある。

【０１４０】すなわち、本実施の形態に示す例では、CH
１〜CH６の各系統は、試料１１０から導かれた光のう
ち、それぞれ対応する特定波長（特定スペクトル成分）
の光を受けて輝度信号に変換する構成となる。

【０１４１】また、コンピュータ３８Ａには、光電子増
倍管３３ａ，〜３３ｆの印加電圧を制御する際、各光電
子増倍管３３ａ，〜３３ｆに対して個別の印加電圧を設
定するために、光電子増倍管３３ａ，〜３３ｆに付与さ
れている個別の識別情報と印加電圧値の設定情報を含む
設定信号Ｐを出力する機能を持たせてある。

【０１４２】また、図示しないが、光電子増倍管３３
ａ，〜３３ｆには、識別情報（ＩＤ）が付与されて識別
可能になっており、また、アドレスデコーダとメモリと
が内蔵されていて、アドレス対応にメモリには設定電圧
情報（印加電圧のデータ）が書き込まれている。そし
て、指定されたアドレスより読み出された設定電圧情報
対応に電圧値が自動設定されてその設定された電圧値で
動作することで、その電圧値対応の増幅率で光電子増倍
管が駆動するようになっている。

【０１４３】すなわち、この実施形態における光電子増
倍管３３ａ，〜３３ｆは、コンピュータ３８Ａから出力
される識別情報を含む設定情報の信号である設定信号Ｐ
から識別符号が自己と認識した時に設定信号Ｐで定まる
印加電圧のデータに基づき印加電圧を設定する機能を有
する。

【０１４４】また、増幅器３４ａ，〜３４ｆはそれぞれ
CH１〜CH６用の増幅器であってそれぞれアドレスデコー
ダとメモリとが内蔵された増幅器であり、アドレス対応
にメモリには増幅率情報が書き込まれている。

【０１４５】そして、指定されたアドレスより読み出さ
れた増幅率情報対応に増幅率が自動設定されてその設定
された増幅率で増幅動作するようになっている。

【０１４６】増幅器３４ａ，〜３４ｆにはそれぞれ予め
識別情報（ＩＤ）が設定されており、コンピュータ３８
Ａから識別情報と増幅率設定情報を含んだ設定信号Ｐと
を与えることで、識別情報の一致する増幅器の増幅度が
設定可能である。

【０１４７】すなわち、増幅器３４ａ，〜３４ｆはコン
ピュータ３８Ａから出力される信号Ｑから識別信号を認
識して増幅率を設定する機能を有する。

【０１４８】演算部３６Ａは第１の実施の形態で説明し
た演算部３６を６系統分、すなわち、６チャネル分、内
蔵する構成であり、ＦＰＧＡなどのプログラマブルゲー
トアレイを用いて構成されていて、６チャネル分のＡ／
Ｄ変換器からの各画素の輝度データを同タイミングで並
列に処理できるようになっている。

【０１４９】さらに、演算部３６Ａは各チャネルの輝度
データについて、個別に平均化数を設定できるようにな
っており、どのチャネルを平均化数いくつで処理するか
の情報はコンピュータ３８Ａから出力される信号Ｒによ
って決定される仕組みである。演算部３６Ａは、６チャ
ネル分のそれぞれの平均化済みデータを、信号Ｏとして
Ｉ／Ｆ部３７Ａに出力する機能を有する。すなわち、Ｉ
／Ｆ部３７Ａは、演算部３６Ａが平均化して出力した６
チャネル分のデータ信号Ｏをシリアル変換及びコンピュ
ータ３８Ａが扱える信号形式ならびに信号タイミングに
変換して、コンピュータ３８Ａに出力するものであり、
コンピュータ３８Ａは、その信号Ｏから画像を生成して
モニタ画面に画像として表示する機能を有する。

【０１５０】以上のような構成の第２の実施の形態につ
いて、動作を具体的に説明する。

【０１５１】まず、ユーザはコンピュータ３８Ａによ
り、CH１〜CH６の各チャネルの光電子増倍管３３ａ，〜
３３ｆに対して所望の同一印加電圧値を選択設定する操
作をする。また、ユーザは増幅器３４ａ，〜３４ｆに対
して所望の同一増幅率を選択設定する操作をする。さら
にまたユーザはコンピュータ３８Ａを操作して、各チャ
ネルに対して同じ平均化数を設定する。

【０１５２】これにより、コンピュータ３８Ａからは、
光電子増倍管３３ａ，〜３３ｆに対する同じ印加電圧値
の設定信号と各光電子増倍管３３ａ，〜３３ｆをそれぞ
れ指定する識別情報が設定信号Ｐとして出力され、ま
た、各チャネルの増幅器３４ａ，〜３４ｆに対して、そ
れぞれ同じ増幅率を設定する設定信号と各増幅器３４
ａ，〜３４ｆそれぞれを指定する識別情報とが信号Ｑと
して出力される。

【０１５３】従って、設定信号Ｐを受けた光電子増倍管
３３ａ，〜３３ｆはぞれぞれ同じ印加電圧値に設定さ
れ、また、設定信号Ｑを受けた増幅器３４ａ，〜３４ｆ
は、それぞれ同じ増幅率に設定される。また、コンピュ
ータ３８Ａからの信号Ｒにより、演算部４８は各チャネ
ルに対して同じ平均化数に設定される。

【０１５４】複数種の試薬により染色処理された試料１
１０に対してレーザ光源１０１より発生させた複数種の
所望波長のレーザ光を対物レンズ１０９を介して照射
し、その際にガルバノミラー４３によって試料１１０上
のレーザ光を走査させることにより、その時々の試料１
１０上の照射位置から反射光または蛍光が発生する。こ
の発生する光は使用するレーザ光の波長や試薬の種類に
より波長が異なる。

【０１５５】この波長の異なる複数種の光は分光されて
波長対応の光電子増倍管３３ａ，〜３３ｆに入射され、
ここでそれぞれ入射光量対応に光電変換された後、対応
する増幅器３４ａ，〜３４ｆに入力されて増幅された
後、対応するＡ／Ｄ変換器３５ａ，〜３５ｆに入力され
てそれぞれデジタル変換され、演算部３６Ａでそれぞれ
チャネル別に平均化処理される。そして、平均化処理さ
れた各チャネル別のデータはＩ／Ｆ部３７Ａで信号処理
されてコンピュータ３８Ａに与えられ、コンピュータ３
８Ａはこのデータを用いて各チャネル別の画像を生成す
る。そして、コンピュータ３８Ａにおけるモニタ画面上
に試料画像として表示する。

【０１５６】このように、異なる複数種の試薬（蛍光試
薬）により染色した試料を観察する場合には、波長の異
なる複数種のレーザ光を同時に、照射させ、且つ、Ｘ−
Ｙ走査して試料の観察領域の各画素位置からの光を波長
域別の光電子増倍管で検出して波長域別の画素データを
同時に収集していく方式であるが、試料の観察領域全域
に対するレーザ光走査を終える毎に、或いは、画素位置
毎に、波長の異なる複数の励起光（レーザ光）を切り換
えて、試料１１０を走査する方式も考えられる。

【０１５７】このようにして、試料１１０からはその時
々のレーザ光走査位置上における対応した試薬からの反
射光（あるいは蛍光）が発生し、それぞれの波長域に対
応した光電子増倍管３３ａ，〜３３ｆによって光電変換
される。

【０１５８】しかし、蛍光試薬によって反射光（蛍光）
の強度に違いが有り、各波長毎に同じレーザ強度、同じ
増幅器の増幅率、同じ平均化数を用いた場合ではコンピ
ュータ３８Ａのモニタ画面上に表示される画像の明るさ
にチャネル間でアンバランスが生じることがある。つま
り、波長域の異なる画像間での明るさに差が生じること
がある。

【０１５９】このような場合、ユーザはコンピュータ３
８Ａを操作して、検出系１３０の持つ複数チャネルのう
ち、明るさの足りないチャネルの光電子増倍管と増幅器
の増幅度を大きくするように設定を変更する。

【０１６０】今、第１チャネル〜第６チャネル（CH１〜
CH６）のうち、第１チャネル目（CH１）の系統の明るさ
が不十分であるとするならば、ユーザは、コンピュータ
３８Ａを走査して第１チャネル目（CH１）である光電子
増倍管３３ａの印加電圧や増幅器３４ａの増幅率を増大
させるように設定する。

【０１６１】これにより、コンピュータ３８Ａからは第
１チャネル目（CH１）である光電子増倍管３３ａの印加
電圧や増幅器３４ａの増幅率を増大させるように設定信
号Ｐ，Ｑが出力され、これを受けた第１チャネル目（CH
１）では光電子増倍管３３ａがその印加電圧がその信号
Ｐ対応に増大され、増幅器３４ａではその信号Ｑ対応に
増幅率が増大される。

【０１６２】しかし、このままの状態では増幅度だけが
大きくなるので、光電子増倍管３３ａや増幅器３４ａか
ら発生するランダムノイズも大きくなり、その影響で画
像が不鮮明になってしまう。

【０１６３】そこで、ユーザはさらにコンピュータ３８
Ａを操作してそのチャネルの平均化数を増加させるよう
に設定し、ランダムノイズの影響を減少させるようにす
る。

【０１６４】これにより、処理・制御系１４０における
演算部３６Ａは、検出系１３０における第１チャネル
（CH１）用の増幅器３４ａの増幅出力をＡ／Ｄ変換して
出力するＡ／Ｄ変換器３５ａからのデジタル化された輝
度情報を、各画素に対して指示された回数分、サンプリ
ングして平均化処理して出力する。この平均化処理によ
り、ランダムノイズは平均化回数対応に抑制されること
になる。

【０１６５】そして、平均化処理された各チャネル別の
データはＩ／Ｆ部３７Ａで信号処理されてコンピュータ
３８Ａに与えられ、コンピュータ３８Ａはこのデータを
用いて当該第１チャネル（CH１）の画像を生成する。そ
して、コンピュータ３８Ａにおけるモニタ画面上に試料
の画像として表示する。

【０１６６】この作業を繰り返すことによって、コンピ
ュータ３８Ａのモニタ画面上に試料の明るく最適な画像
を表示させることができる。

【０１６７】以上、第２の実施形態に示したものは、レ
ーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料（標本）に集
束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を
走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光さ
せて検出系で検出することにより、波長別のデータを得
るようにしたレーザ走査型顕微鏡において、試料から出
射される光を検出して受光量に応じた信号を発生する検
出系の光電変換手段（光電変換素子）を複数系統とする
と共に、各系統別に増幅率可変とし、また、これら検出
系の各系統から出力される検出出力をそれぞれサンプリ
ングしてそれぞれ系統別に平均化処理して出力する演算
手段を設けると共に、この演算手段の各系統別出力を画
素データとして画像を生成する手段とを設け、前記増幅
度と前記サンプリング回数を所望に設定可能にしたもの
であり、生成画像の明るさが不足する場合には前記増幅
度を高く設定することで信号レベルをアップして明るさ
を確保するようにし、かつ、前記サンプリング回数を高
く設定することにより、増幅度アップにより生じるラン
ダムノイズの影響をサンプリング回数の増大と平均化処
理により、抑制するようにしたものである。

【０１６８】このような構成とすれば、複数系統の光電
変換手段に対してチャネル毎に試料からの反射光や蛍光
の強度が異なっていた場合に各チャネル毎（各系統毎）
に光電変換手段（例えば、光電子倍増管）や増幅器の増
幅率を変更しても、各チャネル個別に平均化数及びＡ／
Ｄ変換するサンプリング速度を変更できるので、各チャ
ネル間の画質を一定に調整することが可能となり、明る
い画質で、しかも、描画速度を落とすことなく画像生成
して観察可能となる。

【０１６９】また、画像を明るくするための手法はもっ
ぱら増幅率を増大させることでにより得る方式であるか
ら、レーザ光の強度上げて試料に照射する必要がなく、
従って、強力なレーザ光照射による試料の腿色や劣化、
変質をもたらす心配も無いと言う効果もある。

【０１７０】また、平均化処理はデジタル演算処理によ
り行う方式であり、アナログ処理系を用いていないた
め、アナログ処理系の抱える回路の温度依存性の影響と
云ったものは回避できるだけでなく、アナログ処理系の
抱える周波数特性も犠牲にすることが無いと言う効果も
ある。

【０１７１】なお、本発明は上述した実施形態に示す例
に限定されるものではなく、種々変形して実施可能であ
る。例えば、上記実施の形態では、共焦点型のレーザ走
査型顕微鏡について説明したが、多光子励起法のレーザ
走査型顕微鏡にも本発明の考え方は適用可能であること
は云うまでもない。

【０１７２】また、本発明において、上記実施形態には
種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構
成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽
出され得るものである。例えば、実施形態に示される全
構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が
解決しようとする課題の欄で述べた課題の少なくとも１
つが解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果の
少なくとも１つが得られる場合には、当該実施形態での
構成要件が一部削除された構成についても発明として成
立し得るものである。

【０１７３】

【発明の効果】以上、詳述したように、本発明によれ
ば、明るく良質の画像を観察することができるようにな
るレーザ走査型顕微鏡を提供できる。また、本発明によ
れば、レーザ光の強度を上げて試料に照射する必要がな
く、従って、試料の腿色や劣化、変質をもたらすことも
無いレーザ走査型顕微鏡を提供できる。

【０１７４】また、本発明によれば、波長の異なる複数
の励起光（レーザ光）によって試料上を走査した時に、
複数の光電変換手段に対してチャネル毎に試料からの反
射光や蛍光の強度が異なっていた場合に各チャネル毎に
光電子倍増管や増幅器の増幅率を変更しても、各チャネ
ル間の画質を一定にでき、明るく、描画速度を落とすこ
となく明るい良好な画像を描画できるようになるレーザ
走査型顕微鏡を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施形態におけるレーザ走査型
顕微鏡の構成例を説明するための図である。

【図２】本発明を説明するための図であって、本発明の
第１の実施の形態におけるレーザ走査型顕微鏡の持つ検
出系（撮影系）と処理・制御系部分の構成例を説明する
ための図である。

【図３】アドレス発生部４０の動作と波形メモリ４１の
読み出しによる波形データの関係を示すタイムチャート
である。

【図４】Ｄ／Ａ変換器４２にて変換されて得られる駆動
信号Ｊの波形例を示す図である。

【図５】Ｄ／Ａ変換器３５の動作例を説明するためのタ
イムチャートである。

【図６】クロック制御部３９の出力クロック例をせつめ
いするためのタイムチャートである。

【図７】演算部３６の内部構成例を示すブロック図であ
る。

【図８】演算部３６の動作例を説明するためのタイムチ
ャートである。

【図９】本発明の第２の実施形態におけるレーザ走査型
顕微鏡の構成例を説明するための図である。

【図１０】本発明の第２の実施形態におけるレーザ走査
型顕微鏡の持つ検出系（撮影系）と処理・制御系部分の
構成例を説明するための図である。

【図１１】従来技術を説明するための図である。

【図１２】従来技術を説明するための図である。

【図１３】従来技術を説明するための図である。

【符号の説明】

３３，３３ａ，３３ｂ，３３ｆ…光電子増倍管（光電変
換素子）、３４，３４ａ，３４ｂ，３４ｆ…増幅器、３
５，３５ａ，３５ｂ，３５ｆ…Ａ／Ｄ変換器、３６，３
６Ａ…演算部、３７，３７Ａ…Ｉ／Ｆ（インタフェー
ス）、３８，３８Ａ…コンピュータ（パソコン）、３９
…クロック制御部、 ４０…アドレス発生部、４１…波
形メモリ、 ４２…Ｄ／Ａ変換器、４３…ガルバノ
ミラー、 ４５…平均化手段、４６，４７…データ保持
器、１０１…レーザ光源、 １０２…レーザ光束、１０
３…ビームエキスパンダ、１０４…レーザラインフィル
タ、１０５…ダイクロイックミラー、１０６…Ｘ−Ｙ走
査光学系、１０７…瞳投影レンズ、 １０８…結像レン
ズ、１０９…対物レンズ、 １１０…試料、１１１…
共焦点レンズ、 １１２…共焦点絞り、１１５…プリズ
ム、 １１６…集光レンズ、１３０，１３Ａ，〜１
３０Ｆ…検出系、１４０…処理・制御系。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】レーザ光を観察対象の試料に集束させて照
   射させると共に前記レーザ光は試料に対して走査させ、
   試料から得られた光を光電変換手段により検出すること
   により前記走査の各位置毎の光検出出力を画素データと
   して得て前記試料の画像を得るようにしたレーザ走査型
   顕微鏡において、 サンプリング周期変更可能であって、前記走査の各位置
   毎に前記光電変換手段の光検出出力を、設定サンプリン
   グ周期対応にサンプリングする手段と、 このサンプリングされて得られた前記走査位置における
   光検出出力を平均化してその位置での画素データとする
   演算手段と、 所望の平均化数を設定するとその設定した数対応に前記
   サンプリング周期を変更する変更手段と、を具備するこ
   とを特長とするレーザ走査型顕微鏡。
2. 【請求項２】レーザ光を観察対象の試料に集束させて照
   射させると共に前記レーザ光は試料に対して走査させ、
   試料から得られた光を光電変換手段により検出すること
   により前記走査の各位置毎の光検出出力を画素データと
   して得て前記試料の画像を得るようにしたレーザ走査型
   顕微鏡において、 所望の増幅率および平均化数を設定する手段と、 前記光電変換手段の光検出出力を前記設定増幅率対応に
   増幅して出力する手段と、 この増幅された光検出出力をサンプリングするものであ
   って、前記走査の各位置毎に前記光検出出力を前記設定
   平均化数対応のサンプリング周期でサンプリングする手
   段と、 このサンプリングされて得られた前記走査位置における
   光検出出力を平均化してその位置での画素データとする
   演算手段と、を具備することを特長とするレーザ走査型
   顕微鏡。
3. 【請求項３】レーザ光を観察対象の試料に集束させて照
   射させると共に前記レーザ光は試料に対して走査させ、
   試料から得られた光を分光手段により分光させて光電変
   換手段により受光量に応じた光検出出力信号に変換させ
   ることにより、波長別のデータを得るようにしたレーザ
   走査型顕微鏡において、 前記光電変換手段は複数設けて複数系統構成とすると共
   に、また、 前記各系統別に所望の増幅率および平均化数を設定する
   手段と、 前記各系統別の光電変換手段の光検出出力信号を前記設
   定増幅率対応に増幅して出力する手段と、 この増幅された各系統別の光検出出力信号をそれぞれサ
   ンプリングするものであって、前記走査の各位置毎に前
   記光検出出力信号を前記設定平均化数対応のサンプリン
   グ周期でサンプリングする手段と、 このサンプリングされて得られた前記走査位置における
   前記各系統別光検出出力信号をそれぞれ系統別に平均化
   してその位置での画素データとする演算手段と、を具備
   することを特長とするレーザ走査型顕微鏡。