JP4564244B2 - レーザ走査型顕微鏡、レーザ走査型顕微鏡の制御方法、及びプログラム - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、走査型顕微鏡の技術に関し、特に、標本像を観察するための検出器の感度調整や、位置合わせのための技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レーザ走査型顕微鏡は、レーザ光源から得られるレーザ光を対物レンズで微小なスポット光に絞り、このスポット光で標本を走査したときの標本からの透過光や反射光を光検出器で捕らえて電気信号に変換し、この電気信号に対応する標本像を画像モニタ上に表示させる。このレーザ走査型顕微鏡において、観察標本の画像を取得するためには、まず通常の顕微鏡観察を実施して観察対象領域をおおまかに決定してからレーザ走査型顕微鏡観察を実施する。
【０００３】
レーザ走査型顕微鏡観察では、レーザ光を観察標本表面の走査領域にラスタスキャンし、このレーザ走査光に対して生じる観察標本の蛍光によって得られる観察標本領域の画像をモニタで確認しながら、光検出器の調整や、観察標本が載置されている顕微鏡ステージの位置の微調整を行って画像が鮮明になるようにする。
【０００４】
ところで、レーザ走査型顕微鏡でのレーザ光の走査は、レーザ光を連続的にラスタスキャンするために用いられているガルバノメータの特性上、あまり高速で走査することができない。そのため、レーザ走査型顕微鏡で画像を１枚取得するためには数秒の時間を要することになる。この画像の取得に要する時間を短縮するため、副走査方向（Ｙ方向）の走査ライン数を間引いて１画面あたりの主走査方向（Ｘ方向）の走査回数を減らすことがー般的に行われている。
【０００５】
しかし、この間引き走査を繰り返し行うときに観察標本表面における同じ位置のラインを繰り返して走査してしまうと、走査された部分には蛍光の褪色が生じる一方で走査されていない部分には褪色が生じず、図３に示すように、観察標本上に縞模様の褪色痕が生じるという問題が生じる。
【０００６】
この問題に対処するため、例えば特許文献１に開示されている技術では、レーザ光による観察標本表面の間引き走査を繰り返す度に、走査するライン位置を変えることが提案されている。
【０００７】
【特許文献１】
特開平９−５６３０号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述した特許文献１に開示されているように、間引き走査を繰り返す度に走査するライン位置を変えたとしても、この間引き分に相当する回数の走査を行わなければ、結局、観察領域全体に渡って均一な褪色を生じさせることはできず、観察標本上に縞模様の褪色痕が生じてしまうという問題を有していた。
【０００９】
本発明は上述した問題を鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、間引き走査を行って画像取得時間を短縮した場合に、走査ライン毎に蛍光の褪色の度合いが異なることなく観察領域全体に渡って均一な褪色が生じている観察標本画像を取得することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の態様のひとつであるレーザ走査型顕微鏡は、平面上に定義される第一の方向へのレーザ光の走査を行わせる走査手段と、当該レーザ光の照射径を変更する照射径変更手段と、当該レーザ光の走査を、当該平面上に定義される第二の方向に対して一定の間引き間隔で間引いて行わせる間引き走査の実行指示を取得する間引き走査実行指示取得手段と、当該間引き走査実行指示取得手段による当該間引き走査の実行指示の取得に応じて当該走査手段を制御して当該間引き走査を行わせる間引き走査実行制御手段と、を有しており、当該照射径変更手段が、当該間引き走査が行われるときには、当該レーザ光の観察標本体上でのスポット光径を、当該間引き間隔に基づいて変更することを特徴とするものである。
【００１１】
この構成によれば、間引き走査を行う場合に、照射径変更手段によってこの間引きの間隔に基づいてレーザ光の照射径を大きくすることにより、間引き走査を行ってもレーザ光が照射されない部分を無くすことができるので、この結果、取得される観察標本画像における褪色が観察領域全体に渡って均一なものとなる。
【００１２】
なお、上述した本発明に係るレーザ走査型顕微鏡において、レーザ光が照射された観察標本からの光を入射させると当該光の強度に応じた電気信号を出力する光電変換手段と、観察標本からの光の一部を透過させて光電変換手段に入射させるピンホールの径を、レーザ光の照射径に基づいて変更するピンホール径変更手段と、を更に有するように構成してもよい。
【００１３】
この構成によれば、レーザ光の照射径を大きくしたときに上述したピンホール径変更手段がこのピンホールの径を大きくすることにより、光電変換手段に入射する光量が多くなるので光電変換手段から出力される電気信号に基づいて生成される観察標本についての観察像が鮮明になる。
【００１４】
なお、このとき、レーザ光の強度を前述したピンホールの径に基づいて変更するレーザ光強度変更手段を更に有するように構成してもよい。
この構成によれば、このピンホールの径を大きくしたときにレーザ光強度変更手段がレーザ光の強度を低下させることにより、このレーザ光が照射されることによって観察標本で生じる褪色が少なくなり、褪色が観察標本に与える影響が低減される。
【００１５】
本発明の別の態様のひとつであるレーザ走査型顕微鏡の制御方法は、当該レーザ走査型顕微鏡が、平面上に定義される第一の方向へのレーザ光の走査を行わせる走査手段を有しており、当該制御方法が、当該レーザ光の走査を、当該平面上に定義される第二の方向に対して一定の間引き間隔で間引いて行わせる間引き走査の実行指示を取得し、当該間引き走査の実行指示の取得に応じて当該走査手段を制御して当該間引き走査を行わせ、当該間引き走査が行われるときの当該レーザ光の観察標本体上でのスポット光径を、当該間引間隔に基づいて変更するようにすることを特徴とするものである。
【００１６】
こうすることにより、前述した本発明に係るレーザ走査型顕微鏡と同様の作用効果を奏する。
なお、レーザ走査型顕微鏡の制御をコンピュータに行わせるためのプログラムであって、当該レーザ走査型顕微鏡が、平面上に定義される第一の方向へのレーザ光の走査を行わせる走査手段を有しており、当該プログラムが、当該レーザ光の走査を、当該平面上に定義される第二の方向に対して一定の間引き間隔で行わせる間引き走査の実行指示を取得する処理と、当該間引き走査の実行指示の取得に応じて当該走査手段を制御して当該間引き走査を行わせる処理と、当該間引き走査が行われるときに前記レーザ走査型顕微鏡へ指示を与えて、前記レーザ光の観察標本体上でのスポット光径を前記間引き間隔に基づいて得られるスポット光径へと変更させる処理と、をコンピュータに行わせることを特徴とするプログラムも本発明に係るものであり、このプログラムをコンピュータで実行させることによってなされたこれらの指示に従って当該レーザ走査型顕微鏡が動作すると前述した本発明に係るレーザ走査型顕微鏡と同様の作用効果を奏する結果、前述した課題が解決される。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
図１は、本発明を実施するレーザ走査型顕微鏡システムの構成を示している。
図１に示すように、本実施の形態に係るレーザ走査型顕微鏡システムは、レーザ走査型顕微鏡１００とコンピュータシステム２００とが接続インタフェース７で接続されて構成されている。
【００１８】
レーザ走査型顕微鏡１００のコントロールユニット１０は、コンピュータシステム２００から発せられる走査指示司令が入力されると、接続インタフェース７を介して走査制御信号を走査ユニット１１へ出力する。また、コントロールユニット１０は、レーザ光源２５、２６及び２７の各々に接続されており、走査に使用するレーザを選択する。なお、本実施形態においては、レーザ光源２５としてはアルゴン・レーザを使用し、レーザ光源２６としてはヘリウム・ネオン緑色レーザを、レーザ光源２７としてはヘリウム・ネオン赤色レーザを、それぞれ使用している。
【００１９】
走査ユニット１１には、コントロールユニット１０によって選択されたレーザ光源２５、２６、及び２７のうちのいずれかから出射したレーザ光が、ミラー２４と合成用ダイクロイックミラー２２及び２３とを経て集光され、更にミラー２１を経てスポット径調整部３０を経由し、分光フィルタ１２を通過して入射する。
【００２０】
走査ユニット１１ではコントロールユニット１０からの走査制御信号に従って主走査用のＸ走査ガルバノミラーと副走査用のＹ走査ガルバノミラーとが駆動する。このガルバノミラーの駆動によって、走査ユニット１１に入射したレーザ光は対物レンズ８を通過した後、ステージ９上に載置された観察標本３００上をスポット光としてＸＹ走査する。
【００２１】
ここで、スポット径調整部３０は、このスポット光の径（照射径）を調整するものであり、例えば、走査ユニット１１に入射させるレーザ光のビーム径を拡大させる可変倍率ビームエキスパンダやそのビーム径を絞り込む径可変絞り等を用いて構成することができる。
【００２２】
このようにして、スポット光を走査させることによって観察標本３００から得られる蛍光や反射光は上述したレーザ光の光路を逆行する。このうち、蛍光成分は分光フィルタ１２によって検出光路へと反射され、続いて分光フィルタ１３によって長波長のものと短波長のものとに波長分割される。これらの蛍光はその一方についてはピンホール１５を通過し、またそのもう一方についてはミラー１４を介してからピンホール１６を通過し、その後２つの光検出器１７及び１８で各々電気信号に変換されてコントロールユニット１０に入力される。
【００２３】
コントロールユニット１０は、光検出器１７及び１８の各々から入力される電気信号に対応する観察標本３００の蛍光画像を表現している情報（画像データ）をコンピュータシステム２００へ転送する。
コンピュータシステム２００は、これらの画像データを記憶媒体３に格納するとともに、これらの画像データで表現されている画像をモニタ１に表示させる。
【００２４】
なお、コンピュータシステム２００の記憶媒体３は、前述したスポット光の走査法についての設定を記憶するための記憶領域と、上述した画像データを記憶するための記憶領域が確保されている。
また、コンピュータシステム２００では、記憶媒体３に更に格納されている制御プログラムが実行される。この制御プログラムは、以下に説明するレーザ走査型顕微鏡１００の制御や画像データの保存などの処理をコンピュータシステム２００に行わせるものである。
【００２５】
次に、上述の如く構成されたレーザ走査型顕微鏡システムで観察標本３００の画像を取得する手順を説明する。
まず、観察者は、ステージ９を操作しながら通常の顕微鏡観察で観察標本３００の画像の合焦をおおまかに行う。その後、観察者はキーボード４やマウス５等を操作して、像探し走査処理の実行をコンピュータシステム２００に対して指示する。
【００２６】
像探し走査処理の実行が指示されるとコンピュータシステム２００の有する不図示のＣＰＵ（中央演算装置）は前述した制御プログラムの実行を開始する。すると、コンピュータシステム２００では、間引き走査の指示に係る副走査方向の走査間隔の指示に応じ、レーザ光源２５、２６、及び２７の各々のうち選択されるものから出射されるレーザ光について、その走査間隔に対応するスポット径（照射径）の設定値データを記憶媒体３から読み出す処理がまず行われる。
【００２７】
次に、コンピュータシステム２００では、コントロールユニット１０に指示を送り、この読み出されたデータに示されているスポット径の設定値をスポット径調整部３０へ設定させる処理が行われる。
このスポット径の設定処理が完了した旨の通知をコントロールユニット１０から受け取ると、続いてコンピュータシステム２００では、コントロールユニット１０に間引き走査の開始指示を送って前述した観察標本３００の蛍光画像を取得させる処理が行われる。コントロールユニット１０は、この指示を受け取ると、副走査方向に対して一定の間隔で主走査方向のレーザ光の走査を繰り返す間引き走査が開始され、画像の取得処理が行われる。
【００２８】
この蛍光画像の取得が完了して画像データをコントロールユニット１０から受け取ったときには、コンピュータシステム２００では、受け取った画像データで表現されている蛍光画像をモニタ１に表示させる処理が行われる。
コンピュータシステム２００では、以上の像探し走査処理を繰り返し実行する。
【００２９】
観察者は、以上のようにしてモニタ１に表示される蛍光画像に基づいて、ステージ９に対する観察位置の微調整や、検出器１７及び１８の感度の調整を行い、所望の画像が得られたところで、像探し走査処理の終了をコンピュータシステム２００に指示する。
【００３０】
すると、コンピュータシステム２００はコントロールユニット１０に指示を送り、スポット径調整部３０に対するスポット系の設定を、像探し走査処理の実行前のスポット径、すなわち間引き走査ではない精細な走査を行う場合におけるスポット径へ戻させる処理が行われる。なお、このときのスポット径は、副走査方向に間引きのない、密な走査を行うためのものであるから、レーザ走査型顕微鏡によって取得される画像における１画素分に相当するスポット径とすることが望ましい。
【００３１】
このスポット径の設定処理が完了した旨の通知をコントロールユニット１０から受け取ると、コンピュータシステム２００は像探し走査処理の実行を終了させる。
以上のように、本実施形態によれば、標本に対する間引き走査を実行するときには、標本に照射されるレーザスポット径を拡大してスポット光が照射されない部分を無くすことにより、図２に示すように、観察領域全体に渡って均一な褪色が生じている観察標本画像を取得することができる。
【００３２】
なお、上述した像探し走査処理において、間引き走査における間引き間隔に対応したレーザスポット径がスポット径調整部３０へ設定されるときに、コンピュータシステム２００がコントロールユニット１０に指示を送り、予め記憶媒体３にそのスポット径に対応付けられて記憶されているピンホール１５及び１６の径を大きくさせる処理が行われるようにし、この設定が完了したときに、コンピュータシステム２００がコントロールユニット１０に走査開始指示を送って前述した観察標本３００の蛍光画像を取得させる処理が行われるようにしてもよい。
【００３３】
照射されるレーザのスポット径を前述したようにして大きくしたことにより、ピンホール１５及び１６の各々には観察標本３００上の走査ポイントの周辺部で生じる蛍光も到来するので、このようにしてピンホール１５及び１６の径を拡大させることにより、より明るい観察標本画像が取得でき、調整作業の効率が向上する。
【００３４】
なお、ピンホール１５及び１６の径を拡大して行われた像探し走査の終了時には、コンピュータシステム２００はコントロールユニット１０に指示を送り、ピンホール１５及び１６の径の設定を、像探し走査処理の実行前の径、すなわち間引き走査ではない精細な走査を行う場合におけるピンホール径へ戻させる処理が行われるようにする。
【００３５】
また、このとき、ピンホール径を拡大させることによる検出光の増大を見越し、像探し走査処理の実行の際には、ピンホール１５及び１６の径の変更に併せ、観察標本３００に照射するレーザ光の強度を低下させた上で観察標本画像の取得をレーザ走査型顕微鏡１００に行わせるようにすることもできる。
【００３６】
このためには、例えば、図１に示す構成において、レーザ光の強度を低下（減光）させるレーザ光調光部を、合成用ダイクロイックミラー２２からミラー２１へのレーザ光の光路の途中に設けるようにし、このレーザ光調光部で、レーザ光の強度を例えばＳ₀ ／Ｓ倍に低下させる（但し、Ｓ₀ は元のピンホールの面積、Ｓは径を拡大したときのピンホールの面積）ようにすればよい。
【００３７】
こうすることにより、観察標本３００に照射されるレーザ光が弱まるので、レーザ光の照射によって生じる褪色を少なくすることが可能となる。
なお、上述したレーザ光のスポット径の変更を、像探し走査時のみならず、通常の精細な走査を行う際にも実施することにより、観察標本画像の取得のために必要な部分のみにレーザ光を照射させるようにすることもできる。こうすることにより、通常の走査においてもレーザ光の照射によって生じる褪色を少なくすることが可能となる。
【００３８】
その他、本発明は、上述した実施形態に限定されることなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良・変更が可能である。
（付記） 前記照射径変更手段が前記レーザ光の照射径を変更し、当該レーザ走査型顕微鏡によって取得される画像に表される当該レーザ光についてのスポット光を当該画像における１画素分の大きさとしたときには、前記走査手段は、前記間隔を当該照射径に一致させて当該レーザ光の走査を行わせることを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明は、平面上に定義される第一の方向へのレーザ光の走査を当該平面上に定義される第二の方向に対して一定の間引き間隔で間引いて行わせるときの当該レーザ光の観察標本体上でのスポット光径を、当該間引き間隔に基づいて変更するようにする。
【００４０】
こうすることにより、間引き走査を行っても、取得される観察標本画像における褪色が観察領域全体に渡って均一なものとなる効果を本発明は奏するので、観察標本の最適な画像を得るための光検出器の感度調整、及び標本の位置合わせを、迅速かつ、容易に実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を実施するレーザ走査型顕微鏡システムの構成を示す図である。
【図２】観察領域全体に渡って均一な褪色が生じている観察標本画像の例を示す図である。
【図３】従来技術の間引き走査を行ったときに観察標本に生じる褪色痕の例を示す図である。
【符号の説明】
１ モニタ
２ ＣＰＵ
３ 記憶媒体
４ キーボード
５ マウス
７ 接続インタフェース
８ 対物レンズ
９ ステージ
１０ コントロールユニット
１１ 走査ユニット
１２、１３ 分光フィルタ
１４、２１、２４ ミラー
１５、１６ ピンホール
１７、１８ 光検出器
２２、２３ 合成用ダイクロイックミラー
２５ レーザ光源（アルゴン・レーザ）
２６ レーザ光源（ヘリウム・ネオン緑色レーザ）
２７ レーザ光源（ヘリウム・ネオン赤色レーザ）
１００ レーザ走査型顕微鏡
２００ コンピュータシステム
３００ 観察標本

Claims (5)

1. 平面上に定義される第一の方向へのレーザ光の走査を行わせる走査手段と、
   前記レーザ光の照射径を変更する照射径変更手段と、
   前記レーザ光の走査を、前記平面上に定義される第二の方向に対して一定の間引き間隔で間引いて行わせる間引き走査の実行指示を取得する間引き走査実行指示取得手段と、
   前記間引き走査実行指示取得手段による前記間引き走査の実行指示の取得に応じて前記走査手段を制御して前記間引き走査を行わせる間引き走査実行制御手段と、
   を有しており、
   前記照射径変更手段は、前記間引き走査が行われるときには、前記レーザ光の観察標本体上でのスポット光径を、前記間引き間隔に基づいて変更する、
   ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
2. 前記レーザ光が照射された観察標本からの光を入射させると当該光の強度に応じた電気信号を出力する光電変換手段と、
   前記観察標本からの光の一部を透過させて前記光電変換手段に入射させるピンホールの径を、前記照射径に基づいて変更するピンホール径変更手段と、
   を更に有することを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
3. 前記レーザ光の強度を前記ピンホールの径に基づいて変更するレーザ光強度変更手段を更に有することを特徴とする請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
4. レーザ走査型顕微鏡の制御方法であって、
   前記レーザ走査型顕微鏡は、平面上に定義される第一の方向へのレーザ光の走査を行わせる走査手段を有しており、
   前記制御方法は、
   前記レーザ光の走査を、前記平面上に定義される第二の方向に対して一定の間引き間隔で間引いて行わせる間引き走査の実行指示を取得し、
   前記間引き走査の実行指示の取得に応じて前記走査手段を制御して前記間引き走査を行わせ、
   前記間引き走査が行われるときの当該レーザ光の観察標本体上でのスポット光径を、前記間引き間隔に基づいて変更する、
   ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡の制御方法。
5. レーザ走査型顕微鏡の制御をコンピュータに行わせるためのプログラムであって、
   前記レーザ走査型顕微鏡は、平面上に定義される第一の方向へのレーザ光の走査を行わせる走査手段を有しており、
   前記プログラムは、
   前記レーザ光の走査を、前記平面上に定義される第二の方向に対して一定の間引き間隔で行わせる間引き走査の実行指示を取得する処理と、
   前記間引き走査の実行指示の取得に応じて前記走査手段を制御して前記間引き走査を行わせる処理と、
   前記間引き走査が行われるときに前記レーザ走査型顕微鏡へ指示を与えて、前記レーザ光の観察標本体上でのスポット光径を前記間引き間隔に基づいて得られるスポット光径に変更させる処理と、
   をコンピュータに行わせる、
   ことを特徴とするプログラム。

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